镇痛活性肽grr及其制备与应用的制作方法

专利名称：镇痛活性肽grr及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及镇痛活性肽GRR及其镇痛活性保守氨基酸残 基及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及蝎镇痛活性肽GRR及其衍生物、类似物、活 性片段的结构及其制备方法，以及作为镇痛药物在医药领域中的应用。
背景技术：
蝎作为中医珍贵药材又称全虫、全蝎，始载于《开宝本草》，《本草纲目》列于虫部40 卷，距今已有2000多年的药用历史，具有熄风镇痉、攻毒散结、痛络止痛之功效。临床用于 治疗偏头痛、面神经瘫痪、风湿痹痛及癌痛等症，疗效确切。蝎主要活性成分是尾腺分泌的 毒素，其中蕴涵大量具有药学价值的活性组分，是一个富含有多种功能肽的天然活性肽库。目前，从蝎或蝎毒中分离纯化并结构解析具有镇痛活性的成分还不是很多，如，蝎 镇痛抗肿瘤缬精甘肽、蝎镇痛抗菌活性肽等。

发明内容
本发明的目的是提供蝎镇痛活性肽GRR及其制备与应用，具体是利用蛋白提取、 分离、纯化技术，从蝎毒或蝎尾或全蝎中筛选、分离、纯化获得蝎镇痛活性肽GRR。镇痛活性 肽GRR获得方法简单易行，可与任何载体混合制备医学上可接受的剂型。本发明是从全蝎或蝎尾或蝎毒中，分离纯化筛选获得一种具有镇痛活性的新型结 构多肽。同时，利用基因工程技术或化学合成技术解决该活性肽的获得方法。此外，利用基 因工程技术获得仍具有镇痛活性的该活性肽的衍生物或类似物或活性片段。再者，首次证 明活性肽的半胱氨酸残基是其镇痛活性保守性氨基酸残基。本发明是通过如下技术方案实现的，它包括(1)原料(蝎毒或蝎尾或全蝎)首 先进行勻浆，利用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解抽提，离心除去不溶杂质得到抽提液； (2)该抽提液可以通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组合以及经超 滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到镇痛活性肽GRR ； (3)经反向层析柱得到高纯度的镇痛活性肽 GRR0比如，蝎毒经酸性溶液溶解，离心除去不溶杂质得到抽提液；抽提液经疏水层析柱分离 得到镇痛活性组分；得到镇痛活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时进行浓缩，通过离子 交换层析柱分离得到镇痛活性组分；经疏水层析柱进一步分离得到镇痛活性组分；经超滤 以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到镇痛活性组分；经凝胶过滤层析柱进一步 纯化得到镇痛活性组分；经反向层析柱得到高纯度的镇痛活性肽GRR。本发明目的之二是确定镇痛活性肽GRR分子中的8个半胱氨酸残基与镇痛活性肽 GRR的镇痛活性关系。是通过基因工程技术以及体内生物活性实验实现的，它包括利用基 因工程技术对镇痛活性肽GRR分子中的8个半胱氨酸残基，分别进行一个或二个或三个或 四个或五个或六个或七个或八个半胱氨酸残基被去除掉或被其他氨基酸残基替换；针对分 离纯化获得的表达产物进行实验动物镇痛活性的比对，从实验结果确定镇痛活性肽GRR的 镇痛活性保守性氨基酸残基。
本发明目的之三是针对镇痛活性肽GRR的镇痛活性，利用基因工程技术获得一系 列镇痛活性肽GRR部分片段或衍生物或类似物，通过获得表达产物的实验动物体内镇痛活 性，以获得可以进一步开发镇痛类药物的镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似 物，本发明所述的的获得方法常规、简单、产量高，不仅具有重要的指导意义和实用价值，也 为工业化生产奠定了基础。本发明目的之四是提供多种镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似物的 制备方法，它包括利用基因工程技术进行表达或通过化学合成获得。本发明的另一个目的是提供生产上述镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似物的制备方法，该方法包括(1)将镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似物编码DNA重组至表达载 体；(2)用步骤(1)的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的蛋白质。本发明提供上述镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分 离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细 胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中， 可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或 蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测表达产物的存在及相应分子大小。本发明首次进行上述镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似物的小鼠体 内镇痛生物学活性实验。本发明还提供了上述镇痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或类似物在生物制 药领域的应用，具体地说包括镇痛生物活性。本发明的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受 的载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠 道夕卜途径给药的药物组合物(^nSMRemington' sPharmaceutical Science, 15th.，Mack Publishing Company, 1980) 0可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔 内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。本发明的再一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。可使用 本发明的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼 痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对 药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞等。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限 制本发明特批权利要求的范围。
