共轭聚电解质的医药用途的制作方法

专利名称：共轭聚电解质的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及共轭聚电解质用于如下的用途可选地在选择性的条件下，特异性地 分离，例如俘获错折叠的、病理的或劣种(rogue)形式的蛋白质，即淀粉样形式、错折叠形 式或聚集形式的蛋白质，和俘获类似地引起在其正常形式不聚集的蛋白质的异常形式聚集 的蛋白质。本发明还涉及同时分离和检测错折叠的、病理的或劣种形式的蛋白质的一步方 法。本发明的进一步的实施方案涉及共轭聚电解质作为新治疗剂的用途，其通过在体内干 扰错折叠的、病理的或劣种形式的蛋白质的形成或俘获其来起作用。
背景技术：
能够选择性俘获错折叠的或聚集形式的蛋白质，特别是淀粉样形式和病理形式的 蛋白质的物质和分子，由于其具有用作临床化学、诊断中的分析工具以及治疗剂的潜能，其 发展引起了极大的关注。通常，用小分子染料如刚果红和硫磺素T染色淀粉样原纤维。这 样的分子染料的最大缺点是不能分离(separate)，即结合、俘获或离析(isolate)出所述 错折叠蛋白质并同时对其检测。一种用于测定淀粉样的、错折叠的或病理形式的蛋白质存在的方法使样品进行蛋 白水解一段时间，例如用蛋白酶K进行蛋白水解，所述时间足以破坏天然蛋白质，然后，使 用在天然蛋白质的存在下对于淀粉样的、错折叠的或病理形式蛋白质没有选择性的抗体， 进行免疫测定，以测定所述错折叠形式蛋白质的存在。如果使用蛋白酶来去除在包含淀粉 样的、错折叠的或病理形式蛋白质的样品中的天然蛋白质，这将阻止在蛋白水解步骤期间 使用抗体作为俘获剂或检测剂，因为在蛋白酶的存在下，抗体自然会被破坏。因此，在引入 抗体之前，必须去除或灭活所述蛋白酶。当在天然蛋白质的存在下俘获和检测淀粉样的、错 折叠的或病理形式蛋白质时，防止这一限制在所述过程中发生极其有利。天然生物聚合物如蛋白质，通常具有有序的构型，如α-螺旋和β-折叠，其有助 于所述生物聚合物的三维有序结构和特定功能。蛋白质的结构是蛋白质的功能所必需的； 许多科学家已经指出未折叠的蛋白质可能是没有功能的。更重要的是，近几年，逐渐意识到 蛋白质错折叠和错装配成例如淀粉样和其它病理形式的危险性。错折叠可能会将蛋白质从 一种有用的东西变成非功能性的、有害的甚至有毒的。人体健康依靠正确折叠的蛋白质，淀 粉样原纤维的体内沉降与许多蛋白质构型的疾病相关，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、亨 廷顿氏病、系统淀粉样变性疾病(systemic amyloidoses)和朊病毒病。朊病毒病，即动物 [例如牛海绵样脑病(BSE)、羊瘙瘁病和慢性消耗性疾病(CWD)]和人类[克雅病(CJD)、杰 茨曼-斯脱司勒-史茵克(Gerstmarm-Str汪USSler-Scheinker)疾病(GSS)、库鲁症]中的 传染性海绵样脑病(TSE)，与正常细胞朊病毒蛋白质(PrPe)的构型转化成表示为PrPse的传染性病原性疾病相关的同工型有关。由于不同的外界刺激，蛋白质经常改变它们的构型，已 经大量报导了导致病原性状态的蛋白质的构型变化的重要性。特别地，在使其天然状态不 稳定的情况下，蛋白质可聚集成特征性纤丝状装配，称为淀粉样原纤维。这些的富含折 叠的蛋白质装配具有与其天然状态明显不同的构型。所述错折叠的朊病毒蛋白质甚至是自 传播的(有传染性的)，这是一种在所述错折叠的构型内完全编码的性质。蛋白质的错折 叠和继发的淀粉状蛋白形成的机理还不是很清楚。许多证据支持在从错折叠蛋白质到淀粉 状蛋白的途径中，存在作为中间体的较小低聚物物种。这些低聚物在形态学上不同，可能只 有这些低聚物中的一部分引起与淀粉状蛋白病相关的细胞毒性。而且，单一可溶性蛋白质 可以产生不同“菌株”(strains)的错折叠产物，如酵母菌朊病毒Sup35所证实的。已经表 明不同的酵母菌朊病毒菌株的传染性取决于传染性蛋白质的构型，而且一种蛋白质可以采 取多种自传播的(有传染性的)构型。这些构型差异成为朊病毒菌株的可遗传性差异。另 外，朊病毒菌株也可能在决定朊病毒传播特异性方面具有重要的作用。慢性人类疾病严重地影响卫生保健系统。公认快速精确的诊断工具是给予早期介 入和治疗所必需的。目前只存在对症状的治疗如阿尔茨海默氏病，并且这些具有有限的治 疗效果。目前，不存在阿尔茨海默氏病或传染性海绵样脑病(TSEs)的临死前分子诊断试 验，并且进行的这种临床诊断要求疾病已经很严重。而且，也没有有效的治疗手段，免疫治 疗如在阿尔茨海默氏病中进行的具有巨大的希望。然而，在治疗大多数蛋白质错折叠相关 疾病中，缺乏用于俘获错折叠蛋白质、监测治疗和疾病进程两者的可靠方法是一个严重的 缺陷。因此，存在以下需要可以从样品中分离，例如俘获促淀粉状蛋白质 (amyloidogenic proteins)，如错折叠的朊病毒蛋白质和不同菌株朊病毒蛋白质的简单、 灵敏和多用途的工具的需要。还存在对通过体内干扰、结合或俘获错折叠的或淀粉状蛋白 的新治疗剂的需要。使用共轭聚合物(CPs)来研究生物分子、生物分子的相互作用、生物分子的折叠 事件和生物分子的动力学的可能性要求该聚合物与水相环境相容。这可通过制备共轭聚 电解质(CPEs)来实现。如在许多科技出版物中描述的，已经通过多种方法使用CPE来检 测生物分子、生物分子的相互作用和生物分子的折叠事件。其中通过聚电解质链的构型 改变，使用CPE来检测生物特异性相互作用，如受体/分析物相互作用的实例可以在以下 科学文献中找到[Nilsson，K. P. R. ；Inganas, O. Nature Materials2003, 2,419-424.； Ho, H-A.等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2002，41，1548. ；Ho, H-A. ；Leclerc, M. J. Am. Chem. S oc.2004,126,1384. ；Dore, K. ；Dubus,S. ；Ho, H-A. ；Levesque,I. ；Brunette, Μ. ；Corbei1, G. ；Boissinot, M. ；Boivin, G. ；Bergeron, Μ. G. ；Boudreau, D. ；Leclerc, M. J. Am. Chem. Soc.2004，126，4240. ；W002/081735, W003/096016]。

发明内容
需要用于俘获错折叠形式或聚集形式的蛋白质，特别是淀粉样形式或病理形式的 蛋白质的具有改善亲和性(affinity)的简单方法，特别地，用于从样品中(回体(ex vivo) 或体内)分离错折叠蛋白质。因此，在本发明中描述了基于共轭聚电解质的方法，该共轭 聚电解质可以俘获用于自装配/聚集形式的蛋白质，特别是错折叠形式或聚集形式的蛋白
