专利名称：以鱼肠为原料制备小口径人工血管的方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程及生物材料技术领域，特别是涉及一种小口径人工血管 的制备方法，具体说是一种以鱼肠为原料制备小口径人工血管的方法。
背景技术：
在临床上，有很多血管病变需要对患者进行血管移植，如心脏搭桥，断肢再植，开 放性外伤所导致的血管缺损，动脉粥样硬化所导致的局部血管功能丧失等。在血管移植术 中，需要大量的移植物。这些移植物的最佳来源是取材于患者身体其他部位的血管，然而这 会导致取材部位的机体不同程度的损害，为此，人们把目光转向同种异体血管，这除了面临 供体有限的问题外，还涉及免疫排斥及伦理学等问题。所以人们把希望寄托于人工血管。对 于直径大于6毫米的人工血管的研制，目前已经成功应用于临床并取得了很好的疗效。一 般来讲，人们将直径小于或等于6毫米的人工血管称为小口径人工血管。在小口径人工血 管的研究中，目前仍未取得理想的进展。1)小口径人工血管研制中的材料应用概况材料的选择一直是小口径人工血管研制工作的核心。许多种类的材料被应用于此 项研究中。在这些材料中，天然生物材料主要包括壳聚糖，细胞外基质，丝素蛋白等。其中， 细胞外基质主要来源于哺乳动物的羊膜、血管、输尿管等。人工合成有机高分子材料主要包 括聚四氟乙烯(PTFE)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚乳酸和聚乙醇酸共聚物(PLGA)等。 在这些材料中，猪、牛等哺乳动物血管来源的细胞外基质由于其天然管状形态而备受关注。2)哺乳动物血管来源的细胞外基质作为制备小口径人工血管的材料所存在的问 题。不同的患者由于个体差异，同名血管在直径上存在差异；患者不同的移植部位对 血管移植物管径的要求不同。在以哺乳动物血管来源的细胞外基质作为制备小口径人工血 管材料的研究中，要求用以制备基质材料的哺乳动物血管在管径上与患者移植部位的血管 管径相匹配，同时在长度上也要符合要求。事实上这很难实现。因为，动物的小口径血管常 有密集的分枝，去掉侧枝后，会留下一个孔洞，孔洞的存在是不允许的。而最长的两个分枝 间的距离一般不会超过2厘米，这意味着，以哺乳动物血管来源的细胞外基质为材料所制 备的小口径人工血管的最大长度为2厘米左右，这显然不能满足临床上对小口径人工血管 在长度上的要求。同时，在管径匹配方面也很困难。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明在国内外首次将一种全新的价廉物美的材料即 鱼肠来源的细胞外基质应用于小口径人工血管的研制中。本发明的目的在于提供一种以鱼 肠来源的细胞外基质和PLGA为材料制备小口径人工血管的方法。鱼肠来源丰富，价格低廉。与目前所有应用于小口径人工血管研究中的细胞外基 质相比，鱼肠来源的细胞外基质的优势主要体现在以下方面
①同其他细胞外基质一样，鱼肠来源的细胞外基质的主体结构为胶原纤维所形成 的立体网状结构。所不同的是，鱼肠来源的细胞外基质中的胶原纤维更细密，这有利于进一 步的改性。②鱼肠为不分枝的管道，且厚度和内外径相对均一。这样的天然管状形态和小口 径血管极为相似。但鱼肠来源的细胞外基质存在如下的缺陷细胞外基质是动物组织经去细胞处理 后所得到的产物。在去细胞处理过程中，动物组织原有的结构被破坏。所以，细胞外基质与 动物组织相比，其理化性质存在一定的差异。与鱼肠相比，鱼肠来源的细胞外基质仍然维持 了管状形态，其内外径与长度没有大的变化。然而，其胶原纤维间的结构更为疏松，孔隙增 大。这样的疏松结构会导致血液渗漏和凝血反应。所以，在鱼肠来源的细胞外基质构建小口径人工血管的过程中，必须要对其进行 改性。在本发明中，使用聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PLGA)对鱼肠来源的细胞外基质进行 改性。改性的目的一方面是为了让PLGA填补细胞外基质中胶原纤维间的空隙以防止血液 渗漏。同时，将胶原纤维与血液隔离开来，以避免凝血反应。本发明依次通过下列步骤实现(1)鱼肠的准备取新鲜鱼肠，剔除筋膜和脂肪，去除鱼肠内容物，洗净；(2)鱼肠的去细胞处理将步骤(1)所得的鱼肠依次进行脱脂，漂洗，酶处理，漂 洗，去垢剂处理，漂洗，冷冻干燥；脱脂将鱼肠浸泡在肥皂水中，每隔1小时搅动10分钟，如此反复操作12次；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗8小时；胰蛋白酶处理将鱼肠浸泡于浓度为2. 5g/L的胰蛋白酶溶液中，8小时；复合酶处理将鱼肠浸泡于含30U/ml DNA酶和0. 025mg/ml RNA酶的溶液中，4小 时；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗2小时；去垢剂处理将鱼肠浸泡于浓度为20g/L的TrisHcl和ν/ν浓度为1 % Triton X-100的溶液中，12小时；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗12小时，磷酸盐缓冲溶 液(PBS)漂洗3次，每次12小时；冷冻干燥将鱼肠套在圆柱体模具上，冷冻干燥，得鱼肠来源的细胞外基质；(3)小口径人工血管的制备将步骤(2)所得鱼肠来源的细胞外基质置于浓度为 10 50g/L的PLGA三氯甲烷溶液中浸泡1小时，取出后自然风干，磷酸盐缓冲溶液(PBS) 漂洗3次，每次1小时，冷冻干燥，密封保存。