结晶抗体的组合物和方法

专利名称：结晶抗体的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于结晶抗体，包括抗体片段的组合物和方法，以及其用途。在一个实 施方式中，本发明涉及在工业规模上结晶抗体片段，例如抗人类肿瘤坏死因子a (hTNFa) 抗体片段的方法，以及控制抗体和抗体片段晶体的大小的方法。
背景技术：
有超过100种单克隆抗体当前在2或3期临床研究中被评估，单克隆抗体(mAb) 市场被认为是最有前景的生物药市场之一。由于这些药物将要以通常超过lOOmg的单次剂 量递送给患者，急需找到满足稳定性和安全性需求以及患者顺应性的适合的制剂。高度浓缩的液体mAb制剂具有比更低浓缩的制剂更高的粘度，其可能阻碍它们通 过更为亲近患者的高规格针头的可注射性。此外，mAb分子聚集的倾向随着提高的浓度指 数性地提高，妨碍了关于安全性和稳定性需求的顺应性。高mAb剂量的递送因而限于大的 体积，其一般必需通过输注来递送。然而，这种给药方式是花费密集的，显著地降低了患者 顺应性。为此，晶体形式的mAb对于药物物质的用途是期望的。然而，由于与结晶条件相关 的公知的不可预测性，进行了很少的尝试来评估这种策略。虽然蛋白质胰岛素已经被成功 地结晶，大多数其他蛋白质倾向于形成无序的沉淀而不是晶体。确定特定蛋白质的结晶条 件因而不是轻而易举的任务。迄今为止，没有一般规则来容许人们可靠地预测所选蛋白质 的成功结晶条件。几种筛选系统是商业上可获得的(例如，Hampton 1和2和WizardI和II)，其容许 在微升级别上筛选特定蛋白质的潜在适合的结晶条件。然而，使用这样的筛选系统获得的 阳性结果不必然能转变为在更大的、工业可应用的批量规模上成功的结晶(参见Jen，A.等 人(2001)Pharm. Res. 18(11) :1483)。Baldock 等人((1996) J. Crystal Growth, 168(1-4) :170_174)报道了用于结晶条 件的初步筛选的微批量和蒸气扩散的比较。使用一组结晶溶液筛选了六种商业上可获得的 蛋白质。使用常见的蒸气扩散方法和微批量结晶方法的三种变体进行了筛选。在所鉴定的 58种结晶条件中，43种(74%)由微批量鉴定出，而41种(71%)由蒸气扩散鉴定出。通 过两种方法鉴定出26种条件，如果根本不使用微批量，将错过17种(29% )。这些数据显 示了在起始结晶筛中最常使用的蒸气扩散技术不能保证阳性结果。因而，各种蛋白质的结晶不能使用预定的方法或算法成功地进行。当然，过去 20-30年来技术发展了。例如，A.McPherSOn提供了关于大分子结晶的趋性、策略、试剂 和设备的广泛的详细描述。然而，他没有提供一种方法，来确保本领域技术人员以合理 的成功期望实际地结晶任何给定大分子。McPherson声称，例如“为了鼓舞或促进分子
8之间的特异性结合相互作用和在一旦它们形成时稳定它们，无论过程如何，在精炼和优 化系统、溶剂和溶质的参数方面无法免除努力。难题的后一方面一般取决于要结晶的 特定蛋白质或核酸的具体的化学和物理性质。”(McPherson，A. (1999)Crystallization of BioloRicalMacromolecules.Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring HarborLaboratory Press,p. 159)。蛋白质结晶领域的技术人员广泛接受的是，对于处理新 的目标蛋白质、应用具体的过程步骤和从而获得期望的晶体，没有一种算法是可靠的。由于分子的柔性，抗体特别难以结晶。然而，免疫球蛋白晶体的实例确实存 在，例如Bence Jones蛋白，其是异常的Ig轻链二聚体的晶体(Jones, H. B. (1848) Philosophical Transactions of the RoyalSociety. London. 138 :55_62)。此夕卜，Ig 重 链寡聚体的晶体(von Bonsdorf, B.，H. Groth,等人(1938). Folia Haematoloaia 59 184-208)和正常结构的人免疫球蛋白(与两个轻链连接的两个重链)的晶体也已经被描 述(Putnam，F. ff. (1955) Science 122 :275_7 Terry, ff. D.，等人(1968) Nature 220(164) 239-41 ；Huber, R.，等人(1976). Nature 264(5585) :415_20 ；Ra-jan, S. S.，等人(1983) Mol.Immunol. 20(7) 787-99 ；Harris, L J.,等人(1992)Nature)360(6402) :369_72， Nisonoff, A.，等人(1968) Cold SprinR Harbor Symposia on Quant. Biol. 32 :89_93 ； Connell. G. E.，等人(1973)Canad. T. Biochem. 51 (8) :1137_41 ；Mills, L E.，等人(1983) Annals of Int. Med. 99(5) 601-4 ；and Jentoft, J. E.,等人(1982) Biochem. 21(2) 289-294。例如，Margolin和同事报道了，治疗性单克隆抗体trastuzumab (Here印tin ) 可以被结晶(Shenoy，Govardhan等人2002)，晶体trastuzumab悬浮液在小鼠肿瘤模型中是 治疗有效的，因而展现了晶体trastuzumab的生物学活性的保留(Yang，M. X.，等人(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100(12) :6934_6939)。然而，没有描述形成同质性抗体晶体制品的可 预测的和可靠的方法。W0-A-02/072636 公开了完全整体的抗体 Rituxi-mab、Infliximab 和 Trastuzumab 的结晶。大多数结晶实验使用具有不清楚的毒性的化学物质进行，例如，咪唑、2-环己 基_乙烷磺酸盐(CHES)、甲基戊二醇、硫酸铜和2-吗啉-乙烷磺酸盐(MES)。该申请的许 多实施例中使用了晶种来启动结晶。人类TNFa (hTNF a )被认为是许多疾病的致病因素。因而，对于治疗hTNFa相关 的病症的适合的方法存在很大的需求。一种有前途的治疗方法是施用药学上有效剂量的抗 人类TNFa抗体。近来，称为D2E7、或一般称为Adalimumab 的一种这样的抗体正在以商 品名 HUMIRA (Abbott Laboratories)出售。W0-A-2004/009776 公开了使用直滴蒸气扩散(sitting drop vapordiffusion) 技术在微升级别上的结晶实验，其涉及混合等分体积(1PL)的不同结晶缓冲液和D2E7 F(ab)’ 2或Fab片段。没有公开D2E7抗体或其片段的大小控制的结晶的方法。EP-A-0 260 610公开了鼠抗-hTNF a单克隆抗体的s系列，S卩，中和抗体AM-195， 也称为MAK195，由保藏为ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生。MAK195(例如，MAK195F) 的F(ab，)2片段也称为Afelimomab 。没有公开MAK195的晶体和MAK195F的晶体。这些 抗体的批量接近迄今为止没有成功。目前，没有提供抗-hTNF a抗体片段晶体的生产的可获得的技术教导。此外，没有 教导提供抗体分子、包括抗体片段，例如抗-hTNF a抗体的片段的大小控制的结晶。
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因而，对于抗体和抗体片段，例如抗-hTNF a抗体和抗体片段的适合的结晶条件， 特别是批量结晶条件，以及建立用于产生适合于工业生产的晶体体积的结晶过程条件存在 着需求。对于不使用可能不利地影响这些抗体的药物可用性的毒性试剂的结晶方法也存在 着需求。对于容许晶体大小的选择和控制的、抗体或抗体片段，例如Fab或F(ab’)2片段的 结晶方法，仍然存在着另外的需求。发明概述令人惊讶地，通过本发明解决了上述难题，本发明提供了结晶方法和由此产生的 晶体以及它们的用途。在一个方面，本发明提供了用于期望的平均均勻粒度范围的抗体或抗体片段晶体 的大小控制制备的方法，通过在允许抗体或抗体片段晶体的形成的条件下提供包含抗体或 抗体片段和至少一种结晶试剂的水性结晶混合物、在控制的条件下搅拌所述结晶混合物， 从而形成处于期望的平均大小范围内、优选的基本上一致的抗体或抗体片段晶体。所述控制的条件有几种实施方式，其可以单独地或以任何组合或顺序一起地使 用。在一个实施方式中，所述控制的条件包括以约1到约200rpm范围内的速度在滚筒容器 (roller container)中搅拌结晶混合物或相当于结晶混合物的搅拌。在另一个实施方式 中，所述控制的条件包括在具有约2到约100cm直径的滚筒容器中搅拌结晶混合物或相当 于结晶混合物的搅拌。在另一个实施方式中，所述控制的条件相当于在滚筒容器中结晶混 合物的搅拌，或包含搅拌结晶混合物，其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约100%填充 了所述结晶混合物。在又一个实施方式中，所述控制的条件相当于在滚筒容器中结晶混合 物的搅拌或包含搅拌结晶混合物约30分钟到约20天。在又一个实施方式中，所述控制的 条件相当于在约-15到约+50°C范围的温度下在滚筒容器中结晶混合物的搅拌或包含搅拌 结晶混合物。本发明的方法的搅拌步骤可以包括在相当于滚动的条件下滚动、搅拌、摇动和 /或翻滚结晶混合物。任何数量的上述条件可以以任何顺序组合。在另一个方面，本发明的方法提供了抗体或抗体片段晶体的小规模和大规模生 产，所述晶体包含直径和/或长度在约1到约lOOOym范围内的均勻晶体颗粒。在另一个 实施方式中，所述晶体包括在约1到约200 ym范围内的控制的平均晶体颗粒长度。根据进 一步的实施方式，本发明是上述结晶方法还可以这样进行，从而在步骤a)中获得的结晶混 合物可以补充合适数量的预先存在的抗体或抗体片段晶体作为晶种以启动或强化结晶。在一个实施方式中，被结晶的抗体是任何类型或种类的完整抗体，或其抗体片段。 在一个实施方式中，所述抗体片段是IgG抗体，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体的片段。 所述抗体片段可以是例如，嵌合或非嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、双可变域免疫 球蛋白(DVD-Ig )、非糖基化的抗体、人类抗体和非人类抗体如小鼠抗体的多克隆抗体片段 或单克隆抗体片段。在特定的实施方式中，要结晶的抗体是非嵌合的人类抗体，任选地被进 一步加工以改善抗原结合，或其片段。在一个实施方式中，所述抗体片段是抗-hTNF a抗体结合片段。在特定的实施方 式中，所述抗体片段是Fab或F(ab，)2片段，例如，MAK195F、具有保藏编号ECACC 87050801 的杂交瘤细胞系产生的抗体MAK195的F(ab’)2片段。