专利名称：作为转录调节剂的Tcl1的制作方法
作为转录调节剂的TcM发明人Carlo Μ. Croce, Yuri Pekarsky相关申请的交叉参考本申请要求2008年11月21日提交的美国临时申请号61/116，786的优先权，其全部内容明确地通过引用方式并入本文。关于联邦政府支持研究的声明本发明在国立癌症研究所基金POl CA081534的政府支持下做出。政府享有本发明的一些权益。本发明的技术领域和工业实用性本发明大体上涉及分子生物学领域。更具体地，其涉及通过抑制受试者细胞中的 Tcll的失调节(deregulation)来抑制受试者中成熟B细胞白血病的发生。本发明的一些方面包括在与B细胞淋巴细胞性白血病相关的病症的诊断、治疗和预后中的应用。
背景技术：
不承认本部分中公开的背景技术在法律上构成现有技术。B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的淋巴细胞多数是具有成熟外观和 B220+⑶5+表型的静息细胞。T细胞白血病/淋巴瘤I(Tcll)癌基因是作为T细胞幼淋巴细胞性白血病中14g31. 2处的染色体转位和倒置的靶标被发现的。在B细胞中过表达TCLl的转基因小鼠产生攻击形式的B-CLL，并且攻击性的人类 B-CLL过表达Tcll，这表明TCLl的失调节在攻击形式的B-CLL的发病中具有关键性的重要意义。以前，本文的发明人已经证明了 Tcll是Akt癌蛋白的共激活剂，Akt是T细胞中的重要的抗凋亡分子。最近报道在T细胞中组成型表达活性的十四烷基化Akt的转基因小鼠产生T细胞白血病。这些结果说明Akt可能引起T细胞中的Tcll介导的淋巴瘤发生。 在小鼠B细胞中，Akt可以通过纯合缺失Pten而被强烈地活化。令人惊奇的是，这些小鼠不产生B细胞恶性质，这说明B细胞中Tcll的失调节引起B-CLL，但其机理不是通过Akt的激活。最近关于转基因小鼠模型的研究证明了 NF-KB途径在B-CLL中的重要性。例如， 诱导增殖的TNF配体(APRIL)(其是参与NF-KB激活的TNF超家族的成员)的转基因表达导致B220+⑶5+细胞的显著扩增。虽然就这些疾病治疗进行了相当多的研究，但仍然难以有效诊断和治疗它们，在患者中观察到的死亡率表明需要就这些疾病的诊断、治疗和预防作出改进。
发明内容
在第一个广泛的方面，本文描述了用于抑制受试者中形成成熟B细胞白血病的方法，包括抑制所述受试者中Tcll的失调节。在另一个广泛的方面，本文提供了用于抑制受试者中形成成熟B细胞慢性白血病(B-CLL)的方法，包括通过下列一项或多项抑制受试者的细胞中的Tcll的过表达i)抑制细胞中的NF-K B途径；和ii)激活细胞中的激活剂蛋白l(AP-l)。在另一个广泛的方面，本文提供了治疗具有B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病的受试者的方法，包括施用治疗上有效量的组合物，所述组合物能够通过下列一项或多项抑制T细胞白血病/淋巴瘤I(Tcll)的过表达i)抑制细胞中的NF-κ B途径；和ii)激活细胞中的激活剂蛋白1 (AP-I)。在另一个广泛的方面，本文提供了治疗受试者中的B细胞慢性淋巴细胞性白血病 (B-CLL)相关疾病的方法，包括测定相对于对照细胞的Tcll而言，所述受试者的细胞中表达的至少Tcll的量；通过向所述受试者施用治疗上有效量的至少一种通过下列一项或多项抑制Tcll的表达的化合物来改变所述受试者中表达的Tcll的量i)抑制细胞中的 NF-kB途径；和ii)激活细胞中的激活剂蛋白l(AP-l)，从而抑制所述受试者中B-CLL相关疾病的发展。在另一个广泛的方面，本文提供了测定用于预防、诊断和/或治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病的治疗法的有效性的方法，包括使动物经历其有效性待测定的治疗法，和通过评价Tcl 1的至少一种生物标志物来确定所测定的治疗法在治疗或预防B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病中的有效性水平。在一些实施方式中，候选治疗剂包括下列一种或多种药物组合物、营养组合物和顺势疗法组合物。另外，在一些实施方式中，所测定的治疗法是用于人类受试者。在另一个广泛的方面，本文提供了干扰B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病应答信号传导途径的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中 B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包括Tcll的至少一种生物标志物。在另一个广泛的方面，本文提供了在有此需要的个体中治疗、预防、逆转或限制B 细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病并发症的严重性的方法，包括向所述个体施用干扰至少一种B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包括Tcll 的至少一种生物标志物，其i)抑制细胞中的NF-κΒ途径；和/或ii)激活细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)的表达。