专利名称：一种动物疾病预防或治疗用品及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物保健药物的制备技术，特别涉及一种胸腺五肽在制备动物疫苗的佐剂方法上的应用。
背景技术：
随着养殖规模的扩大，环境污染的加重，各养殖场经常出现严重的疾病，例如，猪， 牛，羊等家畜由各种细菌、病毒、支原体等引起的高烧、高热、感冒，喘气病、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、支气管肺炎、萎缩性鼻炎；猪肠道感染引起的各种下痢、腹泻、高热；猪副伤寒症；猪轮状病毒腹泻；猪喘气病；猪蓝耳病；猪生长迟缓、食少、瘦弱；仔猪水肿病；仔猪，仔牛，仔猪拉稀；猪附红细胞体病；猪传染性萎缩性鼻炎；口蹄疫，给养殖业造成了巨大的经济损失。有效预防和治疗各种动物疾病，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。动物疫苗是由免疫原性较好的病原微生物，经过繁殖和处理后制成的剂品，用于动物机体后，刺激机体产生特异性抗体，当体内的抗体程度达到一定数值时，就可抵抗这种病原微生物的侵袭、感染，可以预防动物疫病的发生。佐剂是指与抗原同时或预先使用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的一类物质。传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。目前，还出现了细胞因子、脂质体、CpG及单磷酰基脂质A四种新型佐剂铝盐佐剂应用已有七十多年历史，安全性较其他佐剂高而且生产工艺也较为成熟，因此其成为全世界应用最广泛的一类佐剂。但铝盐佐剂也有一些缺陷，例如其在诱导细胞毒性T细胞及Thl型反应中作用很有限，在同高纯度的小分子蛋白抗原共同使用时不能引起足够的抗体应答，因此铝盐在新型疫苗中的佐剂效果较差。油佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗，但油佐剂不良反应严重，皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿，油类物质长期潴留于组织中不易代谢。动物胸腺功能不全、慢性病毒感染、增生性变化等与动物自身免疫的发生有关。当动物胸腺本身功能不足或依赖胸腺的免疫系统出现明显的原发性或继发性缺陷，而自身的调节又不足以修复时，给予外源性胸腺激素就可以产生明显的疗效。如果机体免疫系统功能紊乱、低下或亢进，外源性胸腺激素可产生明显的双向调节作用。胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II (ThymopoietinII)结构中的5肽片段，具有与胸腺生成素II相同的生理功能和药效，TP-5具有使血液中超氧化物岐化酶(SOD)含量升高、超氧负离子自由基含量显著下降的功能，诱导T细胞分化作用，并与T细胞特异受体结合，使细胞内cAMP水平上升，从而诱导一系列胞内反应，达到调节免疫功能的作用。在多种免疫功能紊乱的状况下，无论是抑制还是超敏，TP-5能通过促进或抑制的双向调节作用使免疫功能趋于正常。胸腺五肽已于1985年在意大利上市，商品名为Timimox。目前胸腺五肽已获FDA批准用于对HIV的临床研究。基于成本等多种原因，胸腺五肽还没有用于制备动物保健药物。由于现在多肽固相合成工艺发展，纯度高、不含有大分子蛋白质的TP-5的大规模生产已经成为现实，因此， 本发明用胸腺五肽来开发动物保健药物，尤其是开发制备动物疫苗的佐剂。胸腺五肽是一种肽类化合物，易被胃肠道酶破坏，不方便设计成口服给药剂型。目前市售制剂为注射用冻干粉针，规格为lrng，用前加灭菌注射用水Iml溶解后肌肉注射，或溶于250ml0.9%氯化钠注射液静脉慢速滴注，一次1-2支，或隔日1次。TP-5治疗病症范围较广，用药时间为1- 个月不等，因此临床上需长期频繁注射给药，给带来诸多不便，使用和治疗极为不便，从某种意义上限制了该药的应用和市场开发。由于动物皮肤较厚，脾气暴躁，长期频繁注射给药就更加不方便，本发明难以从现有技术中吸收胸腺五肽的动物用药开发技术。因此，开发使用方便的胸腺五肽的动物用药，尤其是开发胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂，就是本发明所要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物疾病预防或治疗用品，其特征在于含有胸腺五肽和疫苗。