4质，同时起以光信号报告俘获事件的传感器作用。而且，本发明还涉及共轭聚电解质作为新的治疗剂的用途，该新治疗剂通过干扰、 结合或俘获错折叠形式、淀粉样聚集形式或病理蛋白质形式，如阿尔茨海默中的淀粉状蛋 白β或TSE中错折叠的朊病毒蛋白来起作用。共轭聚电解质结合和俘获这些蛋白质形式， 因此CPEs通过起药效团作用来影响活生物体中的发病机理，即所述CPEs是治疗剂。能穿 过血脑屏障的共轭聚电解质对影响脑的疾病有作用，这包括，但不限于活生物体中的β淀 粉状蛋白病理过程，即通过起治疗药效团作用来影响阿尔茨海默氏病的发病。本发明涉及固定在固体载体上或者游离在溶液中的共轭聚电解质(CPEs)用于如 下的用途用于特定分离，例如俘获错折叠的、病理或劣种形式的蛋白质，即淀粉样形式、错 折叠形式或聚集形成，和类似地引起在其正常形式不聚集的蛋白质的异常形式聚集的蛋白 质。可以在对于错折叠蛋白质形式的选择性条件下，使用一种CPE或几种CPE可选地进行错 折叠蛋白质的所述俘获。本发明还涉及俘获和检测错折叠的、病理或劣种形式的蛋白质的 一步方法，其可以在错折叠蛋白质的非选择性条件下选择性的进行。本发明的另一方面是 CPEs作为错折叠形式或聚集形式的蛋白质，特别是淀粉样形式和病理形式的蛋白质体内成 像工具。本发明还涉及使用官能化的共轭聚电解质通过例如MRI对错折叠蛋白质的体内成 像方法。本发明通过使用CPE用于分离，例如俘获、结合或干扰样品中(回体或体内)错折 叠蛋白质来解决现有技术的缺点，俘获和检测所述蛋白质、用于诊断的新型光学方法和可 能的治疗剂，所有都是基于共轭聚电解质。现有技术证实CPEs能可靠地检测体外和在回体 组织样品中的淀粉样纤颤[W02005109005]。使用CPEs俘获促淀粉样结构的物理化学原理 依赖于所述聚电解质的重复结构，其与提供非常高亲和性的对称重复的分子靶点(淀粉样 变性分子)有关。因此，基于选择性CPE的方法能够俘获与许多疾病相关的病原性和淀粉 状蛋白。根据本发明，用于俘获错折叠形式或聚集形式的蛋白质，特别是淀粉样形式和病理 形式蛋白质的工具和方法，以及与这些蛋白质形式相关的疾病的治疗全都基于共轭聚电解 质。包含错折叠蛋白质的样品包括，但不限于血液、脑、外周组织、均质化的脑、均质化 的外周组织、体液、活组织检查、尿、脑脊液(CSF)、淋巴液、血浆、在用于蛋白质药物的缓冲 液和生物技术生长培养基中的制剂。本发明的一个方面是共轭聚电解质作为错装配/聚集形式的蛋白质，特别是淀粉 样原纤维和病原性形式的蛋白质的俘获剂的用途。当用作俘获错折叠蛋白质的试剂时，所 述共轭聚电解质可以固定在固体载体上、任何粒径的珠粒上、管中、透析装置中、泵中，或者 以在溶液中的游离形式提供。所述CPE也可以具有水凝胶形式。如果所述CPE以在溶液 中的游离形式提供，在被CPE俘获后，可以采用任何方式分离错折叠蛋白质的，例如通过沉 淀、离心、吸附、吸收、干燥、煮沸或蒸发来分离。可选地，可以官能化所述CPE以提供检测、 固定、促进俘获、增加选择性、增加亲和性或对测定有意义的其它特征的方式(means)。有趣的是，可以使用共轭聚电解质，如聚(噻吩)、聚(3，4-乙烯基二氧基噻吩)或 聚(吡咯)来检测错折叠蛋白质[W02005109005]。由于通过采集系统反应的放大，基于共 轭聚电解质的传感器对于非常小的干扰非常灵敏，因此，与现有技术的基于分子的传感器 相比，其提供了重要的优点，所述聚电解质也提供了病原性朊病毒蛋白质的直接检测。根据
5本发明，将CPEs的该直接检测功能与俘获错折叠蛋白质的独特能力相结合，从而提供了比 常规免疫组织学技术极大的优点，因为常规免疫组织学技术的方法通常需要使用用于俘获 的一级抗体和用于显影错折叠蛋白质的二级抗体。使用共轭聚电解质作为用于错折叠蛋白 质的俘获剂的可能性要求聚合物与水相环境相容，这已经通过制备共轭的发光聚电解质实 现了。在本发明中，描述了一种使用CPEs俘获错折叠蛋白质的新方法。可以使用CPEs实 现样品中错折叠蛋白质的分离，例如从所述样品中去除它们，这在之前从来没有描述过。提 供一种使用CPEs来染色和俘获样品溶液中错折叠蛋白质，接着沉淀的方法。使用CPEs的 方法具有不同于其它淀粉样营养(amyloidotrophic)染料如刚果红和ThT的其它性质，最 重要地是CPEs提供错折叠蛋白质的俘获。因此，在本发明中预期了使用CPEs俘获错折叠 蛋白质的几种方法。所述CPE可以固定在固体载体上，从而提供一种具有高选择性和高亲 和性的俘获错折叠蛋白质到所述固体载体，从而从样品中分离或去除其的方法。在本发明的进一步的方面，提供一种俘获错折叠蛋白质的方法，包括将如上定义 的共轭聚电解质暴露于样品，其中所述共轭聚电解质选择性地俘获样品中错折叠蛋白质。一方面，本发明涉及用于俘获固体载体上的样品中错折叠蛋白质物种的方法，其 包括以下步骤-将至少一种共轭聚电解质(CPE)固定在固体载体上-使样品与所述CPE接触_可选地，加入竞争剂-从样品中去除所述固体载体或者从样品中分离所述固体载体，或-洗涤所述固体载体，而不从CPE相中去除俘获的错折叠蛋白质-可选地，通过优选的方法检测俘获的错折叠蛋白质，然后，由此原始样品溶液不 包含或包含很少错折叠蛋白质。另一方面，本发明涉及用于俘获溶液中的样品中错折叠蛋白质物种的方法，其包 括以下步骤-使样品与至少一种共轭聚电解质(CPE)结合_可选地，加入竞争剂-从样品中分离俘获的错折叠蛋白质-可选地，通过优选的方法检测俘获的错折叠蛋白质，然后，由此原始样品溶液不 包含或包含很少错折叠蛋白质。在本发明进一步的实施方案中，将竞争剂加入到溶液中以增加俘获错折叠蛋白质 的CPE与结合例如非特异性结合天然或未折叠的蛋白质的CPE的区别性。这样的试剂包括， 但不限于洗涤剂、离子、盐、螯合剂和溶剂。如果进行对CPE俘获的错折叠蛋白质的检测，在本发明的方法中使用的辐射具有 的波长为约IOOnm至约2000nm之间。在一个实施方案中，使用在可见范围中的辐射。使用 多个光子激发也是可能的，因此，使用2x或3x(分别为双光子和三光子激发)的辐射代替 χ nm的激发辐射。另一方面，本发明涉及实施根据本发明的方法的装置。这样的装置设有固定在固 体载体上或溶液中的使CPE与样品接触的部件、用于可选地加入竞争剂的部件、可选地从样品中去除CPE或从样品中分离CPE的部件、可选地洗涤CPE相而不会从所述CPE相中去 除俘获的错折叠蛋白质的部件、可选地通过优选的方法检测俘获的错折叠蛋白质的部件以 及可选地收集暴露于所述CPE的样品溶液的部件。优选地，在本发明中使用的共轭聚电解质包括噻吩、吡咯、苯胺、呋喃、亚苯基、亚 乙烯基、芴、乙烯基二氧噻吩及其取代形式的共聚物或均聚物，所述共轭聚电解质可以具有 一个或多个离子侧链官能度，如氨基酸、氨基酸衍生物、神经递质、单糖、核酸或其组合和化 学修饰的衍生物。所述离子官能度可以包括一个或多个阴离子和阳离子侧链官能度。在本发明中所用的CPE也可以具有末端官能化的基团，其中所述官能基可以为， 但不限于DNA、RNA、肽、氨基酸、组氨酸(histidin)、组氨酸10 (histidinlO)、蛋白质、肽支 架(ρ印tide scaffolds)、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、螯合剂、活性基团、抗体、 酶、配体、受体配体、类固醇、生物分子或其它分子、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、金微粒、磁 珠、蛋白质涂布的珠粒、肽涂布的珠粒、超磁(supramagnetic)珠粒或颗粒、钆纳米颗粒、钆 离子、掺杂镧系元素的纳米颗粒、掺杂镧系元素的氧化钆纳米颗粒、镧系元素颗粒。在本发明进一步的实施方案中，用DNA、RNA、肽、氨基酸、组氨酸、组氨酸10、蛋白 质、肽支架(ρ印tide scaffolds)、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、螯合剂、活性基 团、抗体、酶、配体、受体配体、类固醇、生物分子或其它分子、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、 金微粒、磁珠、蛋白质涂布的珠粒、肽涂布的珠粒、超磁珠粒或颗粒、钆纳米颗粒、钆离子、掺 杂镧系元素的纳米颗粒、掺杂镧系元素的氧化钆纳米颗粒、镧系元素颗粒官能化的CPE可 以为实质上共价的或非共价的。