在另一个方面，本发明提供了结晶抗-hTNFa抗体或抗体结合片段的批量结晶方 法，通过提供包含抗体或抗体片段(例如，溶解的形式)和至少一种聚亚烷基多元醇，例如聚亚烷基二醇作为结晶试剂的水性结晶混合物，并孵育所述水性结晶混合物直到形成所述 抗体或抗体片段的晶体，其中所述聚亚烷基二醇在(a) —个步骤或(b)超过一个步骤中提 供，其中在步骤中形成的抗体晶体在下一个步骤之前不被移除。在另一个实施方式中，所述水性结晶混合物的pH值在约pH 4到约6. 5、特别是约 4. 5到约6. 0、或约4. 8到约5. 6、或约5. 0到约5. 4的范围内，例如约5. 1、约5. 2或约5. 3。 上文所列的结晶混合物通常通过向蛋白质溶液中添加溶液中的或作为固体的结晶试剂来 获得。两种溶液可以是，但不必须是，缓冲的。初始结晶溶液中的结晶试剂浓度和缓冲液摩 尔浓度通常高于结晶混合物中的，因为当添加蛋白质溶液时它被稀释。在一个实施方式中， 是水性结晶混合物可以含有至少一种缓冲液。所述缓冲液可以包含，例如，乙酸盐和/或柠 檬酸盐成分，或其碱金属盐，例如，钠或钾盐，例如乙酸钠和/或柠檬酸钠。所述盐通过添加 酸，例如乙酸或柠檬酸调节至所需的pH值。在结晶方法的实施方式中，在水性结晶混合物中所述缓冲液浓度(总乙酸盐或总 柠檬酸盐)是约0到约0. 5M，或约0. 02到约0. 5M，例如约0. 05到约0. 3M，约0. 07到约 0. 2M 或约 0. 09 到约 0. 16M。在一个实施方式中，所述聚亚烷基二醇具有约400到约10，000g/mol的平均分子 量。例如，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)，以总体积约5到约30% (w/v)范围的终浓 度存在于所述结晶混合物中。在另一个实施方式中，满足至少一种以下的另外的结晶条件(1)孵育进行约1小 时到约250天，或约1天到约250天、或约13天到约250天，例如，约1天到约30天，或约 2天到约10天；(2)孵育在约-15°C到约+50°C，例如约4°C到约37°C或约15°C到约25°C之 间的温度下进行；和(3)所述结晶混合物包含在约0. 5到约280mg/ml，或约1到200mg/ml 或约1到约100mg/ml，例如约1. 5到约20mg/ml的范围内，特别是约2到约15mg/ml、或约2 到约7mg/ml的的范围内的浓度的抗体或抗体片段。所述蛋白质浓度可以根据用于蛋白质 测定的标准方法，例如，通过在适合的波长下，例如280nm下的光密度的测量来测定。在另一个实施方式中，本发明的方法包含干燥所产生的晶体的步骤。适合的干燥 方法包括蒸发干燥、喷雾干燥、冻干、真空干燥、流化床干燥、喷雾冷冻干燥、近临界干燥、超 临界干燥和氮气干燥。在进一步的实施方式中，本发明的结晶方法进一步包括交换所述结晶母液与不同 的液体或缓冲液，例如，含有至少一种不同于用于结晶的聚亚烷基多元醇、具有约300到 约8，000道尔顿范围内的摩尔质量的聚亚烷基多元醇的液体或缓冲液，或在此列出的其他 (聚合的)载体、脂质载体、或油性载体，例如，通过离心、渗滤、超滤或其他通常使用的缓冲 液交换技术。不同的液体或缓冲液可以称为“人工母液”，其不同于晶体的“天然的”结晶母 液，并且防止形成的晶体的溶解。mAb晶体制剂中的某些赋形剂具有阻碍晶体溶解的主要功 能。这样，聚乙二醇可以在最终组合物中被替代。在优选的实施方式中，进行所述批量结晶方法，例如，使用PEG作为结晶试剂的， 从而孵育在约3到约10mg/ml的抗体浓度下在约20°C的温度下进行约3天到约60天。在本发明的特定的实施方式中，在两个或更多个步骤中分步地添加聚亚烷基二 醇，例如，在2、3、4、5、6、7、8、9或10个步骤中。令人惊讶地，通过这种分步添加的方法，抗 体或抗体片段晶体的总回收率可以被进一步提高，而基本上没有非期望的无定形蛋白质聚
11集物或沉淀的并发形成。根据另一个实施方式，批量结晶在以下结晶混合物条件下进行(1)聚亚烷基二 醇:PEG 4000，约8到约12% (w/v) (2)缓冲液乙酸钠或柠檬酸钠，约0到约0. 3M(总乙 酸盐或柠檬酸盐)；(3)pH值(终)约5.0到约5.4;(4)抗-hTNFa片段浓度约3到约 10mg/ml ； (5)温度约18到约24°C; (6)批量体积约1到约1001 ； (7)搅拌无；或约1到 约lOOrpm ； (8)持续时间约1到约60天。在一个实施方式中，本发明提供了结晶抗-hTNFa抗体或抗体结合片段的批量结 晶方法，通过提供包含抗体或抗体片段和至少一种聚亚烷基二醇作为结晶试剂的水性结晶 混合物；孵育所述水性结晶混合物直到形成所述抗体或抗体片段的晶体；其中所述至少一 种聚亚烷基二醇在(a) —个步骤或(b)超过一个步骤中提供，其中在步骤中形成的抗体晶 体在后续步骤之前或期间不被移除，和其中所述结晶在晶体大小控制的条件下进行。所述控制的条件可以包含任何组合的一种或更多种控制的条件。在一个实施方式 中，所述控制的条件以约1到约200rpm范围内的速度在滚筒容器中相当于结晶混合物的搅 拌包包括搅拌结晶混合物。在另一个实施方式中，所述控制的条件在具有约2到约100cm 直径的滚筒容器中相当于或包含搅拌结晶混合物。在又一个实施方式中，所述控制的条件 相当于或包括在滚筒容器中搅拌结晶混合物，其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约 100%填充了所述结晶混合物。在又一个实施方式中中，所述控制的条件相当于或包括在滚 筒容器中搅拌结晶混合物，其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约100%填充了所述结 晶混合物。在再另一个实施方式中，所述控制的条件相当于或包括在滚筒容器中搅拌结晶 混合物约30分钟到约20天，或在约-15°C到约+50°C范围内的温度下在滚筒容器中。搅拌 步骤可以相当于或包括结晶混合物的滚动、搅拌、摇动和/或翻滚。在另一个方面，本发明提供了抗-hTNFa抗体或抗体片段的晶体，如通过在此定 义的任何方法所制备的。在一个实施方式中，所述晶体具有针的形状。例如，本发明的晶体可以以针状的形 态为特征，最大长度(1)约2到约500 u m或约100到约300 y m，长度/直径(1/d)为约1 到约100。这样的针状晶体的高大致地在直径的尺度上。在另一个方面，本发明提供了药物组合物，包含(a)根据在此定义的方法制备的 抗体或抗体片段的晶体；和(b)稳定地维持所述抗体晶体的至少一种药物赋形剂；其中所 述组合物作为固体、半固体或液体制剂提供。在另一个实施方式中，本发明提供了药物组合 物，包含(a)根据本发明的方法制备的抗体的晶体，和(b)至少一种药物赋形剂，其中所述 赋形剂包埋或密封所述晶体。在另一个实施方式中，所述抗体以大于约lmg/ml的浓度存在。在特定的实施方式 中，所述抗体以大于约200mg/ml，例如约200到约600mg/ml，或约300到约500mg/ml的浓 度存在。在另一个实施方式中，所述药物组合物是包含约0. 1到约9.9% (w/w)的抗体晶体 的固体。在一个实施方式中，所述赋形剂包含至少一种聚合的生物可降解的或非生物可降 解的载体和/或至少一种油或脂质载体，包括其组合物或共混物以及其聚合物。示范性的聚合载体包含选自以下构成的组的至少一种聚合物聚(丙烯酸)、聚 (氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)或PLGA、聚(日-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己酮)、 聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(羟基丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷腈、聚(原酸酯)、 聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、 藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖和多糖、羟乙基 淀粉、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其共混物和共聚物，以及SAIB。脂质载体包括脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪族胺、脂肪酸的甘油单酯、二酯和 三酯、磷脂、糖脂、固醇和蜡以及相关的类似物质。蜡被进一步分类为天然的和合成的产物。 天然的材料包括从植物、动物或矿物质来源获得的蜡，例如蜂蜡、棕榈蜡或褐煤蜡。氯化的 萘和乙烯聚合物是合成蜡产物的实例。油(或油状液体)载体包括油(或油状液体)例如，油质的杏仁油、玉米油、棉花子 油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、十二醇、橄榄油、花生 油、杏仁油、芝麻油、豆油、鲨烷、液体甘油三酯、多聚羟乙基化的蓖麻油、液体蜡和高级醇。 赋形剂仍然主要连接到载体(封装/包埋)脂质载体包括脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪族胺、脂肪酸的甘油单酯、二酯和 三酯、磷脂、糖脂、固醇和蜡以及相关的类似物质。蜡被进一步分类为天然的和合成的产物。 天然的材料包括从植物、动物或矿物质来源获得的蜡，例如蜂蜡、棕榈蜡或褐煤蜡。氯化的 萘和乙烯聚合物是合成蜡产物的实例。油(或油状液体)载体包括油(或油状液体)例如，油质的杏仁油、玉米油、棉花 子油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、十二醇、橄榄油、花 生油、杏仁油、芝麻油、豆油、鲨烷、液体甘油三酯、液体蜡和高级醇。在另一个方面，本发明提供了可注射的液体组合物，其包含可通过本发明的方法 获得的抗体或抗体片段晶体，其中所述抗体或抗体片段以约10到约400mg/ml、或约50到约 300mg/ml的范围内，例如约200mg/ml的浓度存在。在另一个方面，本发明提供了晶体浆液组合物，其包含可通过本发明的方法获得 的抗体或抗体片段晶体，其中所述抗体或抗体片段以大于约100mg/ml，例如约150到约 600mg/ml、或约200到约400mg/ml的浓度存在。在另一个方面，本发明提供了治疗哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有 效量的可通过本发明的方法获得的抗体晶体或组合物的步骤。施用晶体和其组合物的方法 可以包括，但不限于，通过胃肠外的途径、通过口服途径、通过吸入、通过注射或它们的组合 来施用。在特定的实施方式中，本发明提供了在个体中治疗hTNFa相关的病症的方法，包 括向所述个体施用治疗有效量的抗体晶体。在另一个方面，本发明提供了本发明的抗-hTNF a抗体晶体用于制备治疗hTNF a 相关疾病的药物组合物的用途。本发明还提供了用于药物的上文定义的hTNF a抗体片段晶体。附图的简要描述本发明的上述和其他目的、特征和优点以及本发明本身，根据以下优选的实施方 式的描述，与相伴的附图一起阅读时，将被更完全地理解，在附图中附

