专利名称：用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液及其制备方法。
背景技术：
当前人口老龄化已经成为一种世界性的趋势，中国的老龄化问题更加突出。据统计，从1999年开始我国已经提前进入了老龄化社会，目前正是老龄化发展的快速时期。当前我国的老龄化人口为1. 3亿，2015年老年人口将突破2亿人。2027年将超过3亿人，2044 年将达到4亿人。人一旦进入老年，身体的各个组织结构和生理水平都将发生重大变化，适应环境的能力将减弱，免疫力降低。与此同时我们也看到随着社会经济的不断发展，人们生活水平得到不断提高，生活工作步伐也不断加快，尤其是城市节奏的加快，让人身心相当的疲惫。相当一部分中青年人处于亚健康状态，免疫力下降。如何提高人们的免疫力，增强体质是整个社会都在关注的问题。基于这一点市面上出现了很多保健口服液，多数保健口服液中含有添加剂和防腐剂，对人们的身体带来不利影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以天然植物为原料，不含任何添加剂，人体吸收快的用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液及其制备方法。本发明提供的这种用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液，按重量份计其原料组份是
灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=(8-12) (3. 5-10. 5) (2-6) (1-5) 本发明保健口服液的药理功效
(1)本保健口服液中的总多糖，主要为灵芝多糖，具有增强免疫力、抗肿瘤、强心、降压、 改善内脏循环、抑制血小板聚集、镇咳、祛痰、平喘、保肝护肝、降血糖、抗炎、抗损伤、抗衰老、抗突变、抗辐射、抗病毒、镇静、镇痛等作用；
(2)本保健口服液中的总黄酮，有消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老等功能；
(3)经动物实验证明a、经口给予小鼠30天的喂养，分5.0ml/kg-bwU0. 0ml/kg-bw, 20. 0ml/kg · bw三个实验组与对照组比较能提高小鼠的半数溶血值、抗体生成细胞数、单核-巨噬细胞碳廓清、迟发型变态反应的能力。对小鼠体重增长、腺体体重比值、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力、小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、NK细胞的活性均无明显影响。结果表明有增强免疫力的保健功能；b、经口给予小鼠30天的喂养，分5. Oml/kg · bw、 10. 0ml/kg · bw、20. Oml/kg · bw 三个实验组与对照组比较，10. 0ml/kg · bw、20. 0ml/kg · bw 剂量组能明显延长小鼠的负重游泳时间(P < 0. 05) ；10. Oml/kg · bw剂量组能显著降低小鼠运动后的血清尿素水平、降低运动后小鼠血乳酸曲线下面积(P < 0. 05)。结果表明有缓解体力疲劳的保健功能；c、表观吸收率大大高于对照组，说明吸收效果好。因此本发明保健口服液具有增强免疫力缓解体力疲劳的功效。同时本发明原料来源广泛，菌类养殖工序简单、对环境无污染，可以规模化、工业化生产。本发明还提供了所述保健口服液的制备方法，包括以下步骤
(1).取灵芝菌丝体洗净，破碎备用；茯苓洗净，切成丁状；
(2).将破碎的灵芝菌丝体和洗净的茯苓丁、杜仲叶、菟丝子放入中药提取罐中，加水浸泡，然后煎提过滤，获得一次滤液于另贮罐冷却；
(3).将步骤(2)的滤渣加水煎提，过滤，获得二次滤液；
(4).将一次滤液与二次滤液合并，然后浓缩至相对密度约为1.1，热测温度为 60-65 °C，获得浓缩液；
(5).将步骤(4)获得的浓缩液用高速管式离心机离心；
(6).将离心后的上清液用无机陶瓷膜过滤，然后冷藏；
(7).用滤纸多层精滤，然后分装，灭菌，获得本保健口服液。本发明方法保证了本保健口服液的有效成分和功效，使人们服用本保健口服液能达到预期效果。
具体实施例方式本发明保健口服液在原料组分为如下范围内的任意配比均可制得 灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=(8-12) (3.5-10.5) :(2-6) :(1-5)。以下给出了四个实施方式，来详细说明本发明保健口服液及其制备方法。实施方式一
(1).原料准备精选灵芝菌丝体和茯苓，按照下列重量份计的比例称量各原料 灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=8: 3.5 6:5;
(2).将灵芝菌丝体洗净，破碎备用；茯苓洗净，切成丁状；
(3).将破碎的灵芝菌丝体和丁状的茯苓杜仲叶、菟丝子放入中药提取罐中，加原料8 倍水浸泡1小时；
(4).将步骤(3)的浸泡液连同原料一起在100°C下，煎提2小时，过滤，获得一次滤液，并将该滤液置于另一贮罐冷却；
(5).将步骤(4)的滤渣加原料6倍水，100°C下，煎提1.5小时，过滤，获得二次滤液， 将一次滤液与二次滤液合并；
(6).步骤(5)合并后的滤液浓缩至相对密度约为1.1 (热测6(T65°C)；
(7).将步骤(6)获得的浓缩滤液用高速管式离心机离心(离心速度为16000r/min);
(8).将离心后的上清液用无机陶瓷膜(孔径0.45 μ m)过滤，然后冷藏M小时；
(9).用滤纸多层精滤，得到保健口服液，检测其粗多糖含量为1.8g/100ml；总黄酮含量为:0. 4g/100ml ；