上述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗包括猪用疫苗、禽用疫苗、牛羊疫苗、禽类疫苗以及家庭宠物疫苗。上述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗包括减毒疫苗和灭活疫苗。上述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗包括猪口蹄疫疫苗、牛口蹄疫、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗。上述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗和胸腺五肽以固体形态混
I=I O上述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗和胸腺五肽以液体形态混
I=I O上述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗和胸腺五肽分别独立包装。本发明的另一目的在于提供胸腺五肽在制备动物疫苗佐剂中的应用。上述的应用，其特征在于包括如下步骤胸腺五肽与动物疫苗联合使用。上述的应用，其特征在于所述动物疫苗包括猪口蹄疫疫苗、牛口蹄疫、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗。本发明的另一目的在于提供一种治疗动物疾病的用品包装，其特征在于包装中含有胸腺五肽和疫苗。本发明的另一目的在于提供一种治疗动物疾病的用品的制备方法，涉及用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法。胸腺五肽与动物疫苗，溶解在缓冲溶液中，混合；动物疫苗包括猪口蹄疫疫苗、 牛口蹄疫、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗。具体而言，本发明的治疗动物疾病的用品的制备方法包括如下步骤A将一定量的胸腺五肽、动物疫苗、辅料、溶解在缓冲溶液，制成内水相溶液；B将药用高分子聚合物制成油相溶液；C将上述含活性成分的内水相溶液加入到油相溶液中，加入非离子表面活性剂，搅拌混合均勻，制成初乳；
D将辅料和锌盐充分溶解于水制成外水相溶液；E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均勻，制成复乳W内/0/W外；F将复乳W内/0/W外，转移到含盐水溶液中，搅拌均勻，使有机溶剂挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、冻干，得微球。本发明的用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法包括如下步骤A将一定量的胸腺五肽、动物疫苗、辅料、溶解在缓冲溶液，制成内水相溶液；B将药用高分子聚合物制成油相溶液；所述的药用高分子辅料选自壳聚糖、聚乙交酯-丙交酯、明胶、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚乙二醇、羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸共聚物中的一种或两种以上的混合物。C将上述含胸腺五肽、动物疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，加入非离子表面活性剂，搅拌混合均勻，制成初乳；所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂和多元醇型非离子表面活性剂，维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、泊洛沙姆、聚山梨酯或单硬脂酸甘油酯，硬酯酸聚氧乙烯酯或聚氧乙烯烷基醚、失水山梨醇酯、硬脂酸聚烃氧基酯、及其组合。所述非离子表面活性剂的用量为0. 01-5毫克/毫升，以所述组合物的总重量计。D将辅料和锌盐充分溶解于水制成外水相溶液；辅料选自海藻酸钠、乙二醇、丙二醇、甘油、水溶性聚乙二醇无机锌盐选自碳酸锌、氯化锌、硝酸锌或硫酸锌，有机锌盐选自醋酸锌、甘氨酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌、乳酸锌、赖氨酸锌或蛋氨酸锌。 