在另一个广泛的方面，本文提供了干扰至少一种B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病应答级联的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中与癌症相关的疾病并发症的严重性，其中所述试剂包括Tcll的至少一种生物标志物，其 i)抑制细胞中的NF-K B途径；和/或ii)激活细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)的表达。在另一个广泛的方面，本文提供了与Tcll上的表位结合的抗体，其中所述抗体调节下列至少一项所述表位与激活剂蛋白I(AP-I)之间的相互作用。在另一个广泛的方面， 本文提供了包含此类抗体的药物组合物。在另一个广泛的方面，本文提供了治疗哺乳动物中的B-CLL疾病状态的方法，在所述疾病状态中激活剂蛋白I(AP-I)的活性有改变，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的抗体，所述抗体能够与Tcll蛋白上的表位结合，从而调节激活剂蛋白 1 (AP-I)的Tcll增强的活性。在另一个广泛的方面，本文提供了治疗哺乳动物中的B-CLL疾病状态的方法，在所述疾病状态中激活剂蛋白I(AP-I)的活性有改变，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的激活剂蛋白I(AP-I)的肽片段，其中所述肽片段与激活剂蛋白I(AP-I)结合，从而调节激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激酶活性。在另一个广泛的方面，本文提供了包括Tcll模拟物的化合物，其中所述Tcll模拟物与任意细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)结合并且在模拟激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激活中有功能性活性。在另一个广泛的方面，本文提供了治疗哺乳动物中的疾病状态的方法，在所述疾病状态中激活剂蛋白I(AP-I)的活性有改变，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的Tcll模拟物，其中所述Tcll模拟物与激活剂蛋白I(AP-I)结合，从而活化激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激酶活性。在另一个广泛的方面，本文提供了包括Tcll拮抗剂的化合物，其中所述Tcll拮抗剂与任意细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)结合并且在调节激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激活中有功能性活性。根据下面的优选实施方式的详细描述并结合附图，本发明的多个目标和优点对于本领域技术人员将变得明显。
本专利或申请文件中可以包含有颜色的一幅或多幅附图和/或一幅或多幅照片。 在提出请求并缴纳必要的费用之后，专利局将提供带有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开的副本。图1A-1C =Tcll激活NF-k B依赖性的转录。图IA 通过对口腔拭子组成性DNA、B-CLL DNA测序而获得的T381、E40D、R52H突变周围的序列的色谱图，以及使用来自B-CLL细胞的RNA进行的RT-PCR(针对T381突变) 的结果。图 IB :Tcll 激活 NF-k B。以 50ng pNF-kB-Luc 报告子和 50ngpRL_TK Renilla 报告子构建体共转染NIH 3T3细胞。此外，使用了 Uyg CMV5-空载体，或者0. 75 μ g CMV5-空载体与0. 75 μ g CMV5-TcIlffT或CMV5_Tcll T381构建体的组合。如所标示，加入 5ng pFC-MEKK。如所标示，以200nmol/L渥曼青霉素过夜处理细胞。将以CMV5-空载体转染的NIH 3T3细胞中pNF-kB-Luc的校正的启动子活性设定为1。图IC :Tcll与p300相互作用。(上面的图板)以p300_HA和Omni-Fhit，或以 P300-HA和Omni-I1cIl构建体共转染一些293细胞。裂解后，以抗_HA，IgG，或抗-omni抗体进行免疫沉淀。如所标示，进行Western印迹分析。(下面的图板)裂解Daudi细胞并以抗-Tcll抗体，IgG或抗-p300抗体进行免疫沉淀。Tcll图板中的未标记的较高的条带代表IgG。按照标示进行Wfestern印迹分析。图2A-2G =Tcll 抑制 AP-I 活性图2A 以500ng pAP-l-Luc报告子和50ng pRL-TK Renilla报告子构建体共转染一些四3细胞。此外，使用了 1. 5μ g CMV5-空载体，CMV5-Tcll WT，或突变体构建体和2. 5ng pFC-MEKK(如所标示)。如所标示，以200nmol/L渥曼青霉素过夜处理细胞。将以CMV5-空载体转染的HEK293细胞中pAP-1-Luc的校正的启动子活性设定为1。