实施例1 从蝎毒获得镇痛活性肽GRR获得镇痛活性肽GRR的提取、分离、纯化体系基本条件的特征1.操作温度在 O0C -45°c ；2.溶液的酸碱度在PH2-PH12。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质 的理 化性质，又不影响镇痛活性肽GRR的活性。(1)镇痛活性成分的抽提A.蝎毒溶于蒸馏水后，15000转/分离心15分钟，取上清液用0. OlM盐酸或磷酸 溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，取上清液用碱性溶液调pH为12，15000转/分 离心15分钟，上清液为蝎毒镇痛活性成分的抽提液。B.蝎毒2. 0克溶于20毫升pH为2的缓冲溶液或酸性溶液，15000转/分离心15 分钟，取上清液用碱性溶液调pH为12，15000转/分离心15分钟，上清液为蝎毒镇痛活性 成分的抽提液。C.蝎毒溶于pH为12的缓冲溶液或碱性溶液，15000转/分离心15分钟，取上清 液用酸性溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，上清液为蝎毒镇痛活性成分的抽提液。上述提取液的酸碱度从pH2_pH12，均不影响镇痛活性成分的生物活性，且从原料 中能够提取活性成分。(2)镇痛活性肽GRR的疏水层析分离取上述镇痛活性成分的抽提液，用盐酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或碱性溶 液调PH至要求条件范围下，加中性盐至2M浓度，上样于预先用2M中性盐-缓冲液溶液平 衡的疏水层析柱，分别用2. OMU. 5M、1. 0M、0. 5M中性盐-缓冲液洗脱，最后用缓冲液洗脱， 将含有镇痛活性的洗脱液合并。疏水层析分离的特征1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水 层析添料_或己烷_疏水层析添料_或丁烷_疏水层析添料；2.中性盐选择(HN3)2SO4或 Na2SO4或NaCl ；3.缓冲液的pH选择在pH2_pH12，此条件既不影响镇痛活性成分的生物活 性，又不影响活性成分的分离；4.缓冲液的浓度选择在ImM-lOOmM，此条件既不影响镇痛活 性成分的生物活性，又不影响活性成分的分离。(3)超滤处理镇痛活性成分溶液利用超滤处理的目的是除去镇痛活性成分溶液中的盐或杂蛋白或更换缓冲液，此 夕卜，对镇痛活性成分溶液进行浓缩。选择能够使镇痛活性肽GRR透过的超滤膜进行超滤处 理，此时收集超滤透过液，而杂蛋白被截留实现分离的目的。选择能够截留镇痛活性肽GRR 的超滤膜进行超滤处理，此时收集超滤浓缩液(镇痛活性肽GRR被截留)，而盐、缓冲液的缓 冲对、能透过超滤膜的杂蛋白、水被透过，实现去除盐、杂蛋白或更换缓冲液或浓缩的目的。超滤处理的特征1.透过镇痛活性肽GRR的超滤膜选择是分子量为IOkDa或 20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超滤膜，优选30kDa的超滤膜，大于或小于30kDa的超 滤膜，其收率或超滤效率均受影响；2.截留镇痛活性肽GRR的超滤膜选择是分子量为IkDa 或2kDa或3kDa或5kDa的超滤膜，优选IkDa的超滤膜，大于或小于IkDa的超滤膜，其收率 或超滤效率均受影响；3.超滤处理的温度选择在0°C-45°C，此条件既不破坏超滤膜的理化 性质，又不影响镇痛活性肽GRR的活性。(4)镇痛活性肽GRR的离子交换层析分离
方法(3)超滤处理的镇痛活性成分溶液，进一步用本实验的缓冲液进行除盐、缓 冲液更换和浓缩。待处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析柱，先用 缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，分别用0. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 4Μ、 0. 5Μ盐溶液进行阶段洗脱，将含有镇痛活性的洗脱液合并。离子交换层析分离的特征1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交 换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时 缓冲液酸碱度选择在ΡΗ2-ΡΗ7 ；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析 添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲 液酸碱度选择在ρΗ7-ρΗ12 ；3.缓冲液的浓度选择在lmM-50mM，此条件既不影响镇痛活性成 分的生物活性，又不影响活性成分的分离；4.阶段洗脱的盐 溶液选择是要求浓度的缓冲液 或在IOmM缓冲液中加中性盐到需要的浓度；5.中性盐选择(HN3)2SO4或Na2SO4或NaCl或 KCl，优选 NaCl。(5)镇痛活性肽GRR的疏水层析进一步分离得到的镇痛活性成分按照方法(2)的基本框架进一步分离。镇痛活性成分溶液加 中性盐至2M浓度，上样于预先用2M中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，进行中性盐浓 度梯度(2. OM 0. 0M)洗脱，合并收集含有镇痛活性的洗脱峰，进行超滤去盐和浓缩处理。疏水层析分离的特征1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水 层析添料_或己烷_疏水层析添料_或丁烷_疏水层析添料；2.中性盐选择(HN3)2SO4或 Na2SO4或NaCl ；3.缓冲液的pH选择在pH2_pH12 ；4.缓冲液的浓度选择在ImM-lOOmM。(6)镇痛活性肽GRR的离子交换层析进一步分离得到的镇痛活性成分按照方法(4)的基本框架进一步分离。待处理好的样品液上 样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析柱，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白， 进行盐浓度梯度(0. OM 1. OM)洗脱，合并收集含有镇痛活性的洗脱峰。