在本发明的一方面提供一种方法，其检测从屏障如管壁、膜、皮肤等的后面的天然 形式蛋白质中错装配/聚集形式的蛋白质，特别是淀粉样原纤维和病原性形式的蛋白质的 形成，该方法包括注入、流入、泵入、吸入、输入或通过其它方式将样品暴露于屏障之后，并 通过适当的检测部件(means of detection)来检测所述屏障之后或之内的所述错折叠的 靶蛋白。用于检测和给药CPEs的部件可以变化，这取决于根据本发明的侧-链或末端官能 化，其在说明书的其它部分举例说明。本发明的另一方面提供用于涉及错装配/聚集形式的蛋白质，特别是淀粉样原纤 维和病原性形式的蛋白质形成的疾病的基于共轭聚电解质的治疗方法和治疗剂，所述疾病 如阿尔茨海默氏病、克雅病(CJD)、变异的克雅病(vCJD)、继发性淀粉样变性、2型糖尿病、 传染性海绵样脑病(TSE，如CWD、羊瘙瘁病、GSS和库鲁症、牛海绵样脑病(BSE))。本发明的另一方面为生物测定，其依靠在天然蛋白质的存在下，使用CPE俘获淀 粉样形式、错折叠形式或病理性形式的蛋白质的步骤期间的全面区分，和随后通过适当的 方法来检测，如基于比色、吸光度、或荧光的方法。避免假阳性和避免假阴性结果非常重要。 天然蛋白质的选择性蛋白水解可以是但并不必需，获得这点的一种方法。本发明的另一方面涉及CPEs的独特性，其不仅俘获错装配形式、错折叠形式、聚 集形式或病原性形式的蛋白质的俘获，而且能够起俘获剂的作用，同时如有必要，其可报道 所述俘获事件，并将其转化成光信号和可检测信号。可能希望鉴定的多种形式的错折叠蛋白质意味着，在更进一步的方面，本发明也 可以以微阵列的形式实施，该微阵列要求将检测系统固定和模式化在表面上。然后，在溶液 中或在固体载体上，使用本发明的共轭聚电解质作为错折叠蛋白质的俘获剂，并且如果期望或需要，使用其作为用于所述俘获事件的检测剂。本发明的全部范围为附加权利要求书定义的。


图1 基于聚-噻吩主链和混合型聚_噻吩_苯主链的不同的CPEs的某些选择实 例的化学结构。可以构建侧链变化和定义的主链尺寸。这些已经给出了如下单纯的命名 POffT, PTAA, POMT, PT2、tPOWT、tPTMl、f-PONT、L-POMT 禾口 D-POMT0图2 官能化的CPEs。Rl和R2 =末端/端官能化的。Rl和R2可以相同或不同。 Rs =侧链。图3 使用末端官能化的CPE或没有末端官能化的CPE的任意淀粉状蛋白聚合物 的俘获示意图。该图形并不是按比例描绘的，并且不能代表CPE和淀粉状蛋白之间的尺寸 关系。在本发明中，在错折叠蛋白质中淀粉状蛋白单体的数量可以在一个至多个之间。而 且，CPEs可以固定在固体载体上，该实例显示在后面的图形中。官能化的或未官能化的CPE 分子的数量可以是一个至多个中的任何情形。在示意图中，侧链(Rs)没有显示。图4:显示使用固定在固体载体上的CPE俘获错折叠蛋白质的示意图。将样品暴露 于固定在固体载体上的官能化的或未官能化的CPE中，由此所述CPE俘获所述样品中错折 叠蛋白质。该图形不是按比例描绘的，并且不能代表CPE和错折叠蛋白质之间的尺寸关系。 官能化的或未官能化的CPE分子的数量可以是一个至多个中的任何情形。在示意图中，侧 链(Rs)没有显示。图5 显示使用CPE在合适的固体载体如载玻片、玻璃珠、过滤矩阵、分离矩阵等上 俘获错折叠蛋白质的示意图。将样品暴露于固定在固体载体上的官能化的或未官能化的 CPE中，由此所述CPE俘获所述样品中错折叠蛋白质。该图形不是按比例描绘的，并且不能 代表CPE和错折叠蛋白质之间的尺寸关系。官能化的或未官能化的CPE分子的数量可以是 一个至多个中的任何情形。在示意图中，侧链(Rs)没有显示。图6 使用重量沉降法检测CPE PTAA染色的PrP-淀粉状蛋白的原理。也给出PrP 的晶体结构的尺寸作为微小聚集体中PrP含量的粒径参考。图7 显示使用以CPE涂布的磁珠俘获错折叠蛋白质的示意图。用官能化的CPE， 例如用生物素官能化的CPE涂布磁珠，例如用抗生物素蛋白涂布的磁珠。将样品暴露于含 有CPE的磁珠，由此所述CPE俘获所述样品中错折叠蛋白质。该图形不是按比例描绘的，并 且不能代表CPE和错折叠蛋白质之间的尺寸关系。可以使用磁铁作为收集/浓缩步骤。CPE 分子的数量可以是一个至多个中的任何情形。在示意图中，侧链(Rs)没有显示。在俘获和 使用磁铁收集/浓缩步骤之后，可以包括任选的检测步骤。图8 显示使用生物素官能化的CPE和抗生物素蛋白涂布的表面俘获错折叠蛋白 质的示意图。所述官能化的CPE可以是原态或者在珠粒上。将样品暴露于CPE，其中所述 CPE俘获所述样品中错折叠蛋白质。可以使用抗生物素蛋白涂布的表面作为收集/浓缩步 骤。该图形不是按比例描绘的，并且不能代表CPE和错折叠蛋白质之间的尺寸关系。CPE分 子的数量可以是一个至多个中的任何情形。在示意图中，侧链(Rs)没有显示。在俘获和表 面收集/浓缩步骤之后，可以包括任选的检测步骤。图9 在通过0. 22 μ m过滤器过滤前后，在20mM pH 8的磷酸盐缓冲液中的包含胰
8岛素的0. 5mg/ml PTAA的荧光光谱。图10 在通过0.8μπι过滤器过滤后，在20mM pH 8的磷酸盐缓冲液中包含0、5、50 和100%原纤维的胰岛素的0. 5mg/mlPTAA的荧光光谱。图11 在通过0. 8 μ m过滤器的逆-过滤(back-filtration)后，在20mM pH 8的 磷酸盐缓冲液中包含0、5、50和100%原纤维的具有胰岛素的0. 5mg/ml PTAA的荧光光谱。图12 使用PTAA-原纤维复合物的离心来俘获原纤维，接着进行荧光测量。图13 荧光光谱，其证实一些选择的CPEs和Gd203纳米颗粒之间的相互作用。所 述测量在重蒸馏水中进行。
具体实施例方式一般而言，本发明涉及一种使用共轭聚电解质俘获错装配形式、错折叠形式或聚 集形式的蛋白质，特别是淀粉样原纤维和病原性形式的蛋白质的新方法。将所述错折叠蛋 白质暴露于共轭聚电解质(CPE)中，由此CPE俘获、结合或离析所述目标错折叠蛋白质。与 对于天然折叠的蛋白质相比，对于错折叠蛋白质，可以进行具有高亲和性或高选择性的俘 获。在其中共轭聚电解质结合错折叠的改变的蛋白质，如PrPse或Α-β蛋白质的条件下，进 行所述俘获，优选地，但不是必须的，其中这样的共轭聚电解质结合这些异常形式而不会结 合它们的非聚集正常的天然形式。期望CPE和目标错折叠蛋白质之间的非共价结合以足够 高的亲和性和在所选条件下发生并且具有足够的选择性，以在测定中有益于从样品中俘获 或离析聚集的、错折叠的改变的蛋白质。根据本发明，术语俘获(capture)、结合(binding)或离析(isolation)是一般性 术语分离(separation)的子集。可以使用CPEs实现样品中错折叠蛋白质的分离，例如从 所述样品中去除它们，这是以前从来没有描述过的。例如，可使样品溶液流过具有固定在固 体载体上的CPE/CPEs的所述固体载体或流入其内部。所述CPE/CPEs的作用是从样品中俘 获错折叠蛋白质，同时也从样品中分离错折叠蛋白质。如在本申请中使用的术语“俘获(capture)”指一种探针(probe)，其可以在 回体或体内结合错折叠蛋白质，从而在非聚集正常形式的所述蛋白质存在下，将其分离 (separate)、离析(isolate)或固定。本发明是基于使用与所述错折叠蛋白质相互作用的共轭聚电解质来非共价性俘 获错折叠的、异常的、错装配的、聚集的或病原性的蛋白质。