专利名称：一种磷酸铝佐剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种磷酸铝佐剂及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，活载体疫苗、 DNA疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但免疫原性弱，诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，应用佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答就显得尤为重要。
随着分子生物学的快速发展，多肽疫苗及亚单位疫苗不断涌现，无论在数量上还是质量上对疫苗佐剂的要求都愈来愈高。人们在寻找新型佐剂的同时，对常规佐剂的改良研究也更加重视起来。虽已涌现不少新型佐剂，但大多尚处于实验研究阶段。所以目前在疫苗产业中铝佐剂是最传统最重要也是应用最多的疫苗佐剂。铝佐剂的作用机理主要是在组织中形成抗原贮藏库，产生颗粒性抗原来促进抗原提呈给免疫细胞，使抗原滞留，缓慢释放，从而吸引活性淋巴细胞，激活补体系统。铝盐佐剂成本低、使用方便，是生物制品生产中应用最广的一种佐剂，也是最早被美国食品药物监督管理局(FDA)批准用于人类疫苗的佐剂。自1926年Glermy首先应用铝盐黏附白喉类毒素至今已广泛应用于人兽疫苗。铝佐剂通常在人用疫苗中含量为0. 5mg/ 剂量，WHO推荐最高不超过1. 25mg/剂量。铝佐剂包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。天然的氢氧化铝有上百种存在形式，例如Α1(0Η)3、Α1203 ·Η20、Α100Η等.而商品化的氢氧化铝佐剂，实际上是Al (OH)3的不完全脱水产物，即纤维状结晶形态的偏氢氧化铝AlO(OH)，氢氧化铝佐剂(分子式为AlO(OH))的等电点为11. 4，在生理条件(人体内)时带正电荷，可较好地吸附带负电荷的蛋白疫苗，如流感疫苗，乙肝疫苗等。而磷酸铝佐剂的等电点依赖于磷酸根和羟基的比例，完全没有磷酸根时(分子式Al (OH)3)等电点为9. 6，完全没有羟基时(分子式AlPO4)等电点为4.0，商业化的磷酸铝佐剂的等电点一般为5. 0，在生理条件时带负电荷，可较好地吸附带正电荷的蛋白疫苗，如HPV疫苗等。中国专禾IjCN2006800090340、CN2006800475728、CN2006800476098 公开了磷酸铝佐剂具有下列技术特征粒径0.5-20um;P/Al 0. 3-1. 2 (优选0. 8-1. 2)；等电点 (PZC) 4. 0-7. 0 (优选5. 0-6. 5，最优5. 7)；以沉淀法生产。中国专利CN028149335公开了磷酸铝佐剂具有下列技术特征其为Al (0H)X(P04) y，其中各阴离子化合价和乘以其摩尔分数是-3，P/A1 0.3-0.99 ；以沉淀法生产。但现有的磷酸铝佐剂在均一性和包载能力方面缺陷，影响了此佐剂诱导产生的体液应答水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性高、均一性好和包载能力强的磷酸铝佐剂及其制备方法，以应用此佐剂可诱导产生较强的体液应答水平，同时有利于在疫苗的生产过程中，可减少佐剂和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用。为此，本发明公开了一种磷酸铝佐剂，其特征在于粒径200-4500nm;多分散性系数 0. 01-1. 0 ；等电点 4. 0-6. 0。在一实施例中，所述磷酸铝佐剂，其特征在于粒径200-800nm;多分散性系数 (PDI)O. 10-0. 50 ；等电点(PZC)4. 2-5. 8 ；其中最优选粒径200 300nm ；多分散性系数 (PDI)O. 15 0. 35 ；等电点(PZC)4. 5 5. 5。
在一实施例中，所述磷酸铝佐剂中铝离子浓度为5620ug/ml，磷离子的浓度为 5174ug/ml, P/A1 比为 0. 92。另一方面，本发明还公开了所述磷酸铝佐剂的制备工艺，包括下列步骤a)采用蠕动泵将0. 06mol/L氯化铝与0. 06mol/L磷酸二氢钠的混合溶液和 0. 5mol/L强碱溶液分别以相应的流速泵入反应器中，搅拌，其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液和强碱溶液的流速比为5 2 15 2;b)收集混悬液，静置，弃去上清夜，离心，得沉淀；c)洗涤沉淀、溶解即得磷酸铝佐剂溶液。所述强碱可为氢氧化钠或氢氧化钾；在一些实施方式中，所述氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速控制在10 30ml/min，优选其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速20ml/min在另一方面，本发明还公开了一种疫苗组合物，其特征在于其包含不超过1. 25mg/ 剂量的本发明所述磷酸铝佐剂；所述疫苗为带正电荷的蛋白疫苗，如HPV疫苗。本发明所述磷酸铝佐剂稳定性高、均一性好和包载能力强，以应用此佐剂可诱导产生较强的体液应答水平，同时有利于在疫苗的生产过程中，可减少佐剂和疫苗的添加量， 降低疫苗的毒副作用，其效果优于现有商品化佐剂。本发明所述方法工艺简单，能得到性质稳定、分散均一、批间差小的磷酸铝佐剂，解决磷酸铝佐剂批间差异大的问题。