(10).将步骤9获得的保健口服液分装到棕色锁口玻璃瓶中，进行高压蒸汽灭菌 (0. 14Mpa, 12rC，30min)。棕色锁口玻璃瓶已经超声波洗瓶机洗净、170°C烘干、灭菌的，瓶型大小可为 IOml,20ml,60ml, 120ml,240ml 等。实施方式二
(1).原料准备精选灵芝菌丝体和茯苓，按照下列重量份计的比例称量各原料 灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=12: 10.5 2:1;(2).将灵芝菌丝体洗净，破碎备用；茯苓洗净，切成丁状；
(3).将破碎的灵芝菌丝体和丁状的茯苓杜仲叶、菟丝子放入中药提取罐中，加原料8 倍水浸泡1小时；
(4).将步骤(3)的浸泡液连同原料一起在100°C下，煎提1.5小时，过滤，获得一次滤液，并将该滤液置于另一贮罐冷却；
(5).将步骤(4)的滤渣加原料6倍水，100°C下，煎提1.5小时，过滤，获得二次滤液， 将一次滤液与二次滤液合并；
(6).步骤(5)合并后的滤液浓缩至相对密度约为1.1(热测6(T65°C);
(7).将步骤(6)获得的浓缩滤液用高速管式离心机离心(离心速度为16000r/min);
(8).将离心后的上清液用无机陶瓷膜(孔径0.45 μ m)过滤，然后冷藏M小时；
(9)用滤纸多层精滤，即得到本发明所述保健口服液，
检测其粗多糖含量为2. 8g/100ml ；总黄酮含量为0. lg/100ml ；
(10).将步骤9获得的保健口服液分装到棕色锁口玻璃瓶中，进行高压蒸汽灭菌。实施方式三
(1).原料准备精选灵芝菌丝体和茯苓，按照下列重量份计的比例称量各原料 灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=12: 10.5 6:5;
(2).将灵芝菌丝体洗净，破碎备用；茯苓洗净，切成丁状；
(3).将破碎的灵芝菌丝体和丁状的茯苓杜仲叶、菟丝子放入中药提取罐中，加原料8 倍水浸泡1小时；
(4).将步骤(3)的浸泡液连同原料一起在110°C下，煎提1小时，过滤，获得一次滤液，并将该滤液置于另一贮罐冷却；
(5).将步骤(4)的滤渣加原料6倍水，100°C下，煎提1.5小时，过滤，获得二次滤液， 将一次滤液与二次滤液合并；
(6).步骤(5)合并后的滤液浓缩至相对密度约为1.1(热测6(T65°C);
(7).将步骤(6)获得的浓缩滤液用高速管式离心机离心(离心速度为16000r/min);
(8).将离心后的上清液用无机陶瓷膜(孔径0.45 μ m)过滤，然后冷藏M小时；
(9)用滤纸多层精滤，即得到本发明所述保健口服液，
检测其粗多糖含量为2. 4g/100ml ；总黄酮含量为0. 25g/100ml ； (10 ).将步骤9获得的保健口服液分装到棕色锁口玻璃瓶中，进行高压蒸汽灭菌。实施方式四
(1).原料准备精选灵芝菌丝体和茯苓，按照下列重量份计的比例称量各原料 灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=10: 7.5 43；
(2).将灵芝菌丝体洗净，破碎备用；茯苓洗净，切成丁状；
(3).将破碎的灵芝菌丝体和丁状的茯苓杜仲叶、菟丝子放入中药提取罐中，加原料8 倍水浸泡1小时；
(4).将步骤(3)的浸泡液连同原料一起在90°C下，煎提2小时，过滤，获得一次滤液，并将该滤液置于另一贮罐冷却；
(5).将步骤(4)的滤渣加原料6倍水，100°C下，煎提1.5小时，过滤，获得二次滤液， 将一次滤液与二次滤液合并；(6).步骤(5)合并后的滤液浓缩至相对密度约为1.1 (热测6(T65°C)；
(7).将步骤(6)获得的浓缩滤液用高速管式离心机离心(离心速度为16000r/min);
(8).将离心后的上清液用无机陶瓷膜(孔径0.45 μ m)过滤，然后冷藏M小时；
(9)用滤纸多层精滤，即得到本发明所述保健口服液，
其粗多糖含量为2. 5g/100ml ；总黄酮含量为0. 3g/100ml ；
(10).将步骤9获得的保健口服液分装到棕色锁口玻璃瓶中，进行高压蒸汽灭菌。以下是从几个方面对本发明所述保健口服液的增强免疫力的效果评价的实验 (一).实验一
1材料和方法
1. 1样品即本发明所述保健口服液由湖南森康生物技术有限公司提供，为棕褐色口服液，人口服推荐量为60ml/人/天。1. 2实验动物与分组湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供的清洁级昆明种雄性小鼠120只，体重为18g 22g，实验动物生产许可证号为SCXK(湘M003-0003。 每40只分为1组，共三组。免疫I组，进行碳廓清实验；免疫II组，进行脏体比值测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、迟发型变态反应实验、半数溶血值(HC5tl)的测定和抗体生成细胞数的测定；免疫III组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞的活性测定。1. 3实验环境条件温度23°C 25°C，湿度54% 68%，实验动物使用许可证号为 SYXK (湘)2003-0002。1. 4剂量选择及样品处理据人体口服推荐量，相当于每日1. Oml/kg *bw，设本发明保健口服液低、中、高剂量分别为5. 0ml/kg-bwU0. 0ml/kg-bw,20. Oml/kg · bw (分别相当于人体推荐剂量的5、10、20倍)。取样品加蒸馏水配至所需浓度，对照组予以等体积的蒸馏水，分别给予受试动物灌胃，每天灌胃一次，灌胃体积为0. 2ml/10g · bw，连续30天。1. 5主要仪器与试剂动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴箱、液体闪烁仪、酶标仪、显微镜等。