图1显示了在不同的滚转速度下作为时间的函数的MAK195F晶体的产率。
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附图2显示了在不同的滚转速度下获得的MAK195F晶体的显微镜图像。附图3显示了滚转速度对MAK195F晶体的晶体长度的影响。对五种不同速度的每 一种描述了不同滚转速度的平均颗粒长度。附图4显示了 MAK195F样品的二阶导数IR光谱。A晶体悬浮液；B重新溶解的晶 体。实线代表来自晶体MAK195F的样品，短划线是液体标准物。分别地，A是用BioATR细 胞记录的，B用AquaSpec细胞记录。样品和标准物之间的补偿被分别插入以更好地说明。附图5显示了在25°C保存6个月的MAK195F样品(在18 % PEG4, 000缓冲液中 200mg/mL晶体蛋白质)的二阶导数IR光谱。A晶体悬浮液；B重新溶解的晶体。分别地，A 是用BioATR细胞记录的，B用AquaSpec细胞记录。样品和标准物之间的补偿被分别插入 以更好地说明。附图6显示了 MAK195F晶体悬浮液、液体制剂(都是200mg/mL)和含有PEG 4，000 的安慰剂悬浮缓冲液的DSC热象图。附图7显示了 SEM获得的MAK195F晶体的代表性的图片。附图8显示了依赖于晶体浓度和针头直径的MAK195F晶体悬浮液的可注射性。发明的详细说明A.定义“允许抗体晶体形成的条件”是指溶液的任何条件，其在非搅拌条件下引起晶体形 成。这意味着提供一种溶液，其含有抗体分子和足够浓度的至少一种结晶试剂以在给定条 件下随着时间的过去启动晶体形成，所述条件例如混合物的PH值、温度。“相当于”在本发明的意义上意味着以下的一种特定的结晶技术，其包括在特定几何结构的滚筒容器中以特定速度和/或特 定填充体积向结晶混合物施加搅拌，构成了大小控制结晶的“参考系统”。在所述参考系统 的描述的指导下，熟练技术人员将能够在不同的条件下进行大小控制的抗体结晶。“不同的 条件”包括，例如，滚筒容器中结晶过程的增大或降低规模，或包括施加不同的搅拌条件，例 如，通过摇动、搅拌或翻滚的搅拌，或包括搅拌速度的变化，或其组合。“结晶的批量方法”意 思是结晶方法包括向含有抗体的结晶混合物添加要结晶的、优选以溶解形式的至少一种结 晶试剂的步骤。“微尺度结晶方法”是指任何结晶方法，其中结晶混合物的体积在0. lyL和10yL 之间，特别是允许在结晶期间蒸气扩散起作用的任何方法。例如，基于蒸气扩散的方法包括 步骤，添加小体积的抗体溶液到含有结晶试剂的储备缓冲液的微升范围内，将混合物的液 滴置于密封容器中邻近储备缓冲液的等份试样；容许液滴和储备液之间溶剂通过蒸气扩散 交换，在这期间液滴中的溶剂成分改变，如果达到适合的结晶条件可以观察到结晶。“结晶试剂”是帮助、增强或促进要结晶的抗体的晶体形成的试剂。“结晶溶液”含有溶解形式的结晶试剂。优选的，所述溶液是水性系统，即，其液体 组成部分主要由水组成。例如，80到lOOwt.-%，或95到100wt. %，或98到100wt.可 以是水。术语“贮备溶液”还指“结晶溶液”，如通过蒸气扩散技术的微尺度结晶所使用的。“结晶混合物”含有抗体或其片段的水溶液以及结晶溶液。“晶体”是物质例如蛋白质的固态的一种形式，其不同于第二固态，S卩，无定形态， 无定形态基本上作为未组织的、非均质的固体存在。晶体具有规则的三维结，一般称为晶格。抗体晶体包含抗体分子的规则的三维阵列(参见，Giege, R_等人，Crystallization of NucleicAcids and Proteins, a Practical Approach,2nd ed. , pp. 1-16, OxfordUniversity Press, New York(1999))。“整个”或“完整”抗体是在能够体外和/或体内识别和结合它的抗原，例如hTNF a 的功能性抗体。抗体可以启动与抗体对其抗原的结合相关的的患者的随后的免疫系统反 应，特别是直接细胞毒性、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。抗 体分子一般具有由共价地相互结合的两条相同的重链(MW各为约50kDa)、各自与重链之一 共价结合的两条相同的轻链(MW各为约25kDa)组成的结构。四条链按照典型的“Y”图形 布置。每个重链包括重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包 括三个结构域，CHUCH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻 链恒定区。轻链恒定区定区包括一个结构域CL。VH和VL区域可以进一步分成高可变性的 区域，称为互补决定区(CDR)，与更为保守的称为框架区域(FR)的区域间隔。每个VH和VL 一般由三个⑶R和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列FR1、⑶Rl、FR2、 ⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。完整抗体分子具有两个抗原结合位点，即，是“二价的”。两个抗原结 合位点特异于一个hTNFa抗原，即，所述抗体是“单特异性的”。上述结构在不同物种之间 可以变化。“单克隆抗体”是来自B淋巴细胞(B细胞)的单个克隆、识别同一抗原决定簇的 抗体。完整的单克隆抗体是具有上述典型分子结构、包括两个完整的重链和两个完整的轻 链的抗体。单克隆抗体通过将抗体生产B细胞与永生的骨髓瘤细胞融合来产生持续在细胞 培养物中生产单克隆抗体的B细胞杂交瘤来产生。其他生产方法是可用的，例如，利用例如 噬菌体_展示技术、酵母展示技术或RNA展示技术，在细菌、酵母、昆虫、真核或哺乳动物细 胞培养物中单克隆抗体的表达；或在遗传修饰的动物，例如牛、山羊、猪、兔、鸡中，或在已经 被修饰以含有和表达全部人类B细胞基因组的转基因小鼠中体内生产；或在遗传修饰的植 物，例如烟草和玉米中生产。来自所有这些来源的抗体或片段可以根据本发明来结晶。根据本发明结晶的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分相 同于或同源于来自特定物种的抗体中的相应序列、或属于特定抗体种类或子类，而链的其 余部分相同于或同源于来自另一个物种的抗体中的相应序列，或属于另一个抗体种类或子 类。小鼠/人类嵌合体的实例含有鼠抗体的可变抗原结合部分和来自人类抗体的恒定部 分。非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式也被本发明涵盖。这些是含有来自非人 免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人类免疫球蛋白，其中来 自人免疫球蛋白的互补决定区(CDR)或超变环(HVL)的残基被来自非人类物种如小鼠、大 鼠、兔或非人灵长类的、具有期望的功能的CDR或HVL的残基替代。人免疫球蛋白的框架区 域(FR)残基可以被相应的非人类残基替代来改善抗原结合亲和力。此外，人源化抗体可以 包含既不在相应的人类抗体部分、也不在非人类抗体部分中存在的残基。这些修饰可能是 进一步改善抗体效力必需的。“人类抗体”或“完全人类抗体”是具有相应于人类产生的抗体、或重组产生的抗体 的序列的氨基酸序列的抗体。如在此使用的，术语“人类抗体”意图包括具有来自人类种系 免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可以包括不被人类种系免疫
15球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或定点诱变或通过体内的体细胞突 变而引入的突变)，例如，在CDR中和在特定的CDR3中。然而，如在此使用的，术语“人类抗 体”不意图包括其中来自另一个哺乳动物物种的种系，例如小鼠的CDR序列被移植到人类框 架序列上的抗体。如在此使用的，术语“重组人类抗体”意图包括通过重组方法制备、表达、创造或分 离的所有人类抗体，例如，利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的组 合人类抗体文库分离的抗体、从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体 (参见，例如 Taylor, L. D.，等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 =6287-6295)，或通过涉及人免 疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、创造或分离的抗体。 这样的重组人类抗体具有来自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些 实施方式中，这样的重组人类抗体经历了体外诱变(或，当使用人类Ig序列的转基因的动 物时，体内的体细胞诱变的)，因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是，虽然来自于或 相关于人类种系VH和VL序列，可能在体内不天然地存在于人类抗体种系全集中。在此使用的，“中和抗体”(或“中和hTNFa活性的抗体”)意图指其结合hTNFa 引起hTNFa的生物学活性的抑制作用的抗体。“亲和成熟的”抗体是在一个或更多个高变区中具有一个或更多个改变的抗体，其 引起抗体对抗原的亲和力相比亲本抗体的改善。亲合成熟的抗体可以具有对于目标抗原的 纳摩尔乃至皮摩尔的亲和力值。亲和成熟的抗体通过本领域已知的过程产生。Marks等人 (1992) Bio/Technology 10 :779_783 描述了通过 VH 和 VL 结构域混洗(shuffling)的亲和 成熟。在 Barbas 等人(1994)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809_3813 ；Scier 等人(1995) Gene 169 :147_155 ；Yelton 等人(1995) J. Immunol. 155 =1994-2004 Jackson 等人(1995) J. Immunol. 154(7) :3310-9 ；和 Hawkins 等人(1992) J. Mo 1 Biol. 226 :889_896 中描述了 CDR和/或框架残基的随机诱变。如在此使用的，“分离的抗体”意图指一种抗体，其基本上没有其他具有不同抗原 性特征的抗体(例如，特异性结合hTNFa的分离的抗体基本上没有特异性结合hTNF a以 外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hTNFa的分离的抗体可以具有与其他抗原的交叉反 应性，例如来自其他物种的hTNF a分子。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料 和/或化学物质。根据本发明的结晶的特定“亲本”抗体的“功能等效物”是显示了相同的抗原特异 性、但是在氨基酸水平或糖基化水平上与“亲本”抗体的分子组成不同的分子。然而，所述 差异可以仅仅是这样，从而结晶条件不偏离在此公开的参数范围。抗体晶体的“封装”是指一种制剂，其中所述晶体被至少一层包被材料独立地包 被。