专利名称：一种应用于神经吻合术的水凝胶及其制备方法
一种应用于神经吻合术的水凝胶及其制备方法技术领域：
本发明涉及应用于神经损伤修复中神经吻合术的水凝胶，具体涉及一种应用于小间室神经吻合法的水凝胶及其制备方法。背景技术：
神经吻合方法在周围神经损伤修复中对术后肢体功能的恢复程度有着重要影响。 周围神经的修复关键是修复神经束本来的连续性，传统的神经吻合方法是端端神经外膜吻合法。随着技术的进步，该方法已经达到了较高的水平，然而其功能恢复却依旧不甚理想。 究其原因，临床发现传统的神经吻合法难以准确对接功能相同的神经束，且在各束断端之间会发生扭曲、交错，甚至断端逃逸，或形成神经瘤等，直接影响了神经功能的恢复；其次， 由于神经吻合口及周围的瘢痕组织增生较神经束明显快速，可侵入吻合口机械地阻碍再生神经轴突长入吻合口等。
神经受损后要成功再生，除了防止神经胞体不可逆变性以外，最主要的是引导再生轴突延长通过损伤区，并使轴突生长锥寻找、识别到靶器官，以建立新的轴突。传统的神经吻合方法难以保证上述因素，于是各种新方法应运而生，其中小间室神经吻合法是目前研究的热点。
小间室神经吻合法要求为损伤神经提供有利的微环境一“神经再生室”，神经再生室作为一个相对密闭的空间，是一个符合神经生长的微环境。在神经远端分泌活性物质的作用下，近端再生的轴突在神经再生室内有选择的被引导进入远端功能相同的神经内膜管内，避免神经生长错误，即再生的运动突长入远端的感觉神经内膜管，能防止周围组织成纤维细胞进入神经断端阻碍神经再生，有助于提高轴突再生的数量和质量，使再生的轴突长入靶器官，形成有效连接，恢复肢体功能。
理想的神经再生室包括良好的血液供应和能充分发挥神经营养性和趋向性，以促进神经再生和功能恢复。但是目前 应用的神经再生室方法包括硅胶再生室、几丁质再生室、 外膜袖套式再生室和小间隙静脉桥接再生室等，还存在各种问题或不足，例如硅胶再生室不可降解，需第二次手术取出硅胶管；几丁质再生室因几丁质体内降解速度慢而限制了它的广泛应用；外膜袖套式再生室吻合操作要求严格，操作比较复杂，术后外膜套容易瘢痕化；小间隙静脉桥接再生室因小间隙处较软，内部缺少支撑，容易受压变扁，此外神经盲目生长，短时间内神经纤维近远端之间的对应关系难以连接。发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有神经吻合术中小间室神经吻合法的不足之处，提供一种应用于神经吻合术的水凝胶及其制备方法，利用该水凝胶相变特点联合黏合法应用，提高神经吻合质量及速度，实现安全快捷的神经吻合。
经过反复实验，发明人制备了一种应用于神经吻合术的水凝胶，解决了现有神经吻合术中小间室神经吻合法的不足之处，本发明采用的技术方案如下。
一种应用于神经吻合术的水凝胶，该水凝胶中泊洛沙姆或其衍生物浓度为10% (ff/V)-30% (W/V)，生物可降解大分子和/或营养成分的浓度为O. 1% (ff/V)-5% (W/V)。
上述的泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，即α -氢-ω羟聚(氧乙烯)a_聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)。嵌段共聚物，结构式为HO (CH2CH2O) a (OCHCH3CH2)b (CH2CH2O)。，在共聚物中a和c为2 150，b为15 67。
上述的生物可降解大分子包括蛋白、多糖、可溶性淀粉及其衍生物。
上述的营养成分是指医学公知的具有营养或刺激神经生长作用的成分，包括激素、细胞因子、生长因子、刺激因子、趋化因子、白细胞介素、维生素、氨基酸、干扰素、单糖、 双糖、低聚糖、有机弱酸。
上述的有机弱酸包括柠檬酸、酒石酸、富马酸、硼酸、醋酸。
上述的水凝胶中泊洛沙姆浓度为15% (ff/V)-25% (W/V)，生物可降解大分子和/ 或营养成分浓度为0.25% (ff/V)-l% (W/V)。
上述的水凝胶在37°C以下呈流动的高分子胶液状，在37°C _45°C之间凝固成固态凝胶。
一种应用于神经吻合术的水凝胶的制备方法，在无菌操作环境下，将泊洛沙姆或其衍生物分散于注射用水中，溶解，加入生物可降解大分子和/或营养成分，振摇至完全溶解，形成水凝胶，水凝胶中泊洛沙姆或其衍生物浓度为10% (ff/V)-30% (W/V)，生物可降解大分子和/或营养成分的浓度为O. 1% (ff/V)-5% (W/V)。
上述制备的水凝胶可以进一步冷冻干燥形成冻干粉，密封于西林瓶中保存，临用前注入注射用水，轻微振摇恢复形成水凝胶。