图2B 与图2A相同，区别在于不是使用pFC-MEKK构建体，而是加入5ng c-Fos-V5, c-Jun, JunB,或者 5ng c_Fos_V5 与 S ng c-Jun 或 JunB 的组合。图 2C 以 c-Fos-V5 和 CMVS-iTc 11 WT，或以 c-Fos_V5 和 CMVS-iTc 11T381 构建体共转染一些293细胞。裂解后，以抗-c-Fos，IgG，或抗-Tcll抗体进行免疫沉淀。如所标示进行Western印迹分析。图 2D-2F =Wmyc-iTcll T381 或 myc-Fhit 与 c-Fos_V5(图 2D)，c-Jun-HA (图 2E)， 或JimB (图2F)共转染一些293细胞，如所标示。裂解后，以抗-myc，IgG，和抗-c-Fos (图 2D)，抗-HA (图2E)，和抗-JimB (图2F)抗体进行免疫沉淀。以标示的抗体进行Western印迹分析。图2G 以myc-Tcll转染一些293细胞，并以50ng/mL PMA和1 μ g/mL离子霉素 (ionomycin)处理以增加内源性c-Jun的表达，2小时后，进行裂解。以抗-c-Jun，IgG或抗-myc抗体进行免疫沉淀。图2H 以50ng/mL PMA和1 μ g/mL离子霉素处理Daudi细胞，2小时后进行裂解。 以抗-Tcll，IgG或抗-c-Jun抗体进行免疫沉淀。图 3 c-Jun, c-Fo s 禾Π Tcll 的细胞内定位。以 c-Jun-HA，c-Fos_V5 和 Omni-iTcll 构建体共转染一些四3细胞。16小时后，将细胞固定、渗透化并以大鼠抗-HA、小鼠抗-c-Fos 和兔抗-omni抗体进行免疫染色。使用二抗山羊抗-大鼠Alexa Fluor 647、山羊抗-小鼠Alexa Fluor546和山羊抗-兔Alexa Fluor 488抗体来显示c-Jun (蓝色)、c-Fos (红色)和Tcll (绿色)的细胞内定位。以黄色显示c-Fos和Tcll的共定位。图4A-4C =Tcll抑制MEKKl介导的细胞死亡图 4A 以 1. 5 μ g pCMV5-空载体、0· 5 μ g pFC-MEKK 和 1 μ gpCMV5_ 空、pCMVS-I^cll WT或pCMV5-Tcll T38I构建体转染一些293细胞。按照本文的描述进行^festern印迹分析。图 4B-4C 以 1. 5 μ g pCMV5_ 空载体或 0. 5 μ g pFC-MEKK 禾口 1 μ g pCMV5-空或 pCMV5-Tcll WT构建体转染一些293细胞。16小时后，将细胞固定、渗透化并以Hoechst 33342染色。图4B 凋亡细胞的百分率。对于每个转染，选择至少20个视野以计数死亡细胞 (由片段化的细胞核指示)的百分率。图4C 通过使用共聚焦显微镜显示同一实验的结果。
具体实施例方式在本公开中，通过辨识引用提及了多篇公开物、专利和公开的专利申请书。这些公开物、专利和公开的专利申请书的公开内容在此通过引用方式并入本公开，以更完整地描述本发明相关领域的状况。本发明至少部分地基于本发明人的下列发现Tcll作为转录调节剂发挥作用，并且直接参与慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的发病。B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)是最常见的人类白血病。小鼠B细胞中的 T细胞白血病/淋巴瘤1 (TCLl)的失调节引起CD5阳性的白血病，其类似于侵袭性的人类 B-CLL。为了检测Tcll蛋白在B细胞中发挥致癌活性的机理，本发明人在本文中研究了 Tcll
7的表达对于NF-κ B和激活剂蛋白I(AP-I)活性的影响。现在在本文中证明了 Tcll与c-Jun、JunB和c-Fos物理地相互作用，并且抑制 AP-I的转录活性。另外，Tcll通过与p300/CREB结合蛋白物理地相互作用而激活NF-κ B。 对600例B-CLL样品中的TCLl基因进行了测序，发现了 2个杂合突变Τ38Ι和 R52H。注意到这两个突变体都显示获得了作为AP-I抑制剂的功能。结果表明Tcll的过表达通过直接增强NF- κ B的活性和抑制AP-I而引起B-CLL。制备了 B-CLL特异性的功能获得性Tcll突变体。对600例B-CLL样品中的TCLl 基因进行了测序。对所有的编码TCLl外显子的测序分析鉴定到2个杂合突变，其导致氨基酸置换Τ38Ι和R52H(图1A)。第一位患者的正常口腔拭子DNA未显示T38I突变(图1A)。在匹配的正常口腔拭子DNA中也存在R52H突变(图IA右侧)，这显示出组成型变异。RT-PCR结果显示T38I 突变体TCLl mRNA是B-CLL来源中主要表达的等位基因，占TCLl mRNA的80%，而R52H等位基因是表达的唯一的等位基因(图1A)。为了测定Tcll表达是否影响NF-K B的反式激活活性，使用基于有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶1 (MEKKl)的能力的系统来激活NF- κ B报告子构建体pNF- κ B-Luc,该构建体在NF- κ B应答元件的控制下表达萤光素酶。以图IB中标示的构建体转染NIH 3Τ3细胞。图IB显示Tcll将NF-κ B的活性激活大约4倍(50相对于1 ，而这2个突变体将活性激活2-3倍。由于Tcll是Akt的共激活剂，所以有可能NF- κ B的这种激活是由于Tcll激活 Akt而造成的。