所述相互作用在没有共价键合 下发生，其基于共轭聚电解质和错折叠蛋白质之间的偶极-偶极键合、氢键键合、静电-和 非极性相互作用，本文称为非共价键合，其进一步包括任何类型的天然非共价的键合。本发明的某些方面可以提供共轭聚电解质与某些实体的共价连接，所述实体如蛋 白质、错折叠蛋白质、肽、生物分子、其它分子或表面。因此，本发明的一方面是一种方法，其中在天然形式的蛋白质的存在下，使用共轭 聚电解质分离，例如选择性俘获、结合或离析错折叠蛋白质、聚集的异常形式或病理性形式 的蛋白质。将样品暴露于固定在固体载体上或任何尺寸的珠粒上的共轭聚电解质中，所述 珠粒呈水凝胶或呈溶液提供，由此所述共轭聚电解质俘获、结合或离析任何错折叠的、聚集 的、错装配的或病原性的蛋白质。所述方法可以在这样的条件下进行其中所述高亲和力 (avidity)共轭聚电解质可以选择性地俘获所述错折叠蛋白质，其对于在包含天然形式和正常形式的蛋白质以及错折叠的形式的蛋白质的样品中的所述错折叠的形式具有高选择 性。所述共轭聚电解质可以固定在合适类型和可适用形状的固体载体上，其中所述固 体载体的表面存在样品的共轭聚电解质。所述固体载体的形状和尺寸可以是任意类型，例 如圆形、扁平形或珠粒形，表面可以用共轭聚电解质以非共价方式改性，或在所述固体载体 结构内共价键合或附着于所述固体载体的表面。根据本发明的固体载体也构成管、透析装 置、泵、胰岛素泵、给药蛋白质的装置、注射器和针。当固定在固体载体上时，所述共轭聚电 解质可以是任何合适的形式，例如呈水凝胶、聚合物膜、游离的CPEs、支架或层状的。当用作 俘获错折叠蛋白质的试剂时，所述CPEs也可以以在溶液中的游离形式提供。如果所述CPE 以在溶液中的游离形式提供，可以采用任何方法去除CPE俘获后的错折叠蛋白质，例如沉 降、离心、吸附、吸收、干燥、煮沸或蒸发。可选地，所述CPE可以被官能化，以提供用于检测、 固定、促进俘获、增加选择性、增加亲和性或对于测定有意义的其它事情的方法。所描述的俘获、结合或离析条件可以包括存在提供给样品的竞争剂，其中与共轭 聚电解质相比，竞争剂对于错折叠的形式的蛋白质具有更小的结合亲和力。通常，如果使用 竞争剂，其比共轭聚电解质具有更少的亲和性或选择性。可选地，可以将共轭聚电解质涂布在固体载体表面上或键合在其上。在科学文献中，已经报道了淀粉样形式的蛋白质，或至少蛋白酶敏感形式的错折 叠蛋白质可能与聚阴离子相互作用。这些带负电的聚合物可能与错折叠蛋白质结构的带正 电荷的区域相互作用，并且可能与聚集的蛋白质存在多种相互作用。我们发现共轭聚电解 质能结合错折叠蛋白质聚集体，或者错折叠蛋白质的小的结合物，所述结合物甚至可以小 至淀粉状蛋白的两个单体，其结构具有比这些聚阴离子高得多的亲和力，因此，其甚至可以 替换所述聚阴离子化合物。CPEs的高亲和力的一个可能的机制是CPEs可以与具有带电荷 的取代基和疏水性共轭主链的错折叠蛋白质同时形成聚离子以及疏水性相互作用。因此， 固定在表面或溶液中的共轭聚电解质可以特别地俘获异常蛋白质。天然蛋白质是非聚集 的，通常不会具有与聚阴离子的高亲和性相互作用。可以选择所述测定条件，使得较低亲和 性的阴离子如洗涤剂萨考西(Sarkosyl)的存在，通过与固定的CPE或在溶液中的CPE竞争 来更进一步改善俘获特异性。可以偶联使用CPE的分离，例如俘获、结合或离析样品中的错折叠的、聚集异常形 式或病理形式的蛋白质，以改变所述CPE响应俘获、结合或离析所述错折叠蛋白质的性质。 可以通过例如光学方法，如荧光或吸收来检测CPE的性质变化，然后，使用其来确定何时发 生所述俘获事件。其它检测方法根据本发明的方面，可以官能化所述共轭聚电解质，以实现有效或期望的用于检 测分离的方法。通过合适的方法进行检测键合或接触所述错折叠蛋白质的共轭聚电解质的 其它方法，所述合适的方法如双光子或多光子光谱学、磁共振成像(MRI)、PET等。在此描 述了使屏障后的CPE和错折叠蛋白质的相互作用成像的一个实例，但存在其它显而易见的 方法，所述屏障如管、膜、管、皮肤等。可以使用例如双光子或多光子光谱学或磁共振成像 (MRI)在所述屏障后以一些方式检测共轭聚电解质或官能化的共轭聚电解质，然后使用其 确定何时发生了所述分离，例如俘获或结合事件。
作为治疗剂的CPE本发明还涉及共轭聚电解质作为新的治疗剂的用途，其中一种作用方式为干扰体 内淀粉状蛋白的形成。当注射进入生物体时，所述CPE可以改变淀粉状蛋白的病理过程， 即，通过起治疗的药效团作用影响疾病的发病。因此，当临死前诊断和治疗对于公共卫生具 有巨大的影响和极大的利益时，在本发明中预期了该治疗剂，所述治疗剂为用于蛋白质错 折叠疾病，特别是阿尔茨海默氏病和朊病毒病的基于CPE的治疗剂。在一个实施方案中，本发明提供一种方法，其中共轭聚电解质直接俘获所述错折 叠蛋白质。在这种情况下，所述俘获在没有共价键合下发生，其是基于共轭聚电解质和生物 分子之间偶极-偶极键合、氢键键合、静电_和非极性的相互作用，本文称为非共价键合，其 进一步包括任何类型的天然非共价的键合。如在本申请中使用的术语“直接俘获”指一种探针(probe)，其可以通过直接键合 所述错折叠蛋白质的来直接俘获错折叠蛋白质，从而将其从样品离析或固定在样品中，而 不需要其它高分子化合物。如本文中使用的术语“亲和力(avidity) ”应当采取其通常的含义，指分子与多价 结合剂的许多结合位点的整体结合强度。这应当与“亲和性(affinity)”形成对比，其为各 单独结合位点和分子及粘合剂的结合强度。例如通过将所述共轭聚电解质固定在基质上，有可能适当地将官能化或未官能化 的共轭聚电解质作为俘获装置的活性组分实施。所述俘获装置包括用于所述基质的合适的 容器，并且共轭聚电解质和错折叠蛋白质的复合物在该基质上形成。可选地，所述CPE用于 检测当其出现时的俘获事件。然而，其它构造方式是可能的，例如所述共轭聚电解质可以以溶液提供，并且穿过 流动池，同时将蛋白质溶液与复合物溶液流体混合。可以通过各种分析技术监测俘获。特别地，本发明使得用与错折叠蛋白质相互作用的共轭聚电解质俘获与疾病相关 的错折叠蛋白质。在研究用于诊断涉及错折叠蛋白质的疾病的方法中，错折叠蛋白质的俘 获是从样品中去除错折叠蛋白质、检测在屏障后在样品中错折叠蛋白质的分离以及基于共 轭聚电解质的各种治疗技术所必需的。显示出上述讨论的特征的共轭聚电解质的实例为聚(3-[(S)-5-氨基-5-羧 基-3-噁戊基]_2，5-硫代亚苯基盐酸盐)(POWT)、聚噻吩乙酸(PTAA)、聚(3-[⑶-5-氨 基-5-甲氧基羧基-3-噁戊基]-2，5-硫代亚苯基盐酸盐)(Ρ0ΜΤ)、聚((3，3 〃 -二 [(S)-5-氨基-5-羰基-3-噁戊基]-[2，2' ；5'，2〃 ])_5，5〃 -叔硫代亚苯基盐酸盐) (tPOWT)、聚((1，4_ 二(3-[⑶-5氨基-5-羰基-3-噁戊基]-噻吩-2-基)-苯)盐酸 盐)(f-PONT)、聚(3- [ (R) -5-氨基-5-甲氧基羧基-3-噁戊基]-2，5-硫代亚苯基盐酸盐) (D-POMT)、聚(3- [ (S) -5-氨基-5-甲氧基羧基-3-噁戊基]-2，5-硫代亚苯基盐酸盐) (L-POMT)及其它物质，参见图1。在本发明中，可以为包括这些及其它类型的共轭聚电解质 如吡咯、乙烯基二氧噻吩、芴等的变体，包括L和D对映异构体。CPE的长度可以是固定的、 可变的、单分散的或多分散的。加入到侧链(Rs)或末端(Rl和R2)的官能基显示在图2中。这些可以是，但不限 于荷电阴离子的、阳离子的或两性离子的，具有在不同PH的pKa，这使得这些聚噻吩衍生物 适于与带负电荷的或带正电荷的低聚物和聚合物形成聚电解质复合物。另外，所述离子基