本发明解决了现有神经吻合术中小间室神经吻合法的不足，具有以下优点(I) 本发明的水凝胶联合医用黏合剂应用，避免现有报道的小间室神经吻合法手术复杂、材料不可降解、小间隙处内部缺少支撑和容易受压变型等不足。(2)本发明的水凝胶联合医用黏合剂应用，增加了吻合口的密闭性能，促进神经定向生长，降低了神经功能束的错对、卷曲等问题。(3)应用本发明的水凝胶，为神经再生创造了一个良好营养环境，保证神经的快速生长。(4)应用本发明的水凝胶，不会限制再生室腔的横面积，避免瘢痕形成。
具体实施方式
以下从具体实施例进一步说明本发明。
实施例一、制备含有泊洛沙姆338、羟乙基淀粉和重组人生长激素的水凝胶
本实施例选用泊洛沙姆338、生物可降解大分子羟乙基淀粉和营养成分重组人生长激素为原料，制备水凝胶。
水凝胶的制备称取3. Og泊洛沙姆338、0. 09g羟乙基淀粉130/0. 4和O. Olg重组人生长激素，加入IOml注射用水完全溶解形成水凝胶，冷冻干燥成冻干粉，灌装于无菌西林瓶中，密封。临用时加入IOml注射用水，轻微振摇，形成水凝胶。
实施例二、制备含有泊洛沙姆188和富马酸的水凝胶
本实施例选用泊洛沙姆188和营养成分富马酸为原料，制备水凝胶。
水凝胶的制备称取2. 5g泊洛沙姆188和O. 5g富马酸，20°C水浴中振摇或搅拌至完全溶解形成水凝胶，灌装于无菌注射器中，密封。
实施例三、制备含有泊洛沙姆407、酪氨酸和人血白蛋白的水凝胶
本实施例选用泊洛沙姆407、生物可降解大分子人血白蛋白和营养成分酪氨酸为原料，制备水凝胶。
水凝胶的制备称取2g泊洛沙姆407、0. 2g人血白蛋白和O. 05g酪氨酸分散于 IOml注射用水中，搅拌至完全溶解，形成水凝胶，灌装于无菌注射器中，密封。
实施例四、制备含有泊洛沙姆407衍生物和神经营养因子的水凝胶
泊洛沙姆有多种衍生物结构，本实施例选用泊洛沙姆407的肝素化衍生物和营养成分神经营养因子为原料，制备水凝胶。
泊洛沙姆407肝素化衍生物的合成称取泊洛沙姆407 (相对分子量M = 12000， 其中a = c = 101,b = 56) 12g,于一圆底烧瓶中，加入2mmol的丁二酐、2mmol的4- 二甲基氨基吡啶及O. 55ml三乙胺，并溶解于200ml 二氧六环中，搅拌反应过夜，得末端为羧基的泊洛沙姆，以其为反应物，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，加入IOg的低分子肝素钠，搅拌反应24h。反应产物经透析袋透析3天，所得产物通过冷冻干燥得到固体粉末，得到泊洛沙姆407肝素化衍生物。
水凝胶的制备称取Ig上述合成的泊洛沙姆407肝素化衍生物，分散于IOml注射用水中，加入O. Olg神经营养因子，完全溶解，溶液灌装于一次性无菌注射器中，密封。
实施例五、胶凝温度测定本实施例以实施例1-4得到的水凝胶为对象，测定胶凝温度。
实验方法实施例1-4得到水凝胶各取5ml，在4°C下放置过夜，然后逐步升温，精确测定水凝胶随温度变化黏度值，每个样品测定三次，取平均值。
实验结果实施例1-4得到的水凝胶的胶凝温度分别为37. 80C >37. 6°C>38. (TC、 38. 2°C。因此，实施例1-4得到的水凝胶具备在37 °C以下呈流动的液体状态状，在 37 0C -45 V之间凝固成固态凝胶的特性。
实施例六、黏合法进行动物神经吻合实验
本实施例考察本发明的水凝胶联合医用黏合剂在神经吻合术中的应用性能。
实验方法健康雄性Wistar大鼠20只，体重250g 300g,随机分为两组，即粘合组(本发明的水凝胶联合医用黏合剂的实验组)和缝合组(应用缝合法的对照组)，每组 10只，采用大鼠左侧坐骨神经为修复模型进行实验。大鼠腹腔注射I %戊巴比妥钠(40mg/ kg)进行麻醉，取左侧股后部纵行切口，切开皮肤，分离肌肉，由股后外侧肌间隙显露左侧坐骨神经，在坐骨神经距梨状肌出口1. 5cm处用双面刀片切断坐骨神经，粘合组切除小部分神经使神经断端外膜留有2 3_间隙，将实施例四制备的水凝胶灌注到横断神经的两断端，应用精确温度定点加热器将两断端加热至40-41 °C，横断神经断端内的水凝胶形成固体，将两断端在手术显微镜下以准确对合，在连接处涂医用黏合剂纤维蛋白胶，30秒左右纤维蛋白胶凝固，降低吻合部的温度至37°C，完成神经吻合术，术后肢体不固定。缝合组在手术显微镜下以神经表面血管为解剖标志进行神经断端对位，采用11/0尼龙线外膜缝合4 针，术后肢体不固定。
再生神经性能观察术后8周各组取8只大鼠进行电生理检测结束后，在神经吻合处取材，用3/0丝线缚住神经两端，拉直、固定于小木板上，置于10 %中性福尔马林溶液内固定，用石蜡包埋，吻合口近、远段各Icm处做横切片，中段做纵切片，经HE和Luxolfastblue染色进行组织学观察和图像分析。其余每组2只大鼠迅速取吻合口远侧坐骨神经，立即投入-4°C 2. 5%的戊二醛中固定2小时，然后从其中切取Imm3小块，用1%锇酸后固定，逐级酒精脱水，Epon包埋，超薄切片经铝铀双染，透射电镜观察再生神经超微结构。 此外，术后8周各组取8只大鼠再次腹腔麻醉，显露双侧坐骨神经，用智能型生物信号显示与处理系统进行电生理检测，测定实验动物两侧坐骨神经的潜伏期及诱发电位的波幅，计算实验侧坐骨神经运动神经潜伏期延迟比。