离子交换层析分离的特征1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交 换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此 时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7 ；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换 层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此 时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12;3.缓冲液的浓度选择在lmM-50mM;4.盐梯度洗脱的盐 溶液选择是要求浓度的缓冲液或在IOmM缓冲液中加中性盐到需要的浓度；5.中性盐选择 (HN3) 2S04 或 Na2SO4 或 NaCl 或 KCl，优选 NaCl。(7)镇痛活性肽GRR的凝胶层析纯化含有镇痛活性的溶液进行超滤浓缩，样品液上样于预先用洗脱液平衡好的凝胶过 滤层析柱并进行纯化，收集含有镇痛活性的洗脱峰。凝胶层析分离的特征1.层析介质可以选择S印hacryl S-100HR或S印hacryl S-200HR 或 S印hadex G-50 或 S印hadex G-75 或 S印hadex G-100 或 S印hadex G-150 或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade 或 Superdex 30 prep grade 或 Superdex 75 prep grade 或Superose 12 HR或Superose 6 HR或Superdex Peptide HR或 Superdex75HR或SuperdexP印tide PE等凝胶层析添料；2.洗脱液的pH选择在pH2_pH12 ； 3.洗脱液的浓度选择在离子浓度大于0.15M及以上。
(8)镇痛活性肽GRR的反相层析高纯度纯化活性组分，上样于预先用0. 三氟醋酸-20%乙腈水溶液平衡好的反相层析柱，如SOURCE 15RPC、30RPC层析添料，先用0. 1 %三氟醋酸-20%乙腈水溶液充分洗涤，而后进 行乙腈浓度梯度(20%至95% )洗脱，合并收集洗脱峰面积最大的洗脱峰组分-镇痛活性 肽 GRR0从蝎毒获得的镇痛活性肽GRR的结构特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGAD SGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR实施例2:从蝎尾获得镇痛活性肽GRR本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。(1)镇痛活性成分的抽提A.蝎尾加蒸馏水后进行勻浆，15000转/分离心15分钟，上清液用0. OlM盐酸或磷 酸溶液或酸性溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，取上清液用碱性溶液调pH为12， 15000转/分离心15分钟，上清液为蝎尾镇痛活性成分的抽提液。B.蝎尾加pH为2的缓冲溶液或酸性溶液后进行勻浆，15000转/分离心15分钟， 取上清液用碱性溶液调PH为12，15000转/分离心15分钟，上清液为蝎尾镇痛活性成分的 抽提液。C.蝎尾加pH为12的缓冲溶液或碱性溶液后进行勻浆，15000转/分离心15分钟， 取上清液用酸性溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，上清液为蝎尾镇痛活性成分的 抽提液。上述提取液的酸碱度从pH2_pH12，均不影响镇痛活性成分的生物活性，且从原料 中能够提取活性成分。(2)镇痛活性肽GRR的分离纯化以及高纯度纯化取上述镇痛活性成分的抽提液，同实施例1中的(2)-(8)的策略、基本方法和基本 过程分离纯化镇痛活性肽GRR。 从蝎尾获得的镇痛活性肽GRR的结构特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGAD SGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。实施例3 从全蝎获得镇痛活性肽GRR本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例2。(1)镇痛活性成分的抽提A.全蝎加蒸馏水后进行勻浆，15000转/分离心15分钟，取上清液用0. OlM盐酸 或磷酸溶液或酸性溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，取上清液用碱性溶液调pH为 12，15000转/分离心15分钟，上清液为全蝎镇痛活性成分的抽提液。B.全蝎加pH为2的缓冲溶液或酸性溶液后进行勻浆，15000转/分离心15分钟， 取上清液用碱性溶液调PH为12，15000转/分离心15分钟，上清液为全蝎镇痛活性成分的 抽提液。C.全蝎加pH为12的缓冲溶液或碱性溶液后进行勻浆，15000转/分离心15分钟， 取上清液用酸性溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，上清液为全蝎镇痛活性成分的抽提液。上述提取液的酸碱度从pH2_pH12，均不影响镇痛活性成分的生物活性，且从原料 中能够提取活性成分。取上述镇痛活性成分的抽提 液，同实施例1中(2)-(8)的策略、基本方法和基本过 程分离纯化镇痛活性肽GRR。 从全蝎获得的镇痛活性肽GRR的结构特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGAD SGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。实施例4 镇痛活性肽GRR的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。蝎毒或蝎尾或全蝎中的镇痛活性成分抽提的策略、基本方法和基本过程同实施例 1、实施例2和实施例3。镇痛活性肽GRR的分离纯化的策略、基本方法和基本过程同实施例1。获得的镇痛 活性成分抽提液可以通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组合以及 经超滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到镇痛活性肽GRR，经反相层析柱得到高纯度的镇痛活性肽 GRR。这种组合的特征1.