11团与不同的分子建立了多种氢键键合模式。对于CPEs俘获错折叠蛋白质的独特的能力，提 出的理由之一是亲和力，但本发明不应当受此提议的束缚。观察错折叠蛋白质的一个方法 可以是将其看作是具有沿着分子轴的可替代的或重复的电荷分布的聚离子分子。本发明的 特制的CPEs可以与错折叠蛋白质形成非常强的非共价相互作用，从而俘获它们，参见图3 中示意图说明。可以提供其中官能基为下述的末端官能化的共轭聚电解质用于表面固定、 继发俘获或用于根据本发明的屏障后的检测部件所述官能基可以为，但不限于DNA、RNA、 肽、氨基酸、组氨酸、组氨酸1(1、蛋白质、肽支架、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、螯合 齐U、活性基团、抗体、亲和性肽支架、scFV、FAB、酶、配体、受体配体、类固醇、生物分子或其它 分子、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、金微粒、磁珠、蛋白质涂布的珠粒、肽涂布的珠粒、超磁 珠粒或颗粒、钆纳米颗粒、氧化钆颗粒、钆离子、掺杂镧系元素的纳米颗粒、掺杂镧系元素的 氧化钆纳米颗粒、镧系元素颗粒。可以选择CPE以使其具有如下能力在非选择性条件下，具有同时俘获错折叠的、 聚集改变的或劣种形式的蛋白质以及非聚集的正常形式的蛋白质的能力，和在选择性条件 下，选择性俘获错折叠蛋白质的能力。如有必要，可以在非选择性条件下和改变其光学性质 的选择性条件下，将CPE固定在固体载体上或溶液中，如此，则有可能区别所述CPE是俘获 错折叠蛋白质或是天然蛋白质。可以通过调节样品、根据PH的反应液或洗涤液、离子强度、 缓冲液的选择，或者通过加入盐、离子、金属离子、洗涤剂、聚电解质、蛋白质、颗粒或螯合剂 来获得合适的非选择性条件或选择性条件分析条件。而且，向样品、反应液或洗涤液中加入一种或多种试剂是可能的，所述试剂能够增 加结合错折叠蛋白质的CPE和与正常蛋白质相互作用的CPE的区别，按这种方式，增加了 俘获给定样品中错折叠蛋白质的选择性。在这种情况下，CPE可以以固定在固体载体上或 溶液中提供。这样的试剂包括洗涤剂如Triton-X、皂苷、SDS、萨考西、正-十二烷基肌氨 酸(laurosylsarcosine)、脂肪酸肌氨酸、CHAPS、Bri j、辛基_b_糖苷、吐温20、乙基苯基聚 乙二醇(Nonidet)P-40或其它变体，离子和盐如金属离子、分子离子和有机离子，螯合剂如 EDTA、EGTA、2，2' -二吡啶基、二巯基丙醇、离子载体(Ionophores)、氨三乙酸、邻-菲咯啉、 水杨酸和三乙醇胺，溶剂如水、醇、有机溶剂、氯化溶剂、胺化溶剂和磺化溶剂及其它试剂， 如聚合材料、聚电解质(两性离子的、阴离子的或阳离子的)、糖类(包括多糖)、具有超过 一个配位基团的有机酸、脂质类固醇、氨基酸和相关化合物、肽、磷酸盐、核苷酸、四吡咯、铁 草胺、离子载体，如短杆菌肽、莫能菌素和缬氨霉素酚醛塑料。其它试剂包括蛋白质，如胰蛋 白酶、蛋白酶K、抗体、血清白蛋白等。可以将所述共轭聚电解质作为装置的活性部分合适地施用，所述装置俘获、分离、 结合或去除样品中错折叠蛋白质。这可以通过，例如将所述共轭聚电解质固定在基质上， 然后通过合适方式暴露于样品来实现(参见用于两个实施例的图4和5)。合适地，所述 装置包括用于所述基质的合适的容器，并且共轭聚电解质和错折叠蛋白质的相互作用在该 基质上形成，由此其俘获、分离、结合或去除样品中错折叠蛋白质。所述共轭聚电解质可以 是使用那些识别或鉴定错折叠蛋白质(例如PrPSe、PrFes、淀粉状蛋白-β、原纤维形式的 A β (1-40), A β (1-42)或Αβ (1_43)、淀粉状蛋白-β (Α β )肽、在透析-相关淀粉样变性 (DRA)中的β-2-微球蛋白分子、ΙΑΡΡ、在帕金森氏症中的α-突触核蛋白或在亨廷顿氏病 中的亨廷顿蛋白)的抗体的系统的一部分，所述错折叠蛋白质已经或将要被CPE俘获。可选地，可以使用共轭聚电解质作为报道错折叠蛋白质的俘获的光学探针(参见用于两个实 施例的图4和5)。然而，其它方式是可能的，例如所述共轭聚电解质可以在溶液中提供，用 于俘获、同时在样品中或体内进行染色错折叠蛋白质。继而可以用在溶液中或固体载体上 的抗体来鉴定或识别错折叠蛋白质。下述的发明的详细说明将分别涉及共轭聚电解质、错折叠的、异常的、聚集的、劣 种的或病原性的蛋白质、涉及所述错折叠蛋白质的疾病、从样品溶液中俘获所述错折叠蛋 白质的方法、共轭聚电解质在固体载体上的固定和阵列。最后，本发明采用多个实验举例证 实其实用性。I共轭聚电解质本发明涉及多种共轭聚电解质，其具有最少三个单元，所述单元衍生自下述单体 噻吩、吡咯、苯胺、呋喃、亚苯基、亚乙烯基、芴、乙烯基二氧噻吩或其取代的形式、形成的其 均聚物及共聚物。所述共轭聚电解质可以是单分散的，由具有定义明确的链长的聚电解质 链组成，或者是多分散的，由具有不同链长的聚电解质链组成。而且，具有阴离子的、阳离子 的或两性离子的侧链官能度的单体包括在本发明的范围内。所述侧链官能度来源于，但不 限于氨基酸、氨基酸衍生物、神经递质、单糖、核酸，或其组合和其化学改性的L和D对映异 构体，或其衍生物。本发明的共轭聚电解质可以包含单个侧链官能基，或者可以包括两个或 多个不同的侧链官能基。在不同PH下，带阴离子或阳离子电荷的共轭聚电解质的官能基使 得这些聚电解质衍生物适于与带负电荷或带正电荷的低聚物和聚合物形成强的聚电解质 复合物。另外，所述离子基团与不同的分子建立了多种氢键键合模式。本发明的某些方面可以提供共轭聚电解质与某些实体的共价连接，所述实体如蛋 白质、错折叠蛋白质、肽、生物分子或其它分子。在图1或图2中，加入到侧链(Rs)或末端(Rl和R2)上的官能基可以是，但不限 于具有在不同PH的pKa的带电荷的阴离子、阳离子、或两性离子官能基，这使得这些聚噻吩 衍生物适于与带带负电荷的或带正电荷的低聚物和聚合物形成聚电解质复合物。另外，所 述离子基团与不同的分子建立了多种氢键键合模式。对于CPEs俘获错折叠蛋白质的独特 的能力，提出的原因之一是亲和力，但本发明不应当受此提议的束缚。观察错折叠蛋白质的 一个方法可以是将其看作是具有沿着分子轴的可替代的或重复的电荷分布的聚离子分子。 本发明的特制的CPEs可以与错折叠蛋白质形成非常强的非共价相互作用，从而俘获它们， 参见图3中示意图说明。可以提供其中官能基为下述的末端官能化的共轭聚电解质用于 表面固定、继发俘获或用于根据本发明的屏障后的检测部件所述官能基可以为，但不限于 DNA、RNA、肽、氨基酸、组氨酸、组氨酸1(1、蛋白质、肽支架、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物 素、螯合剂、活性基团、抗体、亲和性肽支架、scFV、FAB、酶、配体、受体配体、类固醇、生物分 子或其它分子、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、金微粒、磁珠、蛋白质涂布的珠粒、肽涂布的珠 粒、超磁珠粒或颗粒、钆纳米颗粒、氧化钆颗粒、钆离子、掺杂镧系元素的纳米颗粒、掺杂镧 系元素的氧化钆纳米颗粒、镧系元素颗粒。II错折叠蛋白质本发明的共轭聚电解质俘获目标错折叠蛋白质。在本发明中，术语错折叠蛋白质 应当以其广义理解，包括错装配的蛋白质、病理形式或劣种形式的蛋白质，即淀粉样形式、 错折叠形式或聚集形式的蛋白质，如噬斑，优选地，所述错折叠蛋白质可以是享有特异性结