实验结果再生神经组织学观察发现，应用水凝胶联合医用黏合剂的粘合组轴突扭曲较轻，瘢痕形成较少，而对照缝合组轴突扭曲较明显，呈盘旋状，瘢痕形成较多。透射电镜观察表明，应用水凝胶联合医用黏合剂的粘合组再生神经中有髓神经纤维排列整齐，髓鞘结构基本正常，轴突内神经微丝和微管及线粒体结构重新出现，对照缝合组再生神经中有髓神经纤维较疏散，髓鞘厚薄不一致，轴突内神经微丝、微管结构模糊，可见空泡样变性。 坐骨神经电生理检查结果发现，相比对照缝合组应用水凝胶联合医用黏合剂的粘合组神经传导速度快，潜伏时值小，运动神经潜伏 期延迟有较明显的改善。
在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各种修改。
权利要求
1.一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于该水凝胶中泊洛沙姆或其衍生物浓度为10% (ff/V)-30% (W/V)，生物可降解大分子和/或营养成分的浓度为0.1 % (ff/V)-5%(W/V)。
2.根据权利要求1所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于所述的泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，即a-氢羟聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，结构式为HO (CH2CH2O)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)。，在共聚物中a和c为2 150，b为15 67。
3.根据权利要求1所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于所述的生物可降解大分子包括蛋白、多糖、可溶性淀粉及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于所述的营养成分是指医学公知的具有营养或刺激神经生长作用的成分，包括激素、细胞因子、生长因子、刺激因子、趋化因子、白细胞介素、维生素、氨基酸、干扰素、单糖、双糖、低聚糖、有机弱酸。
5.根据权利要求4所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于所述的有机弱酸包括柠檬酸、酒石酸、富马酸、硼酸、醋酸。
6.根据权利要求1所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于所述的水凝胶中泊洛沙姆浓度为15% (ff/V)-25% (W/V)，生物可降解大分子和/或营养成分浓度为0.25% (ff/V)-l% (W/V)。
7.根据权利要求1所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶，其特征在于所述的水凝胶在37°C以下呈流动的高分子胶液状，在37°C _45°C之间凝固成固态凝胶。
8.一种应用于神经吻合术的水凝胶的制备方法，其特征在于在无菌操作环境下，将泊洛沙姆或其衍生物分散于注射用水中，溶解，加入生物可降解大分子和/或营养成分，振摇至完全溶解，形成水凝胶，水凝胶中泊洛沙姆或其衍生物浓度为10% (ff/V)-30% (ff/V),生物可降解大分子和/或营养成分的浓度为0. 1% (ff/V)-5% (ff/V)。
9.根据权利要求8所述的一种应用于神经吻合术的水凝胶的制备方法，其特征在于所制备的水凝胶可以进一步冷冻干燥形成冻干粉，密封于西林瓶中保存，临用前注入注射用水，轻微振摇恢复形成水凝胶。
全文摘要
本发明公开一种应用于神经吻合术的水凝胶，该水凝胶中泊洛沙姆或其衍生物浓度为10％(W/V)-30％(W/V)，生物可降解大分子和/或营养成分的浓度为0.1％(W/V)-5％(W/V)，本发明的水凝胶联合医用黏合剂应用于小间室神经吻合法，增加吻合口的密闭性能，促进神经定向生长，降低了神经功能束的错对、卷曲等问题。
文档编号A61L24/04GK102989034SQ20111028073
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月10日 优先权日2011年9月10日
发明者鲁翠涛, 赵应征, 彭磊, 张露, 孙昌正, 吕海峰, 厉星, 戴单单, 陈丽娟, 林敏 , 万常伟 申请人:温州医学院