E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均勻，制成复乳W内/0/W外；F将复乳W内/0/W外，转移到含盐水溶液中，搅拌均勻，使有机溶剂挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、冻干，得微球。盐选自NaCl、CaCl2用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法包括如下步骤A将一定量的胸腺五肽、动物疫苗、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、甘露醇、溶解在磷酸盐缓冲溶液，制成内水相溶液，胸腺五肽的含量为0. 01-50毫克/毫升，动物疫苗0. 01-50 毫克/毫升，乙二胺四乙酸钠0. 1-2毫克/毫升、海藻糖0. 5-5毫克/毫升、甘露醇0. 5-5
毫克/毫升；B将壳聚糖-聚乳酸的聚合物用大豆油溶解制成油相溶液，壳聚糖-聚乳酸的聚合物的含量为0. 1-0. 5克/毫升；C将上述含胸腺五肽、动物疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，油相溶液与内水相溶液的比例为20 1至2 1，加入泊洛沙姆0.1-1毫克/毫升，使这两种溶液在温度 5-30°C下搅拌混合均勻，制成初乳，在4-10°C下保存；D将海藻酸钠和锌盐充分溶解于水制成外水相溶液，海藻酸钠的重量浓度为 0. 5-50毫克/毫升，锌盐的重量浓度为0. 1-2毫克/毫升；E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均勻，初乳与外水相溶液的比例为1 50至 1 200，制成复乳W内/0/W外，在4-10°C下保存；F将复乳W内/0/W外，转移到1-2毫克/毫升NaCl和1_2毫克/毫升CaCl2的水溶液中，搅拌均勻，G使有机溶剂在低压中挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法包括如下步骤所述步骤C中的搅拌温度为5-30°C，搅拌速度为500-8000转/分，搅拌时间为 0. 2-0. 5小时；所述步骤E中的搅拌温度为5-30°C，搅拌速度为100-3000转/分，搅拌时间为0. 2-0. 5小时；所述步骤F中的搅拌温度为5-30°C，搅拌速度为500-3000转/分，搅拌时间为0. 2-0. 5小时。用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法包括如下步骤有机溶剂挥发采用，将上述复乳移入超临界装置的高压容器中，通入超临界二氧化碳，升压至7. 4-lOMPa，室温 20-60分钟后释放，有机溶剂被超临界二氧化碳带走，微球溶胀沉析而出，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法包括如下步骤，壳聚糖-聚乳酸的聚合物的制备方法是以聚乳酸和丙二醇，氯仿，聚乙烯吡咯烷酮，搅拌，50摄氏度，微波，减压蒸馏除去氯仿，用乙酸乙酯将反应粗产物溶解，在不断搅拌下将其加入到蒸馏水中，过滤，并用水多次洗涤，真空干燥，得白色固体酯化聚乳酸，将上述制得的酯化聚乳酸，加入氯仿及二甲基亚砜，乙酸酐，DlOl大孔树脂，室温下搅拌反应，用乙醇沉淀并洗涤，真空干燥，得白色固体产物醛化聚乳酸，将壳聚糖，上面制得的醛化聚乳酸加入二甲基亚砜中，室温下搅拌反应，用乙醇沉淀，沉淀物在索氏抽提器中抽提，真空干燥，得浅黄色粉末状固体壳聚糖-聚乳酸的聚合物。用胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂的方法，用于制备治疗如下动物疾病的药物由各种细菌、病毒、支原体等引起的猪，牛，羊的高烧、高热、感冒，喘气病、猪肺疫、 传染性胸膜肺炎、支气管肺炎、萎缩性鼻炎；猪肠道感染引起的各种下痢、腹泻、高热；猪副伤寒症；猪轮状病毒腹泻；猪喘气病；猪蓝耳病；猪生长迟缓、食少、瘦弱；仔猪水肿病；仔猪、仔牛、仔猪拉稀；猪附红细胞体病；猪传染性萎缩性鼻炎和口蹄疫。本发明的有益效果以胸腺五肽为佐剂的动物疫苗，能够减少动物疫苗用药次数，是一种理想的动物保健品药物，具有制备工艺简单，应用方便，成本低等特点。