本发明所指的鱼肠是指鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)或鳙鱼 (Aristichthys mobilis)的鱼肠。这些鱼类成年个体来源的鱼肠的直径主要介于1_6毫 米，长度主要介于200-300毫米。这样的几何尺寸完全满足小口径人工血管的需要。本发明的优点是鱼肠来源丰富，价廉物美，所制备的小口径人工血管成本低廉。由于鱼肠来源的细 胞外基质在形态上与小口径血管相同，因此操作简便易行。由于鱼肠来源的细胞外基质中 天然的胶原纤维结构具有优良的力学性能，这就决定了本发明所制备的小口径人工血管具有优良的力学性质。本发明所制备的小口径人工血管在人体血压下，不破裂，不漏血，不会 导致凝血反应，有利于血管内皮细胞的粘附。能同时满足小口径血管和长度上的要求。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发 明，而不构成对本发明的限定。实施例1 (1)鱼肠的准备取成年鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix) —尾，打开腹腔，取出鱼肠，剔除筋 膜和脂肪，去除鱼肠内容物，洗净，切割成100毫米长度。(2)鱼肠的去细胞处理脱脂将鱼肠浸泡在肥皂水中，每隔1小时搅动10分钟，如此反复操作12次；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗8小时；胰蛋白酶处理将鱼肠浸泡于浓度为2. 5g/L的胰蛋白酶溶液中，8小时；复合酶处理将鱼肠浸泡于含30U/ml DNA酶和0. 025mg/ml RNA酶的溶液中，4小 时；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗2小时；去垢剂处理将鱼肠浸泡于浓度为20g/L的TrisHcl和ν/ν浓度为1 % Triton X-100的溶液中，12小时；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗12小时，磷酸盐缓冲溶 液(PBS)漂洗3次，每次12小时；冷冻干燥将鱼肠套在圆柱体模具上，冷冻干燥，得鱼肠来源的细胞外基质；(3)小口径人工血管的制备将步骤(2)所得鱼肠来源的细胞外基质置于浓度为50g/L的PLGA三氯甲烷溶液 中浸泡1小时，取出后自然风干，磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3次，每次1小时，冷冻干燥， 密封保存。实施例2 (1)鱼肠的准备取成年鳙鱼(Aristichthys mobilis) —尾，打开腹腔，取出鱼肠，剔除筋膜和脂 肪，去除鱼肠内容物，洗净，切割成150毫米长度。(2)鱼肠的去细胞处理(如实施例1)(3)小口径人工血管的制备将步骤(2)所得鱼肠来源的细胞外基质置于浓度为10g/L的PLGA三氯甲烷溶液 中浸泡1小时，取出后自然风干，磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3次，每次1小时，冷冻干燥， 密封保存。
权利要求
一种以鱼肠为原料制备小口径人工血管的方法，其特征在于，依次通过下列步骤实现(1)鱼肠的准备取新鲜鱼肠，剔除筋膜和脂肪，去除鱼肠内容物，洗净；(2)鱼肠的去细胞处理将步骤(1)所得的鱼肠依次进行脱脂，漂洗，酶处理，漂洗，去垢剂处理，漂洗，冷冻干燥；脱脂将鱼肠浸泡在肥皂水中，每隔1小时搅动10分钟，如此反复操作12次；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗8小时；胰蛋白酶处理将鱼肠浸泡于浓度为2.5g/L的胰蛋白酶溶液中，8小时；复合酶处理将鱼肠浸泡于含30U/ml DNA酶和0.025mg/ml RNA酶的溶液中，4小时；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗2小时；去垢剂处理将鱼肠浸泡于浓度为20g/L的TrisHcl和v/v浓度为1％Triton X-100的溶液中，12小时；漂洗捞出鱼肠，包裹于纱布中，置于水龙头下，流水冲洗12小时，磷酸盐缓冲溶液漂洗3次，每次12小时；冷冻干燥将鱼肠套在圆柱体模具上，冷冻干燥，得鱼肠来源的细胞外基质；(3)小口径人工血管的制备将步骤(2)所得鱼肠来源的细胞外基质置于浓度为10～50g/L的PLGA三氯甲烷溶液中浸泡1小时，取出后自然风干，磷酸盐缓冲溶液漂洗3次，每次1小时，冷冻干燥，密封保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，鱼肠是鲢鱼或鳙鱼的鱼肠。
全文摘要
本发明在国内外首次将一种全新的价廉物美的材料即鱼肠来源的细胞外基质应用于小口径人工血管的研制中。鱼肠来源丰富，价廉物美，所制备的小口径人工血管成本低廉。由于鱼肠来源的细胞外基质在形态上与小口径血管相同，因此操作简便易行。本发明所制备的小口径人工血管在人体血压下，不破裂，不漏血，不会导致凝血反应，有利于血管内皮细胞的粘附。能同时满足小口径血管和长度上的要求。
文档编号A61L27/36GK101884810SQ20101021665
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者刘彬, 张耀光, 戴丽, 王志坚, 蒲德永 申请人:西南大学