在优选的实施方式中，这样包被的晶体可以具有维持的溶解速率。抗体晶体的“包埋”是指一种制剂，其中可能被密封或未被密封的晶体以分散的方 式掺入到固体、液体或半固体载体中。这样包埋的结晶的抗体分子可以以控制的、持续的方 式从载体中释放或溶解。“聚亚烷基多元醇型的结晶试剂”在下文更详细地定义。根据本发明使用的“聚亚烷基多元醇”是直链或支链的，特别是直链的， 聚-c2-c6-亚烷基多元醇。聚醚是从至少一种类型的多功能脂肪醇形成的，所述多功能脂肪醇带有2到6、2到4和特别是2或3个，优选的邻近的羟基基团，并具有2到6、特别是2、3 或4个碳原子，优选的形成线性的碳骨架。非限制性实例是乙-1，2_ 二醇(乙二醇)、丙-1， 2- 二醇、丙-1，3- 二醇和正丁 -1，3- 二醇和正丁 -1，4- 二醇。特别优选的二醇是乙二醇。术语“聚亚烷基多元醇”还包括它们的衍生物。非限制性实例是烷基酯和醚，特别 是单烷基醚和二烷基醚。“烷基”被特别地定义为直链或支链的c「c8-烷基，特别是，甲基、 乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或异戊基；和正己基。聚亚烷基多元醇，特别是聚亚烷基二醇，如根据本发明使用的，进一步的特征在 于分子量的广泛范围。表示为数字或重量平均分子量的分子量范围一般在约400到约 10，000g/mol 的范围内，例如约 1，000 到约 8，000g/mol、或约 2，000 到约 6，000g/mol、约 3，000 到约 6，000g/mol 或约 3，200 到约 6，000g/mol,例如约 3，350 到约 6，000g/mol、约 3，350 到约 5000g/mol、或约 3，800 到约 4，200g/mol，特别是约 4，000g/mol。特别优选的聚亚烷基多元醇是聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)和相应的随机或 块共聚物。适合的多元醇的具体实例是PEG 2，000 ；PEG 3，000 ；PEG 3，350 ；PEG 4，000 ；PEG 5，000 ；和 PEG 6，000。在结晶混合物中的聚亚烷基多元醇浓度，特别是PEG浓度处在约5到约30% (w/ v)的范围内，例如约7到约15% (w/v)或约9到约16% (w/v)或约9到约14% (w/v)或 约9到约12% (w/v) 0优选的，具有约4，000的平均分子量的PEG以结晶混合物中在单步 骤过程中约9到约12% (w/v)、或在多步骤过程中约10到约16% (w/v)的浓度使用。本发明的聚亚烷基多元醇可以由一个单一种类的多元醇、或至少两种不同的多元 醇组成，其可以无规地聚合或作为嵌段共聚物存在。在本发明的优选的实施方式中，抗体蛋白质溶液和结晶溶液以约1 1的比例组 合。因而，在原始结晶溶液中缓冲试剂/结晶试剂的摩尔浓度是结晶混合物中的约两倍。在特定的实施方式中，结晶混合物包含范围约lmL到约20，000升、或约1ml到约 15，000升、或约1ml到约12，000升、或约1ml到约10，000升、或约1ml到约6，000升、或约 lml到约3，000升、或约1ml到约1，000升、或约1ml到约100升，例如约50ml到约8升、或 约100ml到约5升、或约1升到约3升；或约1升到约1，000升；或约10升到约500升的批 量体积。在一个实施方式中，在本文描述的晶体大小控制的条件下进行结晶。B.结晶的方法本发明的结晶方法，除非另有陈述，适合于任何抗体或抗体片段。抗体可以是多 克隆抗体，或优选的，是单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、非人类 抗体，例如，小鼠抗体，每个处于糖基化或非糖基化的形式。抗体可以是例如双特异性抗体 (dsAb)或双可变域抗体(DVDAb)。除非另有说明，本发明的结晶方法利用了本领域公知的技术、设备、化学物质和方 法。然而，如上文解释的，本发明是基于令人惊讶的发现，特定结晶条件的选择，特别是特定 结晶试剂的选择，任选地进一步与特定的PH值条件和/或相应试剂(缓冲液、抗体、结晶试 剂)的浓度范围组合，第一次容许了可再现地和在大小控制条件下和/或大规模地制备稳 定的抗体或抗体片段的晶体，其可以被进一步加工来形成优越的、高度有益的药物组合物 的活性成分。进行结晶方法的起始材料通常包含要结晶的抗体的浓缩的溶液。蛋白质浓度可以是，例如，在约5到约75mg/ml的范围内。所述溶液可以含有稳定所溶解的抗体的添加剂。 在一个实施方式中，建议是预先除去添加剂。这可以通过进行本文描述的缓冲液交换步骤 来实现。优选的，用于进行本发明的结晶方法的起始材料含有水溶液中的抗体，具有被调 节至约3. 2到约8. 2、或约4. 0到约8. 0、特别是约4. 5到约5、优选的约5. 0到约5. 5的范 围内的PH值。所述pH值可以通过以约1到约500mM、特别是约1到约100mM或约1到约 10mM的终浓度存在的适合的缓冲液来调整。所述溶液可以含有添加剂，例如，以根据溶液的 总重量约0. 01到约15、或约0. 1到约5、或约0. 1到约2wt. 的比例，例如，盐、糖、糖醇 和表面活性剂，以进一步稳定所述溶液。赋形剂优选地选自在药物制品中常规地应用的、生 理学可接受的化合物。作为非限制性实例，可以提及的是盐，例如NaCl ；表面活性剂，例如 聚山梨醇酯80 (吐温80)和聚山梨醇酯20 (吐温20)；糖类、例如蔗糖和海藻糖；糖醇，例如 甘露醇和山梨醇；和缓冲剂，例如基于磷酸盐的缓冲系统，例如如上所定义的磷酸氢钠和磷 酸氢钾缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、马来酸盐缓冲 液或琥珀酸盐缓冲液，以及组氨酸缓冲液；和氨基酸，例如组氨酸、精氨酸和甘氨酸，举例来 说o可以通过常规方法，例如，通过透析、渗滤或超滤进行缓冲液交换。用作起始材料的水溶液的起始蛋白质浓度应当在约0. 5到约280mg/ml或约1到 约50mg/ml的范围内。取决于预期的最终批量大小(其可以在约1ml到约20，000升的范围内)，水性抗 体溶液的初始体积被置于由惰性物料，例如玻璃、聚合物或金属制成的合适容器中(例如， 器皿、瓶子或罐)。水溶液的初始体积可以相当于最终批量大小的约30%到约80%，通常约 50%。如有必要，所述溶液在填充到容器中之后，将被调节到标准化的条件。特别是，温 度将被调节到约4°C到约37°C的范围内。如果希望或有益的，温度不必保持恒定，例如，温 度可以是变化的，提供了期望形状的晶体的温度分布可以在结晶过程期间添加。含有合适浓度的结晶试剂，任选地按照与抗体溶液一样的方式预先条件化的结晶 溶液然后被添加到抗体溶液中来形成结晶混合物。在第一个步骤中，结晶试剂的部分被添加到抗体溶液中达到约9到llwt. 的第 一终浓度，其足以启动结晶而在通常具有相对高的起始抗体蛋白质浓度的起始结晶混合物 中基本上不形成聚集物/沉淀。在孵育足够的时间以达到晶体形成的第一最大值时，添加 结晶试剂的进一步的等份试样，任选地在除去至此形成的抗体晶体之后。结晶试剂的浓度 因而进一步提高到第二终浓度，增加约0. 5到约3wt. -%。在随后孵育足够的时间期间，例 如约1小时到约5天，形成另外的抗体晶体而基本上不形成聚集物/沉淀，并可以从上清液 或“母液”中分离。结晶试剂的补充可以按照相同方式重复一次或多次，只要另外的抗体晶 体形成被诱导而基本上不形成聚集物/沉淀。结晶试剂的终浓度因而可以达到约12到约 20wt. 的值。根据进一步的实施方式，本发明的结晶方法还可以这样进行，从而在步骤a)中获 得的结晶混合物可以补充合适数量的预先存在的抗体晶体，例如抗-hTNF a抗体结合片段 晶体，作为种子晶体以启动或强化结晶。
结晶溶液的添加在柔和搅拌下连续地或不连续地进行以促进两种液体的混合。优 选的，添加在一定条件下进行，在所述条件中蛋白质溶液在搅拌下提供，结晶溶液(或它的 固体形式的试剂)以受控的方式添加。在本发明的优选的实施方式，结晶在控制的条件下进行，其相当于在一定条件下 在滚筒容器中结晶混合物的搅拌，在选择至少一种关键参数，例如滚转速度时，容许控制在 结晶过程的进程期间形成的抗体晶体的平均颗粒大小。例如，所述过程持续直到达到晶体 形成的平台期或晶体产量的最大值，或在结晶过程期间的预定的时间段期间，例如，在晶体 形成的主要阶段期间，例如，所述主要阶段特征可以是每个时间间隔(例如，每天)超过 5%、或超过10%或超过15%的结晶速率的提高。当在此使用时，“相当于”是指以特定的速度在特定几何结构的滚筒容器中施加搅 拌的特定结晶技术必需被理解为大小控制结晶的“参考系统”。在这样的参考系统的描述的 指导下，熟练的技术人员将能够在不同的条件下进行大小控制的抗体结晶，例如，滚筒容器 中的结晶过程中增加或降低规模、或应用不同的搅拌条件，例如，通过摇动、搅拌或翻滚或 其组合的搅拌。通过进行有限数量的常规实验，熟练的技术人员将能够将在此提供的一般教导转 移到本发明的参考滚筒容器系统来得到降低或提高规模的滚筒容器结晶方法、或基于在适 合的条件下摇动、搅拌或翻滚结晶混合物的大小控制的结晶方法，例如，通过选择适合的容 器或器皿中摇动、搅拌或翻滚的适合的速度、选择适合的蛋白质和结晶试剂浓度、温度、持 续时间、液体结晶混合物对容器的装载水平和/或混合物的PH值。根据本发明的参考系统，搅拌的关键参数通过滚转速度来表示。特别地，滚转速度 被设置为约1到约200rpm范围内的值。所述滚转速度可以在所述范围内变化，或在所述范 围内区间内，例如，所述范围的约士 1到约士5、或约士2到约士4rpm。然而，优选的，所述 速度被设置为一个特定的值，其在结晶过程的进程期间保持恒定。例如，滚转速度可以被设 置为约2到约150rpm、或约5到约120rpm或约8到约lOOrpm的范围内的值，例如，10、20、 30、40、50、60、70、80或90rpm。相应适合的速度值可以由熟练的技术人员选择，用于增加或 降低在滚筒容器中结晶的规模，或用于通过摇动、搅拌或翻滚的大小控制的结晶。根据所述参考系统的另一个实施方式，结晶在控制的条件下进行，其相当于在具 有约2到约100cm、例如约5到约80或约10到约50cm的范围内的直径的滚筒容器中结晶 混合物的搅拌。要理解的是，在参考滚筒容器系统中为大小控制的结晶获得的实验设置可 以通过减少或优选的增加规模转移到更小或优选的更大的大小或内体积的器皿(滚筒容 器)。它们还可以转移到具有更小或优选的更大体积的、适合于通过搅拌、摇动或翻滚来搅 拌的其他类型的器皿中。适合的器皿几何结构是熟练的技术人员公知的。根据所述参考系统的另一个实施方式，在控制的条件下进行大小控制的结晶，所 述条件相当于在滚筒容器中结晶混合物的搅拌，其中所述滚筒容器的总内体积的约1到 约100vol. -%，例如约4到约99、约10到约80、约20到约70、约30到约60、或约40到约 50vol.填充了所述结晶混合物。当然，这些参数范围可以转移到不同大小的容器和用于 通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的容器。根据所述参考系统的另一个实施方式，所述大小控制的结晶在控制的调节下进 行，其相当于在滚筒容器中搅拌结晶混合物约30分钟到约60天的时间，例如，约1到约40、约2到约20、或约3到约10天。