为了排除这种可能性，在存在渥曼青霉素的情况下进行了相同的实验，渥曼青霉素是ΡΙ3-激酶抑制剂(渥曼青霉素完全抑制Akt的活性)。图IB显示渥曼青霉素不影响Tcll激活NF- κ B的能力；在存在渥曼青霉素的情况下，Tcll的表达将NF-κ B激活>4倍(78相对于16)；而Tcll突变体的表达引起2. 5_3 倍的激活。此外，在与Akt的免疫共沉淀实验中，野生型(WT)I1cIl和Τ38Ι突变体未显示出任何差异(数据未显示)。这些数据显示Tcll通过独立于Akt的机理激活NF-κ B。为了阐明这种激活的分子机理，通过在293细胞中进行共转染进行了 Tcll与 NF-k BLNF-k B2, RelA, RelB和c-Rel之间的免疫共沉淀。没有发现Tcll与NF-κ B家族的成员之间的物理相互作用的证据(数据未显示)。转录激活剂CREB结合蛋白/ρ300是广泛的细胞核转录因子，其参与数种信号传导途径(包括NF-kB途径)介导的反式激活。由于Ρ300是NF-K B的共激活剂，所以本发明人在本文中研究了 Tcll是否与Ρ300相互作用。首先进行了免疫共沉淀实验，将标签化的 Tcll和ρ300构建体共转染进入293细胞。图IC上面的图板显示ρ300与Tcll免疫共沉淀，在ρ300免疫复合物中检出了 1^11。作为阴性对照，在p300与!^hit之间未检测出免疫共沉淀。为了证明所检出的相互作用不是这两种蛋白过表达的结果，在显示出中等水平的 Tcll表达的Daudi Burkitt淋巴瘤细胞中进行了免疫共沉淀实验。图IC下面的图板显示在Tcll免疫复合物中检出了 p300，Tcll与p300免疫共沉淀。这证明Tcll通过与P300的相互作用而诱导NF-K B依赖性转录，可能改变其构象并增
8强其作为NF- κ B共激活剂发挥作用的能力。结果证明相对于野生型Tcll，Tcll突变体激活NF- κ B依赖性转录的程度较低 ( 3倍相对于4倍)。现在，本发明人相信NF- κ B的激活在B-CLL的发病中具有重要意义。另外，本发明人现在证明了 Tcll突变体在NF-kB的激活中不显示出功能的获得。此外，在与Ρ300的免疫共沉淀实验中，Tcll Τ38Ι突变体蛋白与野生型Tcll是相似的(数据未显不)ο本发明人研究了 Tcll是否能够抑制AP-I依赖性转录。为了测定AP-I的活性，使用基于MEKKl的能力的系统来激活AP-I报告子构建体pAP-1-Luc，其在AP-I应答元件的控制下表达萤光素酶。以图2Α-2Η中标示的构建体转染一些293细胞。本发明人在本文中还研究了野生型Tcll和突变体是否抑制293细胞中内源性AP-I的活性。以MEKKl转染293 细胞以激活AP-I。图2Α显示ΑΡ-1的活性被MEKKl诱导652倍。1^11的表达抑制了 ΑΡ-1依赖性的反式激活 2. 5倍，而Tcll Τ38Ι引起显著性的 100倍抑制(652相对于6. 3)。R52H突变体也显示出比野生型Tcll更强的效应(176相对于观7，与652进行比较)。在经渥曼青霉素处理的细胞中获得了相似的结果(图2Α)。Tcll的表达抑制了 AP-I依赖性的反式激活-2. 5倍，而T 381突变体引起150倍的抑制(981相对于6. 5)。这些结果表明Tcll对 AP-I的抑制不依赖于Akt。为了测定Tcll是否抑制AP-I复合物中的单个成分，使用野生型Tcll和T38I突变体进行了相似的实验。单一的AP-I成分的过表达激活AP-1，而不是通过使用MEKKl。图2B左侧显示Tcll抑制单独的c-Fos，c-Jun和Jun_B，而TcllT38I突变体对 c-Fos, c-Jun和Jun-B的抑制更加有效，达到2倍。以c-Jun/c-Fos和JunB/c-Fos异二聚体获得了相似的结果(图2B右侧)。在所有这些情况下，Tcll T38I突变体比野生型Tcll的抑制效应更强。这些结果 (图2A和图2B)强烈说明Tcll突变体在AP-I抑制中显示出功能获得性效应。为了解释这种抑制的机理，进行了一系列免疫共沉淀实验。图2C-2F显示了使用瞬时表达的蛋白质进行的这些实验的结果。相对于野生型Tcll，T38I突变体蛋白显示出更强的与c-Fos的免疫共沉淀(图2C下面的图板相对于图2C上面的图板)，这说明了与其对 AP-I的更强烈抑制之间的关系(相对于野生型Tcll)。该相互作用的特异性显示于图2D ； 在两个方向iTcll都与c-Fos免疫共沉淀，而在i^hit (用作阴性对照)和c-Fos之间没有检测到阳性的免疫共沉淀物(图2D下面的图板相对于图2D上面的图板)。类似地，Tcll与c-Jun免疫共沉淀，但!^hit不与c-Jun免疫共沉淀(图2E)，并且，Tcll与JunB免疫共沉淀，但!^hit不与JunB免疫共沉淀(图2F)。图2G显示在四3细胞中，内源性c-Jun与转染的Tcll免疫共沉淀，在内源性 c-Jun的免疫复合物中检测出Tell。在图2H中显示了 Daudi细胞中内源性Tcll与c-Jun 的物理相互作用。Tcll存在于内源性c-Jun的免疫复合物中，并且c-Jun与Tcll免疫共沉淀。在这些实验中(图2G和图2H)，由于c-Jim的表达水平极低，所以，以佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和离子霉素预处理细胞。这样的处理显著诱导了 293和Daudi 细胞中c-Jim的表达。至少部分基于图2A-2H中描述的这些结果，本发明人在本文中现在相信Tcll与AP-I的成分物理地相互作用并且作为AP-I抑制剂发挥作用。