镇痛活性成分抽提液经过离子交换层析分离_疏水层析分 离_离子交换层析进一步分离_疏水层析进一步分离_凝胶层析纯化_反向层析；2.镇痛 活性成分抽提液经过凝胶层析纯化_离子交换层析分离_疏水层析分离_离子交换层析 进一步分离_疏水层析进一步分离-反向层析；3.镇痛活性成分抽提液经过凝胶层析纯 化_疏水层析分离_离子交换层析分离_疏水层析进一步分离_离子交换层析进一步分 离-反向层析；4.按照上述的分离纯化体系，不论如何组合不同层析顺序，均能分离纯化获 得镇痛活性肽GRR。获得的镇痛活性肽GRR 的结构特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYL AGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。实施例5 镇痛活性肽GRR及其衍生物、类似物、活性片段的获得1.镇痛活性肽GRR基因的构建本实施例列举描述用于表达本发明镇痛活性肽GRR及其衍生物、类似物、活性片 段基因的构建策略和基本方法。根据镇痛活性肽GRR (结构参见

图1.)的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相 应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上限制性核酸内切酶Nde I和BamHI水解位点序列；以蝎cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进 行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶Nde I和BamHI双酶切后与同样进行双酶 切的质粒在T4 DNA Iigase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH 5α，经 过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司 进行DNA序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法成功构建镇痛活性肽GRR基因。2.镇痛活性肽GRR及其衍生物、类似物、活性片段的获得利用基因过程技术，将镇痛活性肽GRR基因重组至大肠杆菌表达质粒中，提取质粒进行测序。该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为MHHHHHHMGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYC NGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。将阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21 ( λ DE3)，然后从该LB固体平板上挑取单菌落后接种至3ml LB(含卡那抗生素，50yg/ml)，于37°C，200r/min振荡过夜培养。按 照1 %接种量将过夜培养物接种至400ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于 370C，200r/min振荡培养至0D600为0. 6-0. 8，加入终浓度为0. 166mmol/L的诱导物异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养4h。结束发酵，3000g、4°C离心20min，收集菌体。用40ml 裂解缓冲液(0. IM PBS, 0. 15M NaCl，50mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于 12，000g、4°C离心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清 液，直接上样于0. IM PBS(pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段 的PH缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)进行洗脱并收获该洗 脱液。所得产物经过15% SDS-PAGE验证其纯度。由柱层析色谱图和SDS-PAGE图谱说明， 重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。上述获得的表达产物，利用化学法在M处断裂肽 链，从而获得镇痛活性肽 GRR,结构特征为GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAG KYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSG YCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSG YCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。同上原则获得表达产物，其结构特征为GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGY CYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。同上原则获得表达产物，其结构特征为MRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGY CYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。同上原则获得表达产物，其结构特征为RDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYC YLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。3.镇痛活性肽GRR在酵母中的表达及其纯化将编码镇痛活性肽GRR基因的序列用下列寡核苷酸引物进行扩增，获得插入片 断。PCR反应所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoRV限制性内切酶的酶切位点和镇痛 活性肽GRR的N末端区域氨基酸序列的编码序列，3'端引物序列含有EcoR I限制性内切 酶的酶切位点、一个翻译终止密码子和镇痛活性肽GRR的C末端区域氨基酸序列的编码序 列。