当然，这些参数可以转移到通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的 大小控制的结晶。根据所述参考系统的另一个实施方式，所述大小控制的结晶在控制的条件下进 行，其相当于在约-15到约+50°C的范围内的温度，例如约0到约40、约5到约30、约10到 约25或约15到约20°C的温度下在滚筒容器中结晶混合物的搅拌。当然，这些参数可以转 移到通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的大小控制的结晶。用于在滚筒容器中大小控制的结晶的优选的参考系统应用了一种或更多种以下 的关键参数，特别是其组合滚筒容器体积约450到约550ml、优选的约500ml滚筒容器直径约6到约10cm，优选的约8cm滚转速度 设置到约1到约lOOrpm之间的值填充约5到约15、优选的约10vol.-%温度约15到约25、优选的约20°C持续时间 约2到约20、优选的约5到约10天通过遵照本发明的教导，有可能调整平均晶体颗粒大小(即，平均直径或平均长 度)到约1到约1000 u m，例如约5到约400、约10到约00、约15到约150、约15到约100、 约15到约50或约18到约40 y m的范围内。在一个实施方式中，所述抗体片段是抗-hTNFa 抗体结合片段。在特定的实施方式中，所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段，例如，MAK195F、 具有保藏编号ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生的抗体MAK195的F(ab，)2片段。在特定的实施方式中，MAK195F以约0. 5到约280mg/ml范围内的起始蛋白质浓度 存在，在约15到约25°C范围内的温度下、在滚筒容器中以约5到约lOOrpm范围内的速度搅 拌约1到约60天。在MAK195F晶体的大小控制的制备的优选的实施方式中，具有约0. 5到约280mg/ ml、特别是约1到约15mg/ml、优选的约5mg/ml的起始MAK195F蛋白质浓度的含MAK195F的 结晶混合物，在具有约100ml到约1000升内体积、约5到约50cm范围内的直径、填充约5 到约80vol. %的结晶混合物的滚筒容器中，以约1到约lOOrpm范围内的速度，在约15到约 25°C的范围内的温度下搅拌约1到约60天的时间。在中等规模的结晶的实施方式中，MAK195F蛋白质浓度是约1到约15、优选的约 5mg/ml ；所述滚筒容器具有约100到约1000ml的体积和约5到约10cm范围内的直径，填充 约5到约20vol. %的结晶混合物；在约1到约lOOrpm的范围内的滚转速度下；持续时间约 1到约10天；在约15到约25°C的温度下。在大规模结晶的实施方式中，MAK195F蛋白质浓度是约1到约15mg/ml，优选的约 5mg/ml，在具有约10到约20，000升的体积和约10到约100cm范围内的直径、填充约20到 约90vol. %的结晶混合物的滚筒容器中，在约1到约lOrpm范围内的滚转速度下，在约15 到约25°C的温度下搅拌约1到约10天的持续时间。抗体晶体的形成通过施加上文定义的聚亚烷基多元醇、特别是聚亚烷基二醇、优 选的聚乙二醇(PEG)、或上文定义的至少两种不同聚亚烷基多元醇的混合物作为结晶试剂 来启动。结晶混合物含有一定浓度的试剂，所述浓度足够提供结晶混合物中所述聚亚烷基 多元醇的终浓度在约5到约30% (w/v)的范围内。如上文已经描述的聚亚烷基多元醇的浓度梯度也是可应用的。优选的，结晶溶液另外含有酸性缓冲液，S卩，不同于抗体溶液的缓冲液，浓度适合 于容许将结晶混合物的PH值调节至约4到约6的范围内。在结束了向结晶溶液添加结晶试剂之后，所述混合物可以进一步孵育约1小时到 约250天以获得抗体晶体的最大产量。如果合适，例如，所述混合物可以搅拌、轻轻地搅拌、 滚动或以本领域已知的方式运动。如果希望另外控制晶体大小，基于在控制的条件下的搅 拌的大小控制的结晶方法(如上文已经解释的)可以实现到本发明的批量结晶方法中。获得的晶体可以通过已知的方法分离，例如，过滤或离心，例如，通过在约4°C的室 温下在约200到约20，OOOrpm、优选的约500到约2，OOOrpm离心。残余的母液可以丢弃或 进一步加工，例如，通过添加另外的结晶试剂。如有必要，分离的晶体可以洗涤和随后干燥，或者母液可以用适合于贮存或适合 于悬浮在其中的抗体的最终用途的不同溶剂系统替代。根据本发明形成的抗体晶体可以在它们的形状上不同，如上文已经描述的。对于 治疗性施用，晶体的大小将取决于给药途径而变化，例如，对于皮下施用，晶体的大小可以 大于用于静脉内施用的。晶体的形状可以通过向结晶混合物添加特定的其他添加剂来改 变，这是早先对蛋白质晶体和低分子量有机和无机分子的晶体已经描述的。如有必要，可以验证所述晶体实际上是抗体的晶体。抗体的晶体可以显微镜下分 析双折射。一般地，除非是立方内部对称的，晶体将旋转偏振光的偏振平面。在又一个方法 中，晶体可以被分离、洗涤、重新溶解和通过SDS-PAGE分析，任选地，用检测抗体染色。任选 地，重新溶解的抗体也可以利用标准分析测试与其抗原的结合。根据本发明的获得的晶体还可以是相互交联的。这样的交联可以增强晶体的稳定 性。交联晶体的方法已经描述了，例如在美国专利No. 5，849，296中，通过引用将其合并在 此。晶体可以利用双功能试剂例如戊二醛来交联。一旦被交联，晶体可以被冻干和保存，用 于例如诊断或治疗应用。在某些情况下，可能希望的是干燥晶体。晶体可以通过惰性气体如氮气、真空炉干 燥、冻干、蒸发、盘式干燥、流化床干燥、喷雾干燥、真空干燥或滚筒干燥的方式来干燥。适合 的方法是本领域公知的。根据本发明的形成的晶体可以维持在原始的结晶混合物中，或它们可以被洗涤并 与其他物质组合，例如，惰性载体或成分，来形成包含本发明的晶体的组合物或制剂。这样 的组合物或制剂可以用于，例如，治疗和诊断应用。在优选的实施方式中，适合的载体或成分与本发明的晶体组合，从而制剂的晶体 被赋形剂包埋或密封。适合的载体或结晶试剂可以来自以下的非限制性的组聚(丙烯 酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、 聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)或PLGA、聚(0-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚二甲基硅氧 烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物、乙烯乙烯基乙酸酯共聚物、聚[二(p-羧基苯氧基)丙烷酸 酐]癸二酸、polyglactin、聚硅氧烷、聚(二氧杂环己酮)；聚(乙二醇)、聚(羟基丙基)甲 基丙烯酰胺、聚(有机)磷腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸 酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、 血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡聚糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、羟乙基-淀粉、共混物和共聚物
21其、二乙酰蔗糖六异丁酸酯、脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪族胺、脂肪酸的甘油单、二 _、 三酯、磷脂、糖脂、固醇和蜡以及相关的类似物质。蜡被进一步分类为天然的和合成的产物。 天然的材料包括从植物、动物或矿物质来源获得的蜡，例如蜂蜡、棕榈蜡或褐煤蜡。氯化用 于萘和乙烯聚合物是合成蜡产物的实例。C.组合物在另一个方面，本发明提供了包含与至少一种载体和/或赋形剂组合的抗体晶体 的组合物和制剂。所述制剂可以是固体、半固体或液体。本发明的制剂通过以悬浮液的形式混合具有必需的纯度的抗体与生理学可接受 的添加剂，例如载体、赋形剂和/或稳定剂(参见，例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th Edn. ,0sol,A. Ed. (1980))来制备为适合于贮存和/或使用的形式，或以其 他方式被冻干或干燥。任选地，进一步的活性成分，例如不同的抗体、生物分子、或化学或酶 学合成的低分子量分子也可以掺入。可接受的添加剂是在采用的剂量和浓度下对接受者无毒的。其非限制性实例包 括-酸化试剂，例如，乙酸、柠檬酸、延胡索酸、盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀释的磷酸、 硫酸和酒石酸；_气溶胶喷射剂，例如，丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟甲烷、异丁烷、丙烷和三氯氟 代甲烷；-空气置换物，例如二氧化碳和氮气；-醇类变性剂，例如甲基异丁基酮和蔗糖辛醋酸酯；_碱化试剂，例如，氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸 钠、碳酸钠、氢氧化钠和三乙醇胺；_消泡沫剂，例如二甲聚硅氧烷和二甲硅油；-抗微生物防腐剂，例如，苯扎氯铵、苯扎氯铵溶液、benzelthoniumchloride、苯甲 酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、西吡氯铵、三氯叔丁醇、氯甲酚、甲酚、脱氢乙酸、对羟基苯 甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯基乙醇、醋酸苯汞、硝酸苯汞、 苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、脱氢醋酸钠、丙 酸钠、山梨酸、硫柳汞、和麝香草酚；_抗氧化剂，例如，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、次磷酸、硫 代甘油、醅酸丙酯、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、生育酚和生育 酚赋形剂；-缓冲剂，例如乙酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、柠檬酸钾、偏磷酸 钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸二钠、磷酸单钠、组氨酸；_螯合剂，例如，依地酸二钠、乙二胺四乙酸和盐和依地酸；-包被试剂，例如羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维 素、明胶、药学的釉料、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸 盐、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸盐、虫胶、蔗糖、二 氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米蛋白、聚氨基酸、其他聚合物例如PLGA，等等，以及SAIB ；_着色试剂，例如三氧化二铁；