13构特征的不溶性纤维状蛋白聚集的淀粉状蛋白。所述俘获在没有共价键合下出现，其基于共轭聚电解质和错折叠蛋白质之间的偶 极_偶极键合、氢键键合、静电_和非极性相互作用。所述共轭聚电解质可以与正常天然蛋 白质和错折叠蛋白质相互作用。所述共轭聚电解质也可以俘获在体外制备的淀粉状蛋白或 错折叠蛋白质。不受理论的束缚，目前假设在合适的测定条件下，共轭聚电解质可以特异性 地和具有高亲和性地俘获错折叠蛋白质。可以化学修饰所述错折叠蛋白质，以便其被选择 的共轭聚电解质俘获。衍生化不同范围的蛋白质的方法是熟知的。例如，可以容易地改性 氨基酸侧链以使其包含极性和非极性基团或具有氢键键合能力的基团。所述错折叠蛋白质 可以在溶液中、在固相上、在体内、在体外或在组织样品中，错折叠蛋白质的俘获可以在水 溶液中、有机溶剂中、体液中、固相上或组织样品中进行。可以包含错折叠蛋白质的体内或体外的目标样品包括，但不限于血液、脑、外周组 织、均质化的脑、均质化的外周组织、体液、活组织检查、尿、脑脊液(CSF)、淋巴液及其它合 适的样品。基于错折叠蛋白质俘获的测定具有极大的商业利益、巨大的诊断价值，可作为治 疗剂以及用于俘获血液(筛选血液制品)或其它复合物介质中错折叠蛋白质的选择性测定 和来自脑、肌肉、脂肪、粘液、神经、血管或其它组织的组织切片的染色。III与错折叠蛋白质相关的疾病特征为淀粉状蛋白的疾病是用于说明与错折叠蛋白质相关的疾病的相应实施例， 其中淀粉样变被称为一种可以遗传的或获得的疾病。注意默认的淀粉样变通常指AA淀粉 样变，但是其中存在淀粉状蛋白沉降的与淀粉状蛋白相关的任何疾病都是淀粉样变。例如 CJD、vCJD、阿尔茨海默和糖尿病几乎都不被称为淀粉样变。在该段中，指出了至今相关的淀粉样变的一些实例。原发性淀粉样变包括溶菌酶、 运甲状腺素蛋白、载脂蛋白B、纤维蛋白原中的突变和AL淀粉样变(免疫球蛋白轻链，如在 多发性骨髓瘤中看到的)。继发性淀粉样变性包括AA淀粉样变(血清淀粉样A蛋白质，一 种由于慢性炎引起的急性期蛋白质)和凝溶胶蛋白淀粉样变(血浆凝溶胶蛋白片段)。家 族性淀粉样变或遗传性淀粉样变最常见的是由运甲状腺素蛋白的突变引起，但是在很少情 况下，也可以由载脂蛋白Al、凝溶胶蛋白、纤维蛋白原和溶菌酶突变引起，其主要是由遗传 引起，被认为是常染色体显性的、传代至后代的高概率的、阿巴拉契亚(Appalachian)类型 的淀粉样变和在沙皮狗(Shar Peis)中的淀粉样变的沙皮狗热病(Shar Pei fever)。器 官特异性淀粉样变的实例为2型糖尿病(糊精，也称为IAPP)、神经病学、阿尔茨海默氏病 (Α β 39-42)、帕金森氏症(α -突触核蛋白)、亨廷顿氏病(亨廷顿蛋白)、传染性海绵样脑 病(朊病毒蛋白质，PrP)，某些实例为克雅病(在大脑中的PrP)、库鲁症(在脑中沉积的弥 漫性的PrP)、致命性家族性失眠症(在丘脑中的PrP)和牛海绵样脑病(在母牛大脑中的 PrP)、嗜刚果红样血管病(Congophilic angiopathy)(淀粉状蛋白β )。心脏淀粉样变包括 充血性心力衰竭；某些实例(在心脏中的PrP或运甲状腺素蛋白)。包涵体肌炎。另一种 重要的实例是医原性的病症，如胰岛素淀粉样变，其被认为是由于注射给药胰岛素引起。某些非疾病淀粉状蛋白为在生物体中的天然淀粉状蛋白、卷曲大肠杆菌(Curli Ε. coli)蛋白质(curlin)、酵母菌朊病毒[Sup35]、鹅柄孢壳菌(Podospora Anserina)朊 病毒Het-s、疟疾的外壳蛋白、蜘蛛丝、哺乳动物黑素体(pMel)、组织型纤溶酶原激活物 (tPA)、血液动力学因子、降钙素和蛋白质及设计制造淀粉状蛋白的肽。
所述朊病毒疾病[例如牛海绵样脑病(BSE)和克雅病(CJD)]与正常细胞的朊 病毒蛋白质(PrPe)的构型转化至表示为PrPseW传染病-相关的同工型相关。所述错折 叠的感染形式的蛋白质PrPse是一组罕见的、致命性脑病的原因，所述致命性脑病被称为 朊病毒疾病，其影响人类和哺乳动物。所述朊病毒疾病也称为传染性海绵样脑病(TSE)， 它们包括牛中的牛海绵样脑病(BSE，或“疯母牛”病)；绵羊中的羊瘙瘁病；在鹿和麋 鹿中的慢性消耗性疾病；和人类中的疾病[克雅病(CJD)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克 (Gerstmann- Straussler -Scheinker)疾病(GSS)、库鲁症]。本发明的共轭聚电解质意 味着用于俘获与这些疾病相关的病原性朊病毒的方法。IV检测方法如已经指出的，本发明是基于使用共轭聚电解质、官能化的共轭聚电解质或其组 合来从样品中俘获、结合、分离或去除错折叠蛋白质。可以通过非限定性的如下方法观察所 述俘获事件荧光、福斯特(Fdrster)共振能量转移(fret)、淬灭发射光、吸收、双光子或 多光子光谱学、磁共振成像(MRi)、动态光散射(DLS)、电或磁反应、电化学、电流分析法、库 仑法、重量分析法、偏振或各向异性、荧光相关光谱学(FCS)、石英晶体微量天平、具有耗散 的石英晶体微量天平或其它技术和物理性质。可以通过荧光计记录发射强度，增强流入检 测器中的光子可以增加敏感性。这可以使用灯或激光作为激发光源来获得。也可以通过使 用荧光显微镜或共焦显微镜检测荧光的变化。可以使用激发或发射滤光片的组合，并且可 以通过CXD-照相机、摄像机、普通照相机或偏振照相机记录图像。然后，可以通过在计算机 中的图像处理软件、图像相关光谱学(ICS)或其它方式分析图像。V共轭聚电解质和蛋白质的固定在本发明中使用的共轭聚电解质、生物分子、错折叠蛋白质、抗体、蛋白质、肽、错 折叠蛋白质或其它分子可以固定在多种固体载体上，所述固体载体包括，但不限于硅晶片、 玻璃(例如载玻片、玻璃珠)、玻璃碳、硅橡胶、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、特富龙(聚四氟 乙烯)、硅胶小球、金、氧化铟锡、滤纸(例如尼龙、纤维素和硝基纤维素)、标准复印纸或变 体和隔离介质、其它层析介质、磁珠或颗粒、超磁珠粒或颗粒、钆、氧化钆颗粒或本发明中有 用的其它固体载体。可以通过使用例如，但不限于浸涂、旋涂、接触印刷、丝网印刷、喷墨技 术、喷雾、分散和通过使用软的平版印刷术或BIAC0RETM(BiaCOre，Uppsala, Sweden)系统的 微流体印刷(microfluidic printing)来获得共轭聚电解质至固体载体的转移。共轭聚电解质的固定可以通过物理粘附或共价结合至固体载体获得，并且其可以 在高温下进行，或者通过包埋在水凝胶基质中进行。期望本发明共轭聚电解质的固定可以 改善它们的使用容易性、装配进入装置(例如阵列)、稳定性、坚固性、荧光反应以符合使 用微量滴定板的高通量筛选(HTS)的过程及其它期望的方式。在固定至固体载体期间，用 于本发明的共轭聚电解质和朊病毒蛋白质的溶剂可以是，但不限于水、缓冲的水溶液、甲 醇、乙醇及其组合。在该步骤中，也可以加入其它类型的载体聚合物。生物分子、错折叠蛋 白质、抗体、蛋白质、肽、错折叠蛋白质或其它分子也可以固定在固体载体上或微量滴定孔 (microtiter wells)中。具有选择性能力的识别、鉴定或俘获抗体或其它生物分子也可以 以其自身、与共轭聚电解质一起(即，与聚电解质溶液混合)固定，或者随后识别已俘获错 折叠蛋白质的CPE。