引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体pPIC9K上的限制性内切 酶酶切位点(其中EcoRV和SnaB I的内切酶切口为平末端)，该质粒载体编码抗生素抗性 (Amplr和KarO，一个来自2 μ质粒的复制子，一个AOXl启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导 高效表达，一个α -因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个HIS4选择性标记以及整合 序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K载体，用EcoR V和EcoR I消化插入片段，随后 将插入片段连入PPIC9K载体，连接产物热转化E. coli DH 5 α菌株，在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在含有Amp (100 μ g/ml)的LB液体培养基中过夜培养含所需构建物的克 隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。取质粒线性化后，电转化入酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同 源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用G418筛选出高拷贝的整合转化子。 将筛选得到的菌株接种于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28 300C /250 300转/分培养至0D600 = 2 6 (16 18h)；室温下3000转/分离心5min，收 集菌体，用1/5到1/10原培养体积的匪、BMM或BMMY重悬菌体(约10 20ml)；将步骤2所 得的菌液置于IOOml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300转 /分的摇床上继续生长；每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0. 5 1. 0%;分离样 品的上清液，用截留分子量为3000Da的超滤膜超滤除去色素，用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。该体系表达产物结构特征为GRDAYIAQNYNCVYHC FRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。实施例6 镇痛活性肽GRR分子中半胱氨酸残基被替换表达产物的获得本实施例获得镇痛活性肽GRR分子中半胱氨酸残基被替换表达产物的策略和基 本方法，类同实施例1的策略和基本方法。本实施例列举描述用于表达本发明镇痛活性肽GRR(C12S)表达产物的重组质粒 pSYPU/镇痛活性肽GRR(C12S)的构建策略和基本方法。根据镇痛活性肽GRR氨基酸序列中C12前后氨基酸序列设计相应寡核苷酸弓I物，其 中对应半胱氨酸残基的密码子换成丝氨酸残基的密码子，以镇痛活性肽GRR氨基酸序列C 末端氨基酸序列设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上 限制性核酸内切酶Nde I和BamHI水解位点序列；以构建好的pSYPU/镇痛活性肽GRR质粒 为模板，进行PCR扩增。密码子替换后的镇痛活性肽GRR(C12S)基因进行表达质粒的构建、 诱导表达、表达产物纯化等基本过程同实施例5。获得的镇痛活性肽GRR(C12S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNSVYHCFRDD YCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C16S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVY HSFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C22S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYSNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C26S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLSTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C36S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLCTENGADSGYSYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C46S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHASWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C48S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWSINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR(C63S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKSHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR-(C12S，C63S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQ NYNSVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKSHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR-(C16S，C36S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQ NYNCVYHSFRDDYCNGLCTENGADSGYSYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR-(C22S，C46S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQ NYNCVYHCFRDDYSNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHASWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原则获得镇痛活性肽GRR- (C26S，C48S)表达产物，其结构特征为MGRDAYIAQ NYNCVYHCFRDDYCNGLSTENGADSGYCYLAGKYGHACWSINLPDDKPIRIPGKCHRR。