-复合试剂，例如乙二胺四乙酸和盐(EDTA)、依地酸、龙胆酸乙醇胺和羟基喹啉盐。-干燥剂，例如氯化钙、硫酸钙和二氧化硅；-乳化剂和/或增溶剂，例如，阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺(添加剂)、单硬脂酸甘 油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单和二-甘油酯、单乙醇胺(添加剂)、油酸(添加剂)、油醇(稳定 剂)、泊洛沙姆、聚烃氧50硬脂酸盐、聚烃氧35蓖麻油、聚烃氧40氢化蓖麻油、聚烃氧10油 烯基醚、聚烃氧20十八烷基醚、聚烃氧40硬脂酸盐、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨 醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇双醋酸酯、单硬脂酸丙二醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、 单月桂酸山梨醇酐酯、山梨糖醇酐一油酸酯、山梨聚糖甘油一棕榈酸酯、单硬脂酸山梨糖醇 酐酯、硬脂酸、三乙醇胺和乳化蜡；-助滤剂，例如，粉末的纤维素和纯化的硅藻土；-气味和芳香剂，例如，茴香脑、苯甲醛、3-乙氧基-4-羟基苯甲醛、薄荷醇、水杨酸 甲酯、谷氨酸单钠、橙花油、薄荷、薄荷油、薄荷精、玫瑰油、浓玫瑰水、麝香草酚、叶鲁香脂酊 剂、香草兰、香草兰酊，并且香草醛；-助流剂和/或防结块剂，例如，硅酸钙、硅酸镁、胶体二氧化硅和滑石粉；_湿润剂，例如甘油、已二醇、丙二醇和山梨醇；-软膏基质，例如羊毛脂、无水羊毛脂、亲水性软膏、白色软膏剂、黄色软膏剂、聚乙 二醇软膏剂、矿脂、亲水性的矿脂、白凡士林、玫瑰水软膏剂和鲨烷；-成形剂，例如，蓖麻油、羊毛脂、矿物油、矿脂、苯甲基苯基甲酸盐、三氯叔丁醇、 邻苯二甲酸二乙酯、山梨醇、二乙酰化单酸甘油酯、邻苯二甲酸二乙酯、甘油、甘油、单-和 二 _乙酰化单甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、丙二醇、三醋汀、柠檬酸三乙酯和乙醇；-多肽，例如，低分子量的(低于约10个残基)；_蛋白质，例如，血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白；-聚合物膜，例如，醋酸纤维薄膜；-溶剂，例如，丙酮、醇类、稀释的醇、水合戊烯、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、 玉米油、棉花子油、乙酸乙酯、甘油、已二醇、异丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基异丁基酮、矿物 油、花生油、聚乙二醇、丙烯碳酸酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、灭菌注射水、冲洗用无菌水、 纯水、液体甘油三酯、液体蜡和高级醇；_吸附剂，例如，粉剂纤维素、活性炭、纯化的硅藻土、二氧化碳吸附剂、氢氧化钡、 石灰和碱石灰；_硬化剂，例如，氢化蓖麻油、十八烷基醇、十六醇、十六烷基酯蜡、硬脂、石蜡、聚乙 烯赋形剂、硬脂醇、乳化蜡、白蜡和黄蜡；-栓剂基质，例如，可可脂、硬脂和聚乙二醇；_悬浮和/或粘度_提高试剂，例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、斑脱土、 纯化的斑脱土、岩浆斑脱土、卡波姆934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素 钠12、角叉菜胶、微晶的和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜耳豆胶、羟乙基纤维素、羟 基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚 烯吡酮、海藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶体二氧化硅、海藻酸钠和黄芪胶、黄原胶；_甜味剂，例如，阿斯巴甜、葡萄糖结合剂、葡萄糖、赋形剂葡萄糖、果糖、甘露醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨醇、溶液山梨醇、蔗糖、可压缩的糖类、糖果糖类和糖浆；-片剂粘合剂，例如，阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、糊精、乙基 纤维素、明胶、液状葡萄糖、瓜耳豆胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚烯吡 酮、预胶化淀粉和糖浆；-片剂和/或胶囊稀释剂，例如，碳酸钙、二碱的磷酸钙、三碱的磷酸钙、硫酸钙、微 晶纤维素、粉剂纤维素、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖赋形剂、果糖、白陶土、乳糖、甘露醇、山 梨醇、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、可压缩的糖类和糖果糖类；_片剂崩解剂，例如，海藻酸、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、离子交换 树脂钾、淀粉羟基乙酸钠、淀粉和预胶化淀粉。_片剂和/或胶囊剂润滑剂，例如，硬脂酸钙、甘油基山嵛酸酯、硬脂酸镁、轻质矿 物油、聚乙二醇、硬脂酰延胡索酸钠、硬脂酸、纯化的硬脂酸、滑石粉、氢化植物油和硬脂酸 锌；_渗涨度试剂，例如，葡萄糖、甘油、甘露醇、氯化钾、氯化钠；-运载体，例如，调味和/或加甜芳香酏剂、化合物苯甲醛酏剂、异醇的酏剂、薄荷 水、山梨醇溶液、糖浆和叶鲁香脂糖浆；-运载体，例如，油质的杏仁油、玉米油、棉花子油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕 榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、肉豆寇醇、十二醇、橄榄油、花生油、杏仁油、芝麻油、豆 油、鲨烷；固体载体糖类球体；无菌的抑菌注射用水、抑菌的氯化钠注射液、液体甘油三酯、 液体蜡和高级醇；_水排斥试剂，例如，环甲聚硅氧烷、二甲聚硅氧烷和二甲硅油；和_湿润和/或增溶剂，例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、西吡氯铵、多库酯钠、壬苯醇醚9、 壬苯醇醚10、辛苯聚醇9、泊洛沙姆、聚烃氧35蓖麻油、聚烃氧40、氢化蓖麻油、聚烃氧50硬 脂酸酯、聚烃氧10油烯基醚、聚烃氧20、十八烷基醚、聚烃氧40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、 聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯、单 油酸山梨醇酐酯、山梨聚糖甘油一棕榈酸酯、单硬脂酸山梨糖醇酐酯和泰洛沙泊。所述晶体可以与聚合的载体组合来提供稳定性和/或持续释放。这样的聚合物包 括生物相容的和可生物降解的聚合物。聚合的载体可以是单一聚合物类型的，或可以由聚 合物类型的混合物组成。聚合的载体的非限制性实例已经在上文提供了。优选的成分或赋形剂的实例包括_氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯 氨酸和组氨酸的盐；_单糖，例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和核糖；-二糖，例如，乳糖、海藻糖、麦芽糖和蔗糖；-多糖，例如，麦芽糊精、葡聚糖、淀粉和糖原；_糖醇，例如，甘露醇、木糖醇、拉克替醇和山梨醇；-葡糖醛酸和半乳糖醛酸；-环糊精，例如，甲基环糊精、羟基丙基_(3_环糊精)；-无机盐，例如，氯化钠、氯化钾、氯化镁、钠和钾的磷酸盐、硼酸碳酸铵和磷酸铵；-有机盐，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐和乳酸盐；
_乳化或增溶剂比如阿拉伯胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油 酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸、单月桂酸山梨醇酐酯、单硬脂酸 山梨糖醇酐酯和其他山梨糖醇酐衍生物、聚烃氧衍生物、蜡、聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐 衍生物；和_粘度提高试剂，例如，琼脂、海藻酸和它的盐、瓜耳豆胶、果胶、聚乙烯醇、聚环氧 乙烷、纤维素和它的衍生物、丙烯碳酸酯、聚乙二醇、已二醇和泰洛沙泊。本文描述的制剂还包含有效量的晶体抗体。特别地，本发明的制剂可以包括“治疗 有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体晶体。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段 下实现期望的治疗结果的有效数量。抗体晶体的“治疗有效量”可以根据一些因素而改变， 例如，个体的疾病状况、年龄、性别和体重，抗体在个体中引发期望的响应的能力。治疗有效 量也是一种量，其中治疗有益的效果胜过抗体的任何毒性或不利影响。“预防有效量”是指 在必需的剂量和时间段下实现期望的预防结果的有效数量。一般地，由于在疾病之前或较 早阶段在个体中使用预防剂量，预防有效量将低于治疗有效量。适合的剂量可以使用标准方法容易地测定。一次性或在医治的系列过程中将抗体 适当地施用给病人。取决于上述因素，约1 P g/kg到约50mg/kg，例如约0. 1到约20mg/kg 的抗体是向患者施用的初始候选剂量，无论是通过例如一次或更多次独立的施用还是通过 连续的输注。典型的每日或每周剂量可以从约1 P g/kg到约20mg/kg或更多，取决于条件， 重复治疗直到发生疾病症状的期望的抑制。然而，其他给药方案也是有用的。在某些情况 下，当重新溶解时，制剂包含至少约lg/L或更高的抗体浓度。在其他实施方式中，当重新溶 解时，抗体浓度是至少约lg/L到约100g/L。抗体的晶体、或包含这样的晶体的制剂可以单独地或作为药物制品的部分来施 用。本发明的晶体可以通过，例如，口服的、胃肠外的、肺部的、鼻部、耳的、肛门的、真皮的、 眼睛的、静脉内的、肌肉内的、动脉内的、腹膜内的、粘膜的、舌下的、皮下的、穿表皮的、表面 的或颅内的途径施用，或施用到口腔中。施用技术的具体实例包括肺部吸入、病灶内应用、 针头注射、干粉吸入、皮肤电穿孔、气雾剂递送和无针头的注射技术，包括无针头的皮下施 用。hTNF a相关的病症可以选自以下疾病列表
权利要求