在B-CLL患者中鉴定的两种Tcll突变体在该途径中都显示出功能获得性特性，这一事实说明Tcll抑制 AP-I依赖性转录的能力在B-CLL的发病中具有关键意义。Tcll位于细胞核和细胞质中。然而，c-Jim和C-Fos主要是细胞核中的蛋白。为了测定Tcll-AP-I复合物的细胞内定位，在293细胞中进行了免疫荧光实验。图3显示了 Tcll、c-Jun和c-Fos在4个不同视野中的细胞内定位。c-Jun(蓝色)和c-Fos (红色)在细胞核中共定位。然而，Tcll (绿色)定位于细胞核和细胞质。图3右侧显示Tcll-AP-I 复合物(黄色)定位于细胞核内的独特区室中。这些数据作为额外的证据证明了 Tcll通过直接结合而抑制AP-I的功能。Tcll通过直接参与转录复合物而诱导NF- κ B依赖性转录并抑制AP-I依赖性转录(图1和图幻；因此，本发明人在本文中现在相信Tcll的这些作用将导致细胞死亡抑制。 由于MEKKl通过c-jim N-末端激酶(JNK)和AP-I激活诱导293细胞的凋亡，所以，本发明人使用了表达MEKKl (其在图2中用于诱导AP-1)的激酶结构域的构建体。图4A-C显示Tcll确实在293细胞中抑制AP-I介导的细胞凋亡。在凋亡和非凋亡细胞中都存在聚(ADP-核糖)聚合酶I(PARPl)的116-kDa完整形式，而仅在凋亡细胞中存在85-kDa的切割的PARPl同种型。MEKKl的表达引起切割的85_kDa PARPl的出现(图 4A)。Tcll的表达使该85-kDa条带的强度降低，而Tcll T38I突变体的表达使85_kDa PARPl的表达进一步减少(图4A)。这说明"Tell抑制MEKKl诱导的293细胞的凋亡，Tcll T38I突变体的表达导致更强烈的抑制。为了评估凋亡细胞的数目，测定了转染后20小时的293细胞中片段化的细胞核的数目。图4B和图4C显示MEKK1转染转染引起293细胞中30%的凋亡，Tcll表达将凋亡减少至12. 5%。这些结果说明Tcll抑制AP-I激活引起的凋亡。Tcll作为AP-I抑制剂发挥作用，因此提供了关于涉及B-CLL发生的分子机理的重要领悟。体细胞T38I突变体显示出功能获得性特性，这一事实极大地加强了这些结果的重要性。R52H突变存在于相同患者的组成型DNA中，并且也引起AP-I抑制中的功能的获得。 不希望被理论束缚，本发明人在本文中相信这种变化代表罕见的多态性，其引起对B-CLL 的遗传上的易感性。Tcll与转录因子例如p300和AP-I成分之间的物理相互作用提供了 Tcll功能的新的分子机理，并且证明Tcll的这种功能不依赖于Akt。此外，由于Tcll与不同结构和功能的多种蛋白(例如Akt，p300，c_Jun和c_Fos) 结合，所以本发明人在本文中现在相信Tcll具有其它的功能(例如，作为转运子)。本文中描述的本发明人的发现现在证明，抑制NF-K B或激活AP-I的方法可用于治疗侵袭形式的B-CLL。通过以下实施例进一步描述本发明，其中，除非另有指明，否则所有的份数和百分数都是按重量计，所有的温度都是摄氏度。应该理解，虽然这些实施例指明了本发明的优选实施方式，但仅是以举例说明的方式给出。从上面的讨论和这些实施例中本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且可以在不脱离其精神和范围的情形下对本发明作出多种变化和修饰，以适应于多种应用和状况。本说明书中提及的所有公开物，包括专利和非专利文献，明确地通过引用方式并入。实施例TffeB-CLL样品、基因组测序和RT-PCR在知情同意之后，从来自CLL Research Consortium的被诊断患有B-CLL的患者获取总共 600 例 B-CLL 样品。研究得到 hstitutional Review Board of Ohio State University的批准。简而言之，从CLL患者获取血液，通过FicolΙ/Hypaque梯度离心 (Amersham)分离淋巴细胞并使用标准的TRlzol方法进行处理以提取RNA。用于基因组DNA PCR和测序的寡核苷酸是TCL1_149F,5' -CATGCTGCCCGGATATAAAG-3‘ [SEQ ID NO 1]；TCL1_539R,5' -TGCCTGGAGAACTCCTATTCAT-3‘ [SEQ ID NO 2]；TCL13 1 F,5' -GAAGTGAGCTTCAGGGAACAGT-3‘ ；[SEQ ID NO 3]；禾口CL1_880R,5' -ACAGCCACTGTGGACTAAGAGG-3‘ [SEQ ID NO :4]。用于RT-PCR和测序的寡核苷酸是TCL1D5,5' -CCTGTGGGCCTGGGAGAAGT-3‘ [SEQ ID NO :5]和TCL1R5,5' -TCCTCCACGCCGTCAATCTT-S‘ [SEQ ID NO :6]。DNA构津体使用标准程序将全长人TCLl和ΠΠΤ ORF克隆进入pcDNA4-HisMaxC载体(分别是 Omni-iTclLOmni-Fhit) Qnvitrogen)。另外将全长人 TCLl ORF 克隆进入 pCMV5 载体以获得pCMVS-I^cl 1 WT构建体。通过使用来自Mratagene的基于标准PCR的诱变试剂盒创建pCMVS-I^cll T381和pCMVS-I^c 11 R52H构建体。