无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、M孔和96孔平底细胞培养板，96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、 载玻片等。绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank's液(pH7. 2-7. 4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、ConA, 1%冰醋酸，lmol/L的HCL溶液酸性异丙醇(96mL异丙醇加lmol/L的 HCL溶液細1)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、其琼脂糖、都氏试剂、YAC-I细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶1、0. 2mol/L的1Tris-HCL缓冲液、1%的NP40、 印度墨汁、0. 1%的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。1.6实验方法
1.6. 1脏器/体重比值测定称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。1.6.2迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)
小鼠腹腔注射洲(v/v) SRBC (O.aiil/每鼠)致敏后4天，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20% (v/v)SRBC (20ul/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
1. 6. 3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’ s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’ s液洗3次，每次离心10分钟(lOOOrpm)。然后将细胞悬浮于2mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5 X IO6个/mL。再将细胞悬液分两孔加入M孔培养板中，每孔lmL，在其中一孔加50μ ΧοηΑ液(相当于5Pg/mL)，另一孔作为对照，置5% 二氧化碳，37°C培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0. 7mL，加入不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT (5mg/mL)5(^L/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入ImL酸性异丙醇，吹打混勻，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体用酶标仪测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表不。1. 6. 4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，将压积SRBC用生理盐水配成洲(￥八)的细胞悬液，每鼠腹腔注射O.aiil。将免疫后4天的小鼠处死，取脾，轻轻撕碎， 用Hank’ s液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在5ml Hank's 液中。将表层培养基加热溶解后与等量的PH7. 4、2倍浓度的Hank’ s液混合，分装小试管， 每管0. 5ml，再向管内加入用SA液配置的10%SRBC50ul (v/v)、20ul脾细胞悬液，迅速混勻后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA液稀释的补体(1:10)加入到玻片凹槽内，继续温育 1. 后计数溶血空斑数。1.6.5半数溶血值(HC5tl)的测定
取羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射m (ν/ν,用生理盐水配制)压积 RBCO. 2mL进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约lh，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心lOmin，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍，取ImL 置试管内，依次加入10% (v/v，用SA缓冲液配制)压积SRBCO. 5mL,补体ImL (用SA缓冲液按1:10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37°C恒温水浴中保温30min 后，冰浴终止反应。2000rpm离心lOmin，取上清lmL，加都氏试剂3mL。同时取10%(v/v，用 SA缓冲液配制)压积SRBCO. 25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混勻，放置IOmin 后，与MOnm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC5tl) 表示，按下式计算
半数溶血值(HC5tl)=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值X稀释倍数 1.6.6小鼠碳廓清实验