一种制备期望的基本上一致的大小的抗体晶体的方法，所述方法包括以下步骤a)在能够使抗体晶体形成的条件下提供水性结晶混合物，其包含抗体和至少一种结晶试剂；和a)在控制的条件下搅拌所述结晶混合物，从而形成处于期望的平均大小范围内的抗体晶体。
2.权利要求1的方法，其中所述控制的条件相当于以约1到约200rpm范围内的速度在 滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
3.权利要求2的方法，其中所述控制的条件相当于在具有约2到约IOOcm范围内直径 的滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
4.权利要求2的方法，其中所述控制的条件相当于在滚筒容器中搅拌所述结晶混合 物，其中所述滚筒容器的总内体积的约到约100%填充了所述结晶混合物。
5.权利要求3的方法，其中所述控制的条件相当于在滚筒容器中搅拌所述结晶混合 物，其中所述滚筒容器的总内体积的约到约100%填充了所述结晶混合物。
6.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述控制的条件相当于在滚筒容器中搅拌所 述结晶混合物约30分钟到约20天。
7.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述控制的条件相当于在约_15°C到约+50°C 的范围的温度下在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
8.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述搅拌包括滚转、搅动、摇动和/或翻滚所 述结晶混合物。
9.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述结晶试剂是聚亚烷基多元醇。
10.权利要求9的方法，其中所述结晶试剂是聚亚烷基二醇。
11.权利要求10的方法，其中所述结晶试剂是聚乙二醇。
12.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述晶体包含在约1到约1000μ m范围内的 一致的晶体颗粒直径和/或长度。
13.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述抗体是抗体片段。
14.权利要求13的方法，其中所述抗体片段是抗-hTNFα抗体结合片段。
15.权利要求13的方法，其中所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段。
16.权利要求15的方法，其中所述抗体片段是MAK195F，其是由具有保藏编号ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生的MAK195的F(ab，)2片段。
17.权利要求16的方法，其中所述MAK195F以约0.5到约280mg/ml范围内的起始蛋白 质浓度存在，在约15到约25°C范围内的温度下、以约5到约IOOrpm范围内的速度、在滚筒 容器中搅拌约1到约60天。
18.权利要求17的方法，其中所述晶体包含处于约1到约200μ m范围内的控制的平均 晶体颗粒长度。
19.可通过权利要求1到5的任一项的方法获得的抗体晶体。
20.一种结晶抗-hTNFa抗体结合片段的批量结晶方法，所述方法包括以下步骤a)提供水性结晶混合物，其包含抗体和至少一种聚亚烷基二醇作为结晶试剂；和b)孵育所述水性结晶混合物直到所述抗体的晶体形成；其中所述至少一种聚亚烷基二醇(a)在一个步骤中，或(b)在超过一个步骤中提供，其中在步骤中形成的所述抗体晶体在随后的步骤中不被移除。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体是抗体片段。
22.权利要求20的方法，其中所述水性结晶混合物的pH值处在约pH4到约6.5的范围内。
23.权利要求20的方法，其中所述水性结晶混合物包含缓冲液。
24.权利要求23的方法，其中所述缓冲液包含乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。
25.权利要求23的方法，其中所述缓冲液包含乙酸钠和/或柠檬酸钠。
26.权利要求23的方法，其中所述缓冲液以最高达约0.5M的浓度存在于所述水性结晶 混合物中。
27.权利要求20-22的任一项的方法，其中所述聚亚烷基二醇具有约400到约 10, 000g/mol的范围内的平均分子量。
28.权利要求27的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
29.权利要求20-22的任一项的方法，其中所述聚亚烷基二醇以总体积的约5到约 30% (w/v)的范围内的终浓度存在于所述结晶混合物中。
30.权利要求29的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
31.权利要求1-5和20-22的任一项的方法，其中满足以下另外结晶条件中的至少一种a)孵育进行约1小时到约250天；b)孵育在约-15°C和约+50°C之间的温度下进行；和c)所述结晶混合物包含约0.5到约280mg/ml范围内的浓度的抗体片段。
32.权利要求1-5和20-22的任一项的方法，进一步包括干燥所述晶体的步骤。
33.权利要求31的方法，进一步包括干燥所述晶体的步骤。
34.权利要求31的方法，其中所述结晶混合物包含晶体和天然母液，并且其中所述方 法进一步包括用人工的母液交换天然的母液的步骤。
35.权利要求1-5和20-22的任一项的方法，其中所述结晶混合物包含约ImL到约 20，000升范围内的批量体积。
36.权利要求20的方法，其中所述结晶在晶体大小控制的条件下进行。
37.权利要求36的方法，其中所述控制的条件包括以约1到约200rpm范围内的速度在 滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
38.权利要求36的方法，其中所述控制的条件包括在具有约2到约IOOcm范围内直径 的滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
39.权利要求36的方法，其中所述控制的条件包括在滚筒容器中搅拌所述结晶混合 物，其中所述滚筒容器的总内体积的约到约100%填充了所述结晶混合物。
40.权利要求37的方法，其中所述控制的条件包括在滚筒容器中搅拌所述结晶混合 物，其中所述滚筒容器的总内体积的约到约100%填充了所述结晶混合物。
41.权利要求36到40的任一项的方法，其中所述控制的条件包括在滚筒容器中搅拌所 述结晶混合物约30分钟到约20天。
42.权利要求36到40的任一项的方法，其中所述控制的条件包括在约-15°C到约 +50 0C的范围内的温度下在滚筒容器搅拌所述结晶混合物。
43.权利要求36到40的任一项的方法，其中所述搅拌包括滚转、搅动、摇动和/或翻滚 所述结晶混合物。
44.一种抗-hTNFa抗体片段的晶体。
45.一种抗-hTNF α抗体片段的晶体，所述晶体可通过权利要求1_5、20_22和36-40任 一项的方法获得。
46.权利要求44的晶体，其中所述晶体包含针状的形态。
47.权利要求45的晶体，其中所述晶体包含针状的形态。
48.可通过权利要求36的方法获得的晶体，其中所述抗体片段是多克隆抗体片段或单 克隆抗体片段。
49.可通过权利要求36的方法获得的晶体，其中所述抗体片段选自由嵌合抗体、人源 化抗体、非糖基化抗体、人类抗体和小鼠抗体的片段构成的组。
50.可通过权利要求36的方法获得的晶体，其中所述抗体片段是IgG抗体的片段。
51.权利要求50的晶体，其中所述抗体选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗体构成的组。
52.权利要求48-51的任一项的晶体，其中所述抗体片段是Fab或F(ab，)2片段。
53.权利要求52的晶体，其中所述抗体片段是MAK195F，其是由具有保藏编号ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生的抗体MAK195的F(ab，)2片段。
54.药物组合物，所述组合物包含(a)根据权利要求1到5、20到22和36到40的任 一项的方法制备的抗体的晶体，和(b)至少一种药物赋形剂；其中所述组合物作为固体、半 固体或液体制剂提供。
55.药物组合物，所述组合物包含(a)根据权利要求1到5、20到22和36到40的任 一项的方法制备的抗体的晶体，和(b)至少一种药物赋形剂，其中所述赋形剂包埋或密封 所述晶体。
56.权利要求54的药物组合物，其中所述抗体以大于约lmg/ml的浓度存在。
57.权利要求54的药物组合物，其中所述抗体以大于约200mg/ml的浓度存在。
58.权利要求55的药物组合物，其中所述抗体以大于约lmg/ml的浓度存在。
59.权利要求55的药物组合物，其中所述抗体以大于约200mg/ml的浓度存在。
60.权利要求54或55的药物组合物，其中所述组合物是包含0.1到99. 9% (w/w)的 抗体晶体的固体。
61.权利要求54或55的药物组合物，其中所述赋形剂包含至少一种聚合的生物可降解 的或非生物可降解的载体和/或至少一种油或脂质载体。
62.根据权利要求61的药物组合物，其中所述聚合载体包含选自以下构成的组的至少 一种聚合物聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)、 聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)或PLGA、聚(β_羟基丁酸酯)、聚(己 内酯)、聚(二氧杂环己酮)、聚(乙二醇)、聚(羟基丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷 腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复 合多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、 寡聚糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其共混物和共聚物。
63.可注射的液体组合物，其包含可通过权利要求1到5、20到22和36到40的任一项 的方法获得的抗体晶体，其中所述抗体以约10到约400mg/ml的范围内的浓度存在。
64.晶体浆液组合物，其包含可通过权利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方 法获得的抗体晶体，其中所述抗体以大于约100mg/ml的浓度存在。
65.一种治疗哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的、可通过权 利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方法获得的抗体晶体的步骤。
66.一种治疗哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求 54的组合物的步骤。