将野生型和突变体TCLl和FHIT ORF克隆进入pCMV_2xMyc载体，该载体改良自ρCMV-Myc载体(BD Biosciences)，在其中添加了 Myc标签，从而在5’和3’末端都具有Myc标签。得到的构建体被命名为2XMyC-TCll WT, 2xMyc-TcllT38I 和 2xMyc_Fhit。用于c-Jun和JunB的哺乳动物表达构建体(在pCMV_SP0RT6载体中)购自ATCC。 通过将 c-Jun ORF 插入至 pCMV-HA 载体(BD Biosciences)来构建 c_Jun-HA。c-Fos_V5 构建体购自 Invitrogen。p300_HA 构建体购自 Upstate Biotechnology。Akt-HA 构建体以前 ΒτΤ δ (Pekarsky Y. ， et al. (2000) Tcll enhances Akt kinase activity and mediates its nuclear translocation ；Proc Natl Acad Sci USA97 :3028-3033)。双萤光素酶报告子检测系统和Renilla萤光素酶报告子载体pRL_TK购自！Iomega。AP-I报告子载体pAPl-Luc，NF-KB报告子构建体pNF-kB_Luc和处于CMV启动子控制下编码MEKKl的激酶结构域的构建体pFC-MEKK购自Stratagene。细胞培养、转染、Western印迹分析和免疫沉淀NIH 3T3和四3细胞于37 °C补充了 10 % FBS和100. sg/L庆大霉素的RPMI 1640培养基中培养。FuGene 6转染试剂和蛋白酶抑制剂混合物片剂获自Roche。进行转染(除了萤光素酶测定实验之外)、细胞裂解物制备和Western印迹分析。使用Pierce ECLffesternS Thermo Scientific ^ SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate使免疫印迹显色。所使用的抗体是抗-Tell (sc-32331用于 Western印迹分析和与p300的免疫沉淀；sc-11156和sclll55用于与c-Jun的免疫沉淀)，抗-Omni (sc-7270用于免疫沉淀和Wfestern印迹分析；sc-499用于免疫荧光)，抗-p300 (sc-32244)，抗-Myc (9E10)，抗-Myc-HRP (9E10)，抗-c-Jun (sc-1694 用于免疫沉淀)，抗-Jung (sc-8051用于免疫沉淀；sc-46用于^festern印迹分析)，抗-c-Fos (sc-447 用于免疫沉淀和免疫荧光)(Santa Cruz Biotechnology)，抗-c-Jun (6103 用于 ^festern 印迹分析，BD Biosciences)，抗-HA(HA. 1 1) (Covance)，抗-V5-HRP(Invitrogen)，大鼠抗-HA (用于免疫荧光)和抗-HA-HRP (Roche)。免疫荧光HEK293细胞生长于人纤连蛋白Cellware 2_孔培养板(BD Biosciences)中。以 Zeiss LCM 510共聚焦显微镜进行免疫荧光实验。用于免疫荧光的二抗如下山羊抗-小鼠 Alexa Fluor M6 (红色)，山羊抗-大鼠Alexa Fluor 647 (远红色)和山羊抗-兔Alexa Fluor 488(绿色)，均购自 Invitrogen0帝光素酶测定以所标示的构建体转染NIH 313或四3细胞。使用双萤光素酶测定系统(Promega) 测定萤火虫和海肾萤光素酶活性，按照生产商的建议，将萤火虫萤光素酶活性针对海肾萤光素酶活性进行校正。所有的实验按照一式三份进行，并以一致性的结果重复三次。细胞死亡分析通过以10. sg/mL Hoechst 33342 (Invitrogen)染色并统计显示出片段化的细胞核的细胞数目来测定凋亡情况。还使用了替代性的凋亡检测方法。以1.5yg pCMV5-空载体，或以0. 5yg pFC-MEKK禾口 1 μ g pCMV5_空载体或pCMV5_Tcll WT或pCMVS-I^cll T381 构建体转染HEK293细胞。M小时后，收集并裂解死的和活的细胞。以抗-PARPl抗体(556362 ； BD Biosciences)探测这些裂解物。116_kDa完整形式的PARPl存在于非凋亡和凋亡细胞中。85-kDa PARPl切割片段仅存在于凋亡细胞中。治疗性/预防性方法和组合物本发明提供了通过向受试者施用有效量的治疗剂即本发明的单克隆(或多克隆) 抗体、病毒载体、Tcll模拟物或Tcll拮抗剂进行治疗和预防的方法。在优选的方面，所述治疗剂是实质上纯化的。所述受试者优选是动物，包括但不限于动物例如牛、猪、鸡等，优选是哺乳动物，最优选是人。已知有多种递送系统并用于施用本发明的治疗剂，例如包封于至脂质体、微颗粒、 微胶囊中，由重组细胞表达、受体介导的细胞内吞、构建治疗性核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分，等等。导入方法包括但不限于，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和口服途径。通过任何方便的途径施用化合物，例如，通过输注或推注，经由上皮或粘膜与皮肤内衬(例如口粘膜、直肠和小肠粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性试剂一起施用。可以全身性地或局部地施用。