当生物分子、错折叠蛋白质、抗体、蛋白质或肽与本发明的共轭聚电解质 固定在固体载体上时，它们通过非共价相互作用与所述聚电解质形成复合物。该复合物是在没有共价化学下形成的，并且其是基于共轭聚电解质和朊病毒蛋白之间的氢键键合、静 电-和非极性相互作用。VI阵列和线根据本发明，在各个点或线中产生的相同或不同共轭聚电解质的大的阵列可以克 服单个传感器或基于溶液的方法的缺陷。所述阵列或平行线方法开发了以简单的方法用一 种或不同的共轭聚电解质对一个或不同的样品的平行分析，所述样品可以包含错折叠蛋白 质，其中该实验设计的至少一个步骤使用CPE来俘获错折叠蛋白质。使用阵列的主要目的 是增加在其他性质和特征中的使用容易性、可携带性、定量、选择性。使用该方法，我们可以 探究测量多组分样品和使用部分选择性的传感器点的能力。这给予了同时分析两种以上目 标样品和进行芯片内测定的机会。通过将共轭聚电解质和/或生物分子、错折叠蛋白质、朊 病毒蛋白质、抗体、蛋白质或肽固定在任意尺寸和任意选择的模式(如阵列、线、点、柱)的 固体载体上，可以构建小的、可携带的、容易阅读的和可说明的装置。多种阵列的使用要求可以同时对或多或少的大量样品进行检测。这通常以微点阵 的形式进行，其中将许多独立的检测元件(或探针)整合在小的表面积上，以用于大规模并 行检测。我们已经证实可以通过使用高弹体压印器的微接触印刷来印刷共轭聚电解质和共 轭聚电解质/蛋白质复合物。也可以通过点样共轭聚电解质溶液，或者通过喷墨聚电解质 溶液，或者通过上述的其它方法进行在微点阵表面上的传输。这些步骤是制备多像素微点 阵所必需的。实施例^MM 1. #用共$厄聚申J军JIH孚获禾Π检测丨溶液Φ^ΙΡΓΡ-淀I状g白。禾Il用荧光、昆 微镜的表面检测试管中包含PrP和PrP-淀粉状蛋白样品，后者为PrPse-或PrPres-样蛋白。通过 对水透析溶于3M胍盐盐酸盐中的lmg/mlreCHuPrP90-231制备PrP-淀粉状蛋白。另一个 试验规程是通过在高盐浓度条件下于试管中振摇而制备PrP-淀粉状蛋白。向包含PrP和 PrP-淀粉状蛋白的该溶液中加入共轭聚电解质ΡΤΑΑ(10 μ g/ml)，，使PTAA俘获、结合并染 色PrP-淀粉状蛋白。然后，静置该PTAA/PrP-淀粉状蛋白形成物至沉降至试管的底部，然 后，可以容易地将其从样品中分离，如有必要时，进行检测。收集PTAA/PrP-淀粉状蛋白的 其它方法为，但不限于过滤、离心、在疏水性表面上俘获、在具有共价结合的PTAA的表面上 俘获、使用官能化的颗粒、盐沉淀和免疫沉淀。用于检测或观测PTAA/PrP-淀粉状蛋白的方 法包括，但不限于，荧光显微镜、在平板读数器或分光荧光计中的荧光检测、在平板读数器 或分光计中的吸收检测、阵列荧光读数器、光电二极管、荧光偏振或各向异性、圆二色性等。 该方法也提供一种在溶液中从给定样品中俘获、清除、去除或过滤PrP-淀粉状蛋白、PrPSe、 PrPres的方法。在该特别的实例中，将PTAA/PrP-淀粉状蛋白形成物收集在玻璃基板上，并 使用荧光显微镜观测，参见图6。使用该仪器，其分辨率能够鉴定小于IymXlymXlymW 独立的PrP-淀粉状蛋白颗粒，其相当于少于2pg的PrP。实施例2 过滤，俘获为了分离天然的和原纤维胰岛素，从而纯化该原纤维胰岛素，进行聚合物-胰岛 素样品的过滤。测定的样品为天然胰岛素和原纤维胰岛素，其含有或不含有PTAA。最初， PTAA的浓度为0. 5mg/ml，胰岛素的浓度为2mg/ml，样品在Iml的20mM pH8的磷酸盐缓冲液
16中包含10μ1 ΡΤΑΑ+25μ1胰岛素。对于所有的样品，在过滤前后均进行荧光测量，和打开 滤光器，观测检查。使用的过滤器为0. 22μπι Millex-gu，并将Iml的每种样品过滤穿过过在过滤穿过0. 22 μ m的过滤器前后，PTAA-天然胰岛素(PTAA-ins)和PTAA-原纤 维胰岛素(PTAA-fib)的荧光光谱显示在图9中。在过滤之前，光谱看上去如预期的。在过 滤后，很明显含有PTAA和原纤维胰岛素的样品保留在过滤器(看到荧光减少)，而含有天 然胰岛素的样品不会影响聚合物的通过。因此，可以使用过滤去除结合至PTAA的天然胰岛 素。在过滤后对过滤器的观测检查显示，在过滤器上存在PTAA-原纤维胰岛素的聚集物(看 到红色聚集物)，而含有PTAA-天然胰岛素的过滤器没有显示出聚集物或颜色的变化。也进行了检测所述过滤器中俘获的PTAA-原纤维胰岛素复合物存在的测量。如 上所述制备仅含有PTAA的样品和含有天然胰岛素的样品，所述天然胰岛素包含0、5、50和 100%的原纤维胰岛素。随着原纤维胰岛素含量的增加，天然胰岛素的含量降低，引起所有 的样品中的胰岛素总量相同。将样品过滤穿过0.8μπι Millex-aa过滤器，并测量滤液的 荧光。然后，通过挤压Iml的缓冲液反向穿过过滤器而逆-过滤所述过滤物。之后，测量 逆-过滤的滤液的荧光。第一次滤液的荧光光谱显示在图10中。增加原纤维含量会引起更多的PTAA-原 纤维胰岛素复合物保留在过滤器中，而PTAA与天然胰岛素可以自由地穿过。逆_过滤的样 品显示在图11中。虽然大多数复合物仍然被捕获在过滤器中，但是很明显在逆-过滤后， 增加原纤维的量引起更多的PTAA-原纤维胰岛素复合物溶于溶液中。因此，PTAA可用于俘 获原纤维胰岛素。使用过滤来俘获PTAA-原纤维复合物不限于上述的过滤器和实例。可以使用任何 其它类型的过滤器、基质、缓冲液、浓缩物和添加剂，并且可以通过荧光测量、吸光度测量、 观测检查、显微镜法、荧光偏振或各向异性、圆二色性等获得分析和检测。实施例3 #用共$厄聚申J军JIH孚获禾π检测丨溶液Φ 仙夷岛素-淀I状g白。禾Il用荧光测W·的溶 液检测在试管中，将含有天然胰岛素的样品与PTAA (0. 05mg/ml，10 μ 1)和965 μ 1的20mM 磷酸盐缓冲液PH 7.0混合，所述天然胰岛素包含0、1、5、50和100%的原纤维(2mg/ml， 25 μ 1)。通过在65摄氏温度下，在ρΗ 2温育天然胰岛素8小时产生原纤维胰岛素。将样 品以IOOOOrpm离心5分钟，除去上清液，加入新的缓冲液，并重复该过程一次。所述PTAA 结合原纤维胰岛素，并在离心下沉降到试管的底部。然后，使用荧光微量培养板读数器测量 样品。又测量了没有离心的PTAA-天然胰岛素和PTAA-原纤维胰岛素的参照样品。将结果 显示在图12中。所述PTAA-原纤维聚集物沉降到试管的底部，并且其可以通过离心后除去上清 液而容易地被收集以用于检测。通过溶解所述沉淀物，之后可以通过荧光测量来检测 PTAA-原纤维复合物。用于检测或观测PTAA/PrP-淀粉状蛋白的方法包括，但不限于荧光 显微镜、在平板读数器或分光荧光计中的荧光检测、在平板读数器或分光计中的吸收检测、 阵列荧光读数器、光电二极管、荧光偏振或各向异性、圆二色性等。该方法也提供一种在溶 液中从给定样品中俘获、清除、去除或过滤淀粉状蛋白和原纤维的的方式。正如该实施例所示，增加原纤维的量得到更多的PTAA-原纤维复合物。从原纤维至100%原纤维，荧光 强度增加，显示出PTAA和原纤维之间的结合，因为在离心后，根本不存在PTAA和天然胰岛