67.一种治疗哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求 55的组合物的步骤。
68.权利要求66或67的方法，其中所述组合物通过胃肠外途径、口服途径或通过注射 来施用。
69.一种在个体中治疗hTNFa相关的病症的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量 的权利要求19和46-51的抗体晶体的步骤。
70.权利要求69的方法，其中所述hTNFa相关的病症选自以下构成的组自体免疫疾 病，特别是类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬 化、自体免疫性糖尿病、自体免疫性葡萄膜炎和肾病综合征；传染性疾病、移植排斥或移植 体-抗-宿主疾病、恶性肿瘤、肺部病症、肠病症、心脏病症、炎性骨骼病症、骨吸收疾病、酒 精性肝炎、病毒性肝炎、暴发型肝炎、凝血紊乱、灼伤、再灌注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形 成、发热、牙周病、肥胖和放射毒性；脊柱关节病、肺部病症、冠状动脉的病症、代谢病症、贫 血、疼痛、肝脏的病症、皮肤病症、指甲病症，或脉管炎、Behcet' s病、关节强硬性脊椎炎、 哮喘、慢性阻塞性肺病(C0PD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩 氏病_相关的病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、银屑病、银屑病性关 节炎和慢性斑块银屑病、年龄-相关的恶病体质、阿尔茨海默氏病、脑水肿、炎性脑损伤、慢 性疲劳综合征、皮肌炎、药物反应、脊髓中和/或周围的水肿、家族性周期性发热、Felty' s 综合征、纤维化、血管球性肾炎(例如链球菌感染后的血管球性肾炎或IgA肾病)、假肢的松 动、显微镜的多脉管炎、混合的结缔组织病症、多发性骨髓瘤、癌和恶病体质、多器官病症、 髓发育不良综合征、睾丸炎、骨质溶解、胰腺炎、包括急性的、慢性的和胰脓肿、牙周病多肌 炎、渐进性肾衰竭、假性痛风、坏疽性脓皮病、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、结节病、硬化 性胆管炎、中风、胸腹的主动脉瘤修复(TAAA)、TNF受体相关的周期性综合征(TRAPS)、与黄 热病疫苗接种相关的症状、与耳相关的炎症性疾病、慢性耳炎症、或儿科的耳炎症、葡萄膜 炎、坐骨神经痛、前列腺炎、子宫内膜异位、脉络膜新血管形成、狼疮、Sjogren's综合征和湿 润黄斑变性。
71.权利要求69的方法，其中所述hTNFa相关的病症选自以下构成的组获得性免 疫缺陷疾病综合征、获得性免疫缺陷相关的疾病、获得恶性贫血、急性冠状动脉综合征、急 性的和慢性疼痛、急性自发性多发性神经炎、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官移 植相关的急性或慢性免疫疾病、急性炎性的脱髓鞘多神经根神经病、急性缺血、急性肝病、 急性风湿热、急性横贯性脊髓炎、阿狄森氏病、成年人(急性)呼吸窘迫综合征、成年人 Still' s病、酒精性肝硬变、醇类_诱导肝脏损伤、过敏性疾病、过敏症、脱发、斑形脱发、 阿尔茨海默氏病、过敏性反应、关节强硬性脊椎炎、关节强硬性脊椎炎相关肺病、抗磷脂抗 体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、关节病、哮喘、动脉粥样化疾病/动脉硬化、动脉粥样硬化、特异反应性过敏、特异反应性湿疹、特异反应性皮炎、萎缩性自体免疫甲状腺机能 减退、自体免疫大疱疾病、自体免疫性皮炎、自体免疫性糖尿病、与链球菌属感染相关的自 体免疫性病症、自体免疫性肠病、自体免疫性溶血性贫血症、自体免疫性肝炎、自体免疫性 听力丧失、自体免疫性淋巴组织增生的综合征(ALPS)、自体免疫性介导低血糖、自体免疫 性心肌炎、自体免疫性中性白细胞减少、自体免疫性卵巢功能早期衰退、自体免疫性血小板 减少(AITP)、自体免疫性甲状腺病、自体免疫性葡萄膜炎、闭塞性细支气管炎、白塞氏病、 睑炎、支气管扩张、大疱性天疱疮、恶病体质、心血管疾病、灾难性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈 脊椎病、衣原体、胆汁郁积、慢性活动性肝炎、慢性嗜酸细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性 免疫疾病相关用器官移植、慢性缺血、慢性肝脏疾病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、瘢痕天疱疮、 具有多发性硬化风险的临床上分离的综合征(CIS)、常见的可变的免疫缺陷、常见可变的 低丙种球蛋白血症、结缔组织疾病相关的间质肺病、结膜炎、库姆阳性溶血性贫血症、儿童 期发作的精神错乱、慢性阻塞性肺病(C0PD)、克罗恩氏病、起因不明的自体免疫性肝炎、起 因不明的纤维性肺泡炎、泪囊炎、抑郁症、皮炎硬皮症、皮肌炎、皮肌炎/多肌炎相关肺病、 糖尿病性视网膜病、糖尿病、扩张型心肌炎、盘状红斑狼疮、盘形疝形成、腰椎间盘突出、弥 漫性血管内凝血、药物_诱导的肝炎、药物_诱导的间质肺病、药物诱发的免疫性溶血性贫 血、心内膜炎、子宫内膜异位、内眼炎、肠病滑膜炎、巩膜表层炎、多形性红斑、主要多形性红 斑、雌性不育、纤维化、纤维化的肺病、妊娠期的天疱疮、巨细胞性动脉炎(GCA)、肾小球肾 炎、甲状腺肿的自体免疫性甲状腺机能减退(Hashimoto’ s病)、古德帕斯彻氏综合征、痛 风性关节炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)、Grave ‘ s病、B组链球菌(GBS)感染、急性感染 性多发性神经根神经炎(GBS)、含铁血黄素沉着病相关的肺疾病、枯草热、心力衰竭、溶血 性贫血、过敏性紫癜、乙型肝炎、丙型肝炎、Hughes综合征、亨廷顿氏舞蹈病、甲状腺机能亢 进、甲状旁腺机能减退、自发性白细胞减少症、自发性的血小板减少、自发性帕金森氏病、 自发性的间质性肺炎、特应性的肝脏疾病、IgE-介导的过敏症、免疫性溶血性贫血、包涵体 肌炎、传染性疾病、传染性眼睛炎性疾病、炎症性肠病、炎性髓鞘脱失病、炎性心脏病、炎性 肾病、胰岛素依赖型糖尿病、间质肺炎、IPF/UIP、虹膜炎、青少年的慢性关节炎、青少年的 恶性贫血、青少年类风湿性关节炎、Kawasaki ‘ s病、角膜炎、keratojuntivitis sicca、 Kussmaul疾病或Kussmaul-Meier疾病、兰德里麻痹、Langerhan' s细胞组织细胞增多病、 线性IgA疾病、网状青斑、Lyme关节炎、淋巴细胞的渗透性肺病、黄斑变性、男性不育症自发 性的或N0S、恶性肿瘤、肾的显微脉管炎、显微镜的多血管炎、混合结缔组织病相关的肺病、 Morbus Bechterev、运动神经元病症、粘膜天疱疮、多发性硬化(全部亚型基本的渐进性 的、继发性的渐进性的、复发减轻的，等等)、多器官衰竭、肌痛性脑炎/Royal Free病、重 症肌无力、脊髓发育不良综合征、心肌梗死、心肌炎、肾病综合征、神经根病症、神经病、非酒 精性脂肪肝、非甲非乙型肝炎、视神经炎、器官移植排斥、骨关节炎、骨质溶解、卵巢癌、卵巢 衰竭、胰腺炎、寄生虫的疾病、帕金森氏病、少关节的JRA、天疱疮、落叶状天疱疮、寻常天疱 疮、外周动脉闭塞疾病(PA0D)、周围性血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、晶状体源性葡 萄膜炎、静脉炎、多发性结节性动脉炎(或结节性动脉周围炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、 灰发症、多关节的JRA、多内分泌腺的缺陷综合症、多肌炎、多腺体缺陷I型和多腺体缺陷 II型、风湿性多肌痛(PMR)、传染后的间质的肺病、炎症后的间质的肺病、Post-Pump综合 征、卵巢功能早期衰退、夏科氏肝硬变、原发的黏液腺瘤病、原发性帕金森氏综合征、原发性硬化性胆管炎、原发性硬化性肝炎、原发性脉管炎、前列腺和直肠癌和造血恶性肿瘤(白血 病和淋巴瘤)、前列腺炎、银屑病、1型银屑病、2型银屑病、银屑病性关节炎、银屑病性关节 病、继发于结缔组织疾病的肺动脉高血压、多发性结节性动脉炎的肺部表现、纯红血球发育 不全、原发性肾上腺机能不全、放射后肺纤维化、反应性关节炎、莱特尔氏病、复发性的德维 克氏病、肾病N0S、再狭窄、类风湿性关节炎、类风湿性关节炎相关的间质肺病、风湿性心脏 病、SAPH0(滑膜炎、粉刺、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、结节病、精神分裂症、Schmidt' s综合 征、硬皮症、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不全、败血 症综合征、脓毒性关节炎、脓毒性休克、血清反应阴性的关节痛、硅酮相关的结缔组织疾病、 Sj6gren，s病相关的肺病、Sjogren's综合征、Sneddon-ffilkinson皮肤病、精子自体免 疫、脊柱关节病、强直性脊柱炎、多形糜烂性红斑(SJS)、Still' s病、中风、交感性眼炎、全 身性炎性反应综合征、全身性红斑狼疮、全身性红斑狼疮相关的肺病、全身性硬化、全身性 硬化相关的间质肺病、Takayasu's病/动脉炎、颞动脉炎、Th2型和Thl型介导疾病、甲状腺 炎、中毒性休克综合征、弓形虫视网膜炎、中毒性表皮坏死溶解、横贯性脊髓炎、TRAPS (肿瘤 坏死因子受体、伴有黑棘皮病的B型胰岛素抗性、1型过敏性反应、1型自体免疫性肝炎(标 准的自体免疫或狼疮样肝炎)、2型自体免疫肝炎(抗LKM抗体肝炎)、11型糖尿病、肠溃疡 性关节病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、普通的间质性肺炎(UIP)、葡萄膜炎、脉管炎弥散性肺病、 脉管炎、春季结膜炎、病毒视网膜炎、白斑病、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、 眶坏死性肉芽肿病、湿润黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关关节病。
72.权利要求19的抗体晶体用于制备治疗hTNFa相关疾病的药物组合物的用途。
73.一种包含hTNF抑制剂的晶体的药物组合物，其中所述晶体的生物利用率和安全性 相对于所述hTNF抑制剂的液体组合物不降低。
全文摘要
本发明涉及结晶抗人类TNFα(hTNFα)抗体和抗体片段的批量结晶方法，其容许在工业规模上生产所述抗体；控制抗体晶体例如，抗-hTNFα抗体片段的晶体的大小的方法，包含所述晶体的组合物以及利用所述晶体和组合物的方法。
文档编号A61K39/395GK101980722SQ200880111485
公开日2011年2月23日 申请日期2008年8月8日 优先权日2007年8月8日
发明者D·W·博尔哈尼, G·温特, S·戈特沙尔克, W·弗劳恩霍菲尔 申请人:雅培制药有限公司