实施例7:体内镇痛活性一小鼠醋酸扭体法本实施例通过小鼠体内镇痛模型确定镇痛活性肽GRR的体内生物活性_镇痛活 性。此外也旨在验证镇痛活性肽GRR衍生物、类似物、活性片段以及镇痛活性肽GRR分子中 半胱氨酸残基被替换表达产物的镇痛活性。蛋白浓度采用Lowry方法进行测定。小鼠醋酸扭体法镇痛模型将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继 而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与 后腿伸张、臀部高起)。18-22g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组8只，腹腔注射样品，20min后按 0. 2ml/20g腹腔注射0.6% (ν/ν)醋酸引起内脏痛，5min后记录小鼠IOmin内的扭体次数。 以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制 率。
抑制率二 ΜΜ^Μ^Μ^Μ x 100% 空白组扭体次数镇痛生物活性实验结果表明1.生理盐水空白组实验动物扭体次数(Mean士SEM)为44. 58士2. 76 ；阳性对照 组(吗啡，3. 51 μ mol/kg)实验动物扭体次数(Mean士 SEM)为30. 07 士 1. 85，扭体抑制率为 32. 55%。2.从蝎毒、蝎尾、全蝎获得的镇痛活性肽GRR样品组(0. 1375 μ mol/kg)的实验动 物扭体抑制率均在61. 4%以上。3.镇痛活性肽GRR衍生物、类似物、活性片段样品组(0. 1375 μ mol/kg)的实验动 物扭体抑制率均在57. 6%以上。4.镇痛活性肽GRR分子中半胱氨酸残基被替换表达产物样品组(0. 1375 μ mol/ kg)的实验动物扭体抑制率在21. 5%以上，该结果表明镇痛活性肽GRR分子中半胱氨酸残 基是其镇痛活性保守性氨基酸残基。
权利要求
镇痛活性肽GRR，其特征在于，它是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的如下氨基酸序列GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。
2.一种如权利要求1所述的镇痛活性肽GRR的生产方法，其特征在于，它包括⑴蝎毒 或蝎尾或全蝎用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去杂质得到抽提液，(2)抽 提液经疏水层析柱分离得到镇痛活性组分，(3)得到镇痛活性组分经超滤以去除盐和杂蛋 白，同时进行浓缩，通过离子交换层析柱分离得到镇痛活性组分，(4)经疏水层析柱进一步 分离得到镇痛活性组分，(5)经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到镇痛活 性组分，(6)经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到镇痛活性组分，(7)经反向层析柱得到高纯 度的镇痛活性肽GRR。
3.根据权利要求2所述的镇痛活性肽GRR的生产方法，其特征在于，所述的分离和纯化 方法包括蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解提取并经离心除去杂质 得到的抽提液，该抽提液可以通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组 合以及经超滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到镇痛活性肽GRR。
4.一种如权利要求1所述的镇痛活性肽GRR的镇痛活性保守性氨基酸残基，其特征在 于，它包括所述的镇痛活性肽GRR的N-末端第12位、第16位、第22位、第26位、第36位、 第46位、第48位和第63位这八个半胱氨酸残基。
5.镇痛活性肽GRR的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，它包含权利要求1和权 利要求4任何一项所述的氨基酸序列全序或片段。
6.根据权利要求5所述的镇痛活性肽GRR及其衍生物或类似物或活性片段，可以利用 基因工程技术进行表达获得，其特征在于，表达宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求5所述的镇痛活性肽GRR及其衍生物或类似物或活性片段，可以利用 化学合成技术获得，其特征在于，化学合成为人工合成或合成仪合成。
8.镇痛活性肽GRR及其衍生物或类似物或活性片段在制备镇痛药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的镇痛活性肽GRR及其衍生物或类 似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、 透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。
全文摘要
本发明涉及生物医药技术领域，涉及从天然材料提取、分离、纯化获得的镇痛活性肽GRR及其制备方法、利用基因工程技术获得镇痛活性肽GRR方法、镇痛活性肽GRR衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法和镇痛活性肽GRR及其衍生物、类似物、活性片段作为镇痛药物在医药领域中的应用。所述的镇痛活性肽GRR是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的如下氨基酸序列GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。所述的镇痛活性肽GRR及其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。本发明所述的镇痛活性肽GRR具有较好的镇痛活性，其获得方法常规、简单、产量高。
文档编号A61P29/00GK101880319SQ20101010746
公开日2010年11月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者刘岩峰, 吴春福, 崔勇, 张景海, 毛英姿, 郭桂丽 申请人:沈阳药科大学