图1、磷酸铝佐剂透射电镜图；图2、蛋白包封率检测。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1磷酸铝佐剂的制备方法1、溶液配制1. 1氯化铝溶液(0. 06mol/L)和磷酸二氢钠溶液(0. 06mol/L)的配制称量28. 9716g 的 AlCl3. 6H20 和 18. 7212g 的 NaH2PO4. 2H20,纯水溶解并定容至 2L，即得浓度为ο. 06mol/L的氯化铝和磷酸二氢钠溶液。1. 2氢氧化钠溶液(0. 5mol/L)的配制 称量40g的NaOH，纯水溶解并定容至2L，即得浓度为0. 5mol/L的氢氧化钠溶液。1. 3除菌除热源采用超滤仪(截留分子量8KD或10KD)进行超滤。用0. 22 μ m囊式滤器过滤除菌。2、磷酸铝佐剂的制备工艺分别采用蠕动泵将氯化铝与磷酸二氢钠的混合溶液和氢氧化钠溶液以一定的流速泵入容积为600mL的玻璃反应器中，反应器至于磁力搅拌器上，以恒定的速度搅拌。其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速控制在10 30ml/min。弃去初始的750ml混悬液，收集后续混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，SOOOrpm 离心15min，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于一定体积纯水中，即得某浓度范围的磷酸铝佐剂溶液。将不同流速的制备的磷酸铝分别标记为75/15、75/15. 5、75/15、75/16、 75/16. 5,75/17,75/17. 5,75/18,75/18. 5,75/19,75/19. 5、75/20、75/25、75/30。将制备的各组磷酸铝悬浮液进行12rC、30min湿热灭菌。然后4°C条件下保存。3、铝佐剂的检测分别测定各组磷酸铝佐剂的等电点、粒径、HPV18L1蛋白包封率、透射电镜下形态等指标，以购自Accuratechemical公司的磷酸铝佐剂(Ad ju-Phos )作为对照。形态将样品稀释后，滴加入磷钨酸染色(也可不染色)，室温挥干，于透射电镜测定样品的粒子形态。磷酸铝佐剂透射电镜照片见图1 ；粒径将样品适当稀释后，采用Marven公司的粒度与表面电位分析仪测定样品的粒子直径和多分散性系数(PDI)，实验结果分别见表1。表1.从氯化铝出发制备的铝佐剂在水溶液中的粒子直径
权利要求
1.一种磷酸铝佐剂，其特征在于其粒径200-4500nm ；多分散性系数0. 01-1. 00 ；等电点 4. 0-6. O0
2.如权利要求1所述的磷酸铝佐剂，其特征在于其粒径200-800nm；多分散性系数 0. 10-0. 50 ；等电点 4. 2-5. 8。
3.如权利要求1所述的磷酸铝佐剂，其特征在于其粒径200 300nm；多分散性系数 0. 15 0. 35 ；等电点 4. 5 5. 5。
4.权利要求1所述磷酸铝佐剂的制备方法，包括下列步骤a)采用蠕动泵将0.06mol/L氯化铝与0. 06mol/L磷酸二氢钠的混合溶液和0. 5mol/ L强碱溶液分别以相应的流速泵入反应器中，搅拌，其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液和强碱溶液的流速比为5 2 15 2 ；b)收集混悬液，静置，弃去上清夜，离心，得沉淀；c)洗涤沉淀、溶解即得磷酸铝佐剂溶液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述强碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为 75ml/min，氢氧化钠溶液的流速控制在10 30ml/min。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为 75ml/min,氢氧化钠溶液的流速20ml/min。
8.一种疫苗组合物，其特征在于其包含不超过1. 25mg/剂量的权利要求1所述磷酸铝佐剂。
9.如权利要求8所述疫苗组合物，其特征在于所述疫苗为带正电荷的蛋白疫苗。
10.如权利要求9所述疫苗组合物，其特征在于所述带正电荷的蛋白疫苗为HPV疫苗。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种磷酸铝佐剂及其制备方法。本发明公开了一种磷酸铝佐剂，其特征在于粒径200-4500nm；多分散性系数0.01-1.00；等电点4.0-6.0。本发明所述磷酸铝佐剂稳定性高、均一性好和包载能力强，以应用此佐剂可诱导产生较强的体液应答水平，同时有利于在疫苗的生产过程中，可减少佐剂和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用，其效果优于现有商品化佐剂。本发明所述方法工艺简单，能得到性质稳定、分散均一、批间差小的磷酸铝佐剂，解决磷酸铝佐剂批间差异大的问题。
文档编号A61K39/12GK102188701SQ201010123850
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者刁美娟, 张高峡, 沈琼, 王兰创, 郭慧丽 申请人:上海泽润生物科技有限公司