ο实施例4 在固体载体上CPEs的固定该实施例描述了在涂有APTES的玻璃表面上固定PTAA。所述硅烷APTES是为了具 有用于化学耦合的胺基。EDC (或EDAC)是用于耦合羧基至伯胺的零_长度交联剂。该交联 剂可以用于多种应用，如在肽合成中形成酰胺键，将半抗原结合至载体蛋白以形成免疫原， 用5'磷酸基标记核酸和建立生物分子的胺-反应性NHS-酯。首先，可以活化具有羧基、-COOH的CPEs (如PTAA、POffT, tPTAA或tPOWT)，然后 将其耦合至任何种类，如官能化的磁珠的胺表面。可以将不包含任何羧基但具有胺基的 CPEs (如POMT、tPOMT和PTT)耦合至活化的羧基表面。如果有具有羧基的磁珠，只要将其 放入EDC/NHS溶液中即可。试验规稈，PTAA的固定使用TLl洗涤物(5份H2OU份25%的NH3U份28%的H2O2，加热至85°摄氏度5 分钟，用水洗涤)和TL2洗涤物(6份H20、1份37%的HC1、1份28%的H2O2，加热至85°摄 氏度5分钟，用水洗涤)清洁玻载玻片，以去除有机物和无机物，并使其具有亲水性。用队 干燥。 将载玻片置于汽化室中。将200μ1的APTES置于所述室中，在60°摄氏度蒸发 10分钟，在150°摄氏度烘焙60分钟。在二甲苯中洗涤，并贮存在二甲苯中。对于不同的 汽化室，APTES的量可能不同。·制备在H2O中的2mM的EDC和ImM的NHS的混合物。 将1份EDC/NHS与1份的PTAA混合。·将100 μ 1的PTAA-EDC/NHS施用到载玻片上，在暗处温育30分钟。·用20mM的磷酸盐缓冲液pH 8洗涤表面3次。用N2干燥。将PTAA共价结合至薄层的表面，其可用于结合目标分子。可以使用对试验规程的 某些改良，如浓度、PH、缓冲液、培养时间和使用的材料。已经选择EDC/NHS的浓度来活化 PTAA中的一小部分羧基，以增加结合至表面的PTAA的量，并保持PTAA的结合性质。优选 地，应当仅仅活化所述聚合物的一个侧链。没有评价该报道的浓度是否为最佳。可以改变 PH和用于洗涤的缓冲液组合物。在用于Nunc的Covalink微量滴定板的试验规程中，所述 洗涤缓冲液为116. 9g的NaClUOg MgS04*7H20、0. 5ml吐温20、1升PBS0可以改变培养时 间以改善结果。可以使用硫代-NHS代替NHS，因为其会稍微更稳定。试验规程，POMT的固定由于POMT不包含羧酸侧基，用于固定的方法与PTAA的方法相反。应当使用包含 羧基的表面如PEG基质来代替APTES表面。用BrCH2COOH和NaOH处理所述PEG基质以引入 COOH基团，之后，在加入POMT之前将EDC/NHS应用于所述表面以活化所述羧基。也可以使 用其它表面。没有评价该方法。参见文献“Photografted Poly (ethylene glycol)Matrix for AffinityInteraction Studies，，,Biomacromolecules,第 8 卷，第 1 期，第 287-295 页， 2007中的方法说明。试验规程，POffT和PTT的固定
由于POWT和PTT都同时包含羧基和胺基，使用EDC/NHS可以引起聚合物链之间的 交联，而不是聚合物和表面之间的交联，这不是期望的。然而，通过调整EDC/NHS和聚合物 的浓度，有可能产生共价结合至表面上的更厚的交联聚合物层，甚至获得更好的结果。可以 使用APTES表面或包含羧基的表面。没有评价该方法。^M在上述实施例中，已经使用载玻片来固定。也可以使用其它表面，如硅晶片、玻璃 珠、微量滴定板(Nunc的Covalink是用APTES表面预涂布的)，或具有合适性质的任何其它 表面。其它的固定技术也可以使用其它的固定技术。对于共价结合，可以使用具有生物素或其它端基的 官能化的聚合物。对于非共价结合，可以使用蛋白质层在表面上的物理吸附。聚合物可以 是例如，涂布在用葡聚糖硫酸盐涂布的Nunc Maxisorp微量滴定板上的。也可以使用任何 其它能够将聚合物涂布至表面的技术。将样品加至表面可以以不同的方式，将待评价或俘获的样品加入到聚合物涂布的表面。可简单地 将一定体积的样品加入到表面，温育合适的时间并洗涤。可以使用流动导管(Flow canal) 引导合适量的样品到表面上，其得到更加可重复的系统。如果使用珠粒，可以将其加入到样 品溶液中，温育，并使用离心、磁性分离或任何其它分离技术将其从溶液中分离。棚列5 眺■申鍾__係減贼碰该实施例显示了 CPE和镧系元素纳米颗粒如Eu203、Gd203或Nd2O3之间的特异性相 互作用是可能的。这些颗粒可以是粒径从几纳米至几百纳米的任何颗粒，其依次可用于体 内成像错折叠蛋白质和根据本发明的与错折叠蛋白质相关的疾病。镧系元素颗粒的修饰是 可能的，如掺杂多种金属，如Fe3+、Eu3+、Tb3+等。在涂布或结合CPEs之前，有可能通过例如 生物分子、二甘醇、烷烃、羧基、柠檬酸、胺基等预涂布所述镧系元素颗粒，之后进一步加入 其它分子。为了证实一些选择的CPEs和Gd2O3纳米颗粒之间的相互作用，记录了 CPEs的荧 光，参见图13。激发波长设定为400nm，CPE的测量浓度设定为2. 5 μ g/mL，并且将氧化钆颗 粒用购自Sigma-Aldrich的储备溶液稀释200倍。在重蒸水中进行本文中出现的测量，但 是其也可以在许多类型的缓冲溶液或复合物介质中进行。
权利要求
一种药用制剂，其包括任选的官能化的CPE和任选的可药用载体。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述共轭聚电解质具有一个或多个离子侧链和 /或末端官能度，其中所述离子侧链和/或末端官能度选自由以下组成的组氨基酸、氨基 酸衍生物、神经递质、单糖、核酸、DNA、RNA、肽、组氨酸、组氨酸10、蛋白质、肽支架、生物素、 抗生物素蛋白、链霉抗生物素、螯合剂、活性基团、抗体、酶、配体、受体配体、类固醇、生物分 子或其它分子、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、金微粒、磁珠、蛋白质涂布的珠粒、肽涂布的珠 粒、超磁珠粒或颗粒、钆纳米颗粒、钆离子、掺杂镧系元素的纳米颗粒、掺杂镧系元素的氧化 钆纳米颗粒、镧系元素颗粒，或其组合和化学修饰的衍生物。
3.一种共轭聚电解质，其在由错折叠蛋白质的聚集引起的疾病的治疗方法中使用，所 述方法包括将患者的体液进行聚集性错折叠蛋白质的分离。
4.一种共轭聚电解质，其在由错折叠蛋白质的聚集引起的疾病的治疗方法中使用，所 述方法包括给药患有所述疾病的患者有效量的CPE以抑制错折叠蛋白质的进一步聚集或 结合中间体形式的错折叠蛋白质，并在进一步反应中去除这些物质。
5.根据权利要求3或4所述的共轭聚电解质，其中所述共轭聚电解质具有一个或多个 离子侧链和/或末端官能度，其中所述离子侧链和/或末端官能度选自由以下组成的组 氨基酸、氨基酸衍生物、神经递质、单糖、核酸、DNA、RNA、肽、组氨酸、组氨酸10、蛋白质、肽 支架、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、螯合剂、活性基团、抗体、酶、配体、受体配体、 类固醇、生物分子或其它分子、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、金微粒、磁珠、蛋白质涂布的珠 粒、肽涂布的珠粒、超磁珠粒或颗粒、钆纳米颗粒、钆离子、掺杂镧系元素的纳米颗粒、掺杂 镧系元素的氧化钆纳米颗粒、镧系元素颗粒，或其组合和化学修饰的衍生物。
全文摘要
本发明涉及一种共轭聚电解质作为新治疗剂的用途，其通过在体内干扰错折叠的、病理的或劣种形式的蛋白质的形成或俘获其来起作用。
文档编号A61P9/04GK101947235SQ201010245519
公开日2011年1月19日 申请日期2007年4月18日 优先权日2007年4月18日
发明者F·安格斯, O·英格纳斯, P·奥斯伯格 申请人:比奥克罗密克斯药业有限公司