小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每IOg体重注射0. ImL,墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20ul，加入到^iil Na2CO3溶液中，摇勻。以Na2CO3溶液作空白对照，用722型分光光度计在600nm波长处比色侧光密度值 (OD)0将小鼠处死，取肝、脾，称重，计算吞噬指数a。1.6.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20%(￥八，用生理盐水配制)压积的鸡红细胞(2000印111，IOmin)悬液lmL， 间隔30min，颈椎脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液lmL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37°C孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇丙酮(1:1)固定，4% (v/v) Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数
吞噬率％ =吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数X 100 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数 1. 6. 8 NK细胞活性的测定(同位素3H-TdR测定法)
取传代后24h生长良好的YAC-I细胞(存活率> 95%)按IX 106mL YAC-I细胞悬液加 3H-TdRlOP Ci进行标记，于37°C，5% 二氧化碳培养箱中培养2h，每30min振荡1次，标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为IXlO5个/mL。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’ s液洗3次，每次IOOOrpm离心lOmin，再用 2mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液悬浮，用台酚兰染色计数(活细胞数应在95%以上)，调整细胞浓度为1 X IO7个/mL。在96孔板中每孔加ΙΟΟμ L标记的靶细胞，试验孔加 100μ L效应细胞，空白对照孔加100μ L培养液，最大释放孔加100μ LTriton X-IOO0每个样品设3个复孔，置5% 二氧化碳，37°C培养4h。用多头细胞取集器取集于玻璃纤维滤纸上， 用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm )。NK细胞活性=(1-实验孔cpm/ (空白对照孔cpm-最大释放孔cpm)) X 100%
1.7实验数据统计用Excel、Spss软件进行统计分析。2 结果
2.1本发明保健口服液对小鼠体重的影响，见表1-表4
.表1各组小鼠的初始体重(χ 士幻
权利要求
1.一种用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液，按重量份计其原料组份是灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=(8-12) (3.5-10.5) :(2-6) :(1-5)。
2.根据权利要求1所述用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液，其特征是按重量份计其原料组份是灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=10:7. 5:4:3。
3.—种权利要求1或2所述用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液的制备方法， 包括以下步骤(1).取灵芝菌丝体洗净，破碎备用；茯苓洗净，切成丁状；(2).将破碎的灵芝菌丝体和洗净的茯苓丁、杜仲叶、菟丝子放入中药提取罐中，加水浸泡，然后煎提过滤，获得一次滤液于另贮罐冷却；(3).将步骤(2)的滤渣加水煎提，过滤，获得二次滤液；(4).将一次滤液与二次滤液合并，然后浓缩至相对密度约为1.1，热测温度为 60-65 °C，获得浓缩液；(5).将步骤(4)获得的浓缩液用高速管式离心机离心；将离心后的上清液用无机陶瓷膜过滤，然后冷藏；用滤纸多层精滤，然后分装，灭菌，获得本保健口服液。
4.根据权利要求3所述的保健口服液制备方法，其特征在于步骤(2)煎提时间1-2小时，温度90-1IO0C ；步骤(3)煎提时间1-2小时，温度IOO-IlO0C0
5.根据权利要求3所述的保健口服液制备方法，其特征在于步骤(2)加原料8倍水浸泡1小时，步骤(3)加原料6倍的水煎提。
全文摘要
本发明公开了一种用于增强免疫力缓解体力疲劳的保健口服液及其制备方法，所述保健口服液的按重量份计其原料组份是灵芝菌丝体茯苓菟丝子杜仲叶=(8-12):(3.5-10.5)(2-6)(1-5)。制备方法主要是煎提、过滤、分装、灭菌。本发明保健口服液能增强增强免疫力，缓解体力疲劳，适合于老年人和亚健康状态的年轻人。
文档编号A61K9/00GK102283883SQ20111022202
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者刘安球, 张国洪, 张志光, 张景元, 李政委, 杨大伟, 钟丽萍, 黄绍均 申请人:湖南森康生物技术有限公司