此外，可能需要将本发明的药物组合物通过任意合适的途径导入中枢神经系统，所述途径包括脑室内和鞘内注射；可以通过脑室内导管(例如连接于库， 例如Ommaya库)来促进脑室内注射。在一个具体的实施方式中，可能需要向有治疗需要的区域局部施用本发明的药物组合物；这可以通过例如但不限于下列方式实现手术过程中的局部输注；表面施用，例如，在手术后联合伤口敷料一起施用；通过注射；通过导管的方式；通过栓剂的方式；或通过植入物的方式，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶的材料，包括膜，例如sialastic膜， 或纤维。在一个实施方式中，通过在恶性肿瘤或瘤性组织或前瘤性组织的位点(或之前的位点)处直接注射来施用。在治疗剂是编码蛋白质治疗剂的核酸的一个具体实施方式
中，通过如下方式在体内施用所述核酸以促进其所编码的蛋白质的表达将所述核酸构建为适当的核酸表达载体的一部分，并施用所述载体，从而使其变为细胞内的，或者以脂质或细胞表面受体或转染试剂进行包被；或者，将所述核酸与已知会进入细胞核的同源盒样肽连接来施用所述核酸。或者，可以通过同源重组而细胞内地导入核酸治疗剂并将其掺入到宿主细胞DNA中以进行表达。本发明还提供了药物组合物。此类药物组合物包含治疗上有效量的治疗剂和药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体包括但不限于，盐水、缓冲液盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。所述载体和组合物可以是无菌的。制剂将适合于施用方式。如果需要，组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊、延释制剂或粉末。可以使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酸酯将组合物配制为栓剂。口服制剂可以包含标准的载体，例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在一个优选的实施方式中，根据常规程序将组合物配制为适于向人类静脉内施用的药物组合物。通常而言，用于静脉内施用的组合物是处于无菌等渗水性缓冲液中的溶液。 如果必要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因，以缓解注射位点的疼痛。 一般而言，各成分分开地或单位剂型混合的形式提供，例如，作为冻干的粉末或不含水的浓缩物，装在密封的容器例如安瓿或小袋中，标明活性剂的量。当通过输注施用组合物时，将其配制在含有无菌药物级水或盐水的输注瓶内。当通过注射施用组合物时，提供一安瓿量的用于注射的无菌水或盐水，以在施用前将各成分混合。本发明的治疗剂配制为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括那些与游离氨基形成的盐，例如那些衍生自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些与游离的羧基形成的盐，例如那些衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。有效治疗特定病症或病况的本发明治疗剂的量将取决于该病症或病况的性质，并且由标准临床技术来确定。此外，任选地，可以使用体外测定法辅助确定最适剂量范围。制剂的精确剂量还取决于施用途径，以及疾病或病症的严重程度，根据医生的判断和每位患者的情况而定。然而，用于静脉内施用的合适的剂量范围一般是大约20-500微克活性化合物/千克体重。用于鼻内施用的合适的剂量范围一般是大约0. 01pg/kg体重至lmg/kg体重。可以从来自体外或动物模型测试系统获得的剂量-应答曲线来外推有效剂量。本发明还提供了包含装有本发明药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器的药包或试剂盒。任选地，所述容器带有监管药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的介绍，该介绍反映被该机构批准用于人类施用的生产、使用或销售。虽然已经通过参考多个和优选的实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解可以不脱离本发明的本质范围而做出多种改变和对其要素进行等同替换。此外，可以不脱离其本质范围而对本发明的教导进行很多修饰以适用于特定的状况或材料。
权利要求
1.用于抑制受试者中发生成熟B细胞慢性白血病(B-CLL)的方法，包括通过下列一项或多项抑制所述受试者的细胞中Tcll的过表达i)抑制细胞中的 NF-kB途径；和ii)激活细胞中的激活剂蛋白l(AP-l)。
2.用于治疗侵袭形式的B-CLL的药物组合物，其包含抑制NF-κ B和/或激活AP-I的成分。
3.治疗具有B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病的受试者的方法，包括施用治疗上有效量的成分，所述成分能够通过下列一项或多项抑制T细胞白血病/淋巴瘤I(Tcll)的过表达i)抑制细胞中的NF-K B途径；和ii)激活细胞中的激活剂蛋白 1 (AP-I)。
4.包含能够抑制T细胞白血病/淋巴瘤1(Tcll)过表达的成分的药物组合物。
5.治疗受试者中的B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)相关疾病的方法，包括测定相对于对照细胞的Tcll而言，所述受试者的细胞中表达的至少Tcll的量；通过向所述受试者施用有效量的至少一种通过下列一项或多项抑制Tcll表达的化合物来改变所述受试者中表达的Tcll的量i)抑制细胞中的NF-κ B途径；和ii)激活细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)；从而抑制所述受试者中B-CLL相关疾病的发展。
6.测定用于预防、诊断和/或治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病的治疗法的有效性的方法，包括使动物经历其有效性待测定的治疗法，和通过评价Tcll的至少一种生物标志物来确定所测定的治疗法在治疗或预防B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病中的有效性的水平。
7.权利要求6的方法，其中候选治疗剂包括下列一种或多种药物组合物、营养组合物和顺势疗法组合物。
8.权利要求7的方法，其中所测定的治疗法是用于人类受试者。
9.干扰B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病应答信号传导途径的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包括Tcll的至少一种生物标志物。
10.在有此需要的个体中治疗、预防、逆转或限制B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病并发症的严重性的方法，包括向所述个体施用干扰至少一种B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包括Tcll的至少一种生物标志物，其i)抑制细胞中的NF-κ B途径；和/或ii)激活细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)的表达。
11.干扰至少一种B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病应答级联的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中与癌症相关的疾病并发症的严重性，其中所述试剂包括iTcll的至少一种生物标志物，其i)抑制细胞中的NF-K B途径；和 /或ii)激活细胞中的激活剂蛋白I(AP-I)的表达。
12.能与Tcll上的表位结合的抗体，其中所述抗体调节下列至少一项所述表位与激活剂蛋白I(AP-I)之间的相互作用。
13.包含权利要求12的抗体的药物组合物。
14.治疗哺乳动物中的B-CLL疾病状态的方法，其中所述疾病状态中激活剂蛋白 1 (AP-I)的活性发生改变，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的抗体，所述抗体能够与"Tell蛋白上的表位结合， 从而调节激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的活性。
15.治疗哺乳动物中的B-CLL疾病状态的方法，其中所述疾病状态中激活剂蛋白 1 (AP-I)的活性发生改变，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的激活剂蛋白I(AP-I)的肽片段，其中所述肽片段与激活剂蛋白I(AP-I)结合，从而调节激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激酶活性。
16.包括Tcll模拟物的化合物，其中所述Tcll模拟物与任意细胞中的激活剂蛋白 1 (AP-I)结合并且在模拟激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激活中具有功能性活性。
17.治疗哺乳动物中的疾病状态的方法，其中所述疾病状态中激活剂蛋白I(AP-I)的活性发生改变，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的Tcll模拟物，其中所述Tcll模拟物与激活剂蛋白I(AP-I)结合，从而活化激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激酶活性。
18.包括Tcll拮抗剂的化合物，其中所述Tcll拮抗剂能与任意细胞中的激活剂蛋白 1 (AP-I)结合并且在调节激活剂蛋白I(AP-I)的Tcll增强的激活中具有功能性活性。
全文摘要
公开了用于诊断、预后和/或治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关疾病的方法和组合物。
文档编号A61K39/395GK102271706SQ200980153024
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月19日 优先权日2008年11月21日
发明者C·M·克罗斯, Y·佩卡斯基 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会