本发明采用毒性小，注射安全的分散剂及油相等材料，使胸腺五肽和动物疫苗均勻的分散，成为一种胸腺五肽和动物疫苗的长效剂型。体外实验表明，以胸腺五肽、动物疫苗为包裹对象，电镜扫描结果显示，所制得的胸腺五肽微球形态圆整，粒度分布均勻，粒径分布在40微米以下，包封率在73. 0%以上，体外缓释可以达3周释药，符合长效制剂特征。一次注射后能够在较长时间内发挥药效。将胸腺五肽做成微球制剂，可以延长药物作用时间，大大提高药物疗效和经济效益。稳定性试验结论影响因素试验结果表明，本发明的制剂在光照、在高温 40 0C _25°C条件下放置6个月后、含量不下降、有关物质没有增加；在加速试验条件 (250C 士2°C，RH60士 10% )放置6个月，PH值下降、含量下降、有关物质增加；在长期试验条件-10°C，)放置6个月，各项指标均无明显改变。
本发明涉及用于制备治疗和预防如下动物疾病的药物中的应用猪，牛，羊等家畜由各种细菌、病毒、支原体等引起的高烧、高热、感冒，喘气病、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、支气管肺炎、萎缩性鼻炎；猪肠道感染引起的各种下痢、腹泻、高热；猪副伤寒症；猪轮状病毒腹泻；猪喘气病；猪蓝耳病；猪生长迟缓、食少、瘦弱；仔猪水肿病；仔猪，仔牛，仔猪拉稀； 猪附红细胞体病；猪传染性萎缩性鼻炎和口蹄疫。
具体实施例方式本发明的保护范围包括而不限于本文本所描述的范围。实施例1-壳聚糖-聚乳酸的聚合物的制备方法是以分子量为5000聚乳酸500克和丙二醇适量，聚乳酸和丙二醇的摩尔比为1 5， 氯仿50毫升，聚乙烯吡咯烷酮3克，搅拌，50摄氏度，微波反应2小时。减压蒸馏除去氯仿。用乙酸乙酯将反应粗产物溶解，在不断搅拌下将其加入到蒸馏水中，过滤，并用水多次洗涤，真空干燥，得白色固体酯化聚乳酸，产率90%。将上述制得的酯化聚乳酸50克，加入20毫升氯仿及100毫升二甲基亚砜，50克乙酸酐，DlOl大孔树脂3克，室温下搅拌反应M小时，用乙醇沉淀并洗涤，真空干燥，得白色固体产物醛化聚乳酸，产物收率为95%。将壳聚糖10克，上面制得的醛化聚乳酸30克加入60毫升二甲基亚砜中，室温下搅拌反应48小时。用乙醇沉淀，沉淀物在索氏抽提器中抽提3天，真空干燥，得浅黄色粉末状固体，壳聚糖-聚乳酸的聚合物的产率为97%。实施例2-以胸腺五肽为佐剂的牛口蹄疫疫苗步骤如下A将一定量的胸腺五肽、牛口蹄疫0型灭活疫苗、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、甘露醇、溶解在磷酸盐缓冲溶液，制成内水相溶液，胸腺五肽的含量为0. 05毫克/毫升，牛羊口蹄疫0型灭活疫苗的含量为0. 01毫克/毫升，乙二胺四乙酸钠0. 1毫克/毫升、海藻糖0. 5 毫克/毫升、甘露醇0. 5毫克/毫升；B将壳聚糖-聚乳酸的聚合物用大豆油溶解制成油相溶液，壳聚糖-聚乳酸的聚合物的含量为0.1克/毫升；C将上述含胸腺五肽、动物疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，油相溶液与内水相溶液的比例为20 1，加入泊洛沙姆0. 1毫克/毫升，使这两种溶液在温度15°C下搅拌混合均勻，搅拌速度为8000转/分，搅拌时间为0. 2小时，制成初乳，在4°C下保存；D将海藻酸钠和锌盐充分溶解于水制成外水相溶液，海藻酸钠的重量浓度为0. 5
毫克/毫升，甘氨酸锌的重量浓度为0.1毫克/毫升；E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均勻，，搅拌速度为3000转/分，搅拌时间为 0.2小时，温度15°C，初乳与外水相溶液的比例为1 50，制成复乳W内/0/W外，在4°C下保存；F将复乳W内/0/W外，转移到1毫克/毫升NaCl和1毫克/毫升CaCl2的水溶液中，搅拌均勻，搅拌速度为3000转/分，搅拌时间为0. 2小时，温度15°C，G使有机溶剂在低压中挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。牛口蹄疫0型毒种来自中国农业科学院兰州兽医研究所。本实施例制备的动物疾病治疗和预防用品在水中扩散良好，在4_8°C冰箱中保存6个月、10- °C室温中保存6个月、37 °C中保存30天均不分层，疫苗经过4500转/分钟离心15分钟不分层。疫苗在Iml吸管中垂直自然流出。光镜下可见疫苗乳化粒子呈1-5 μ m 的均勻颗粒。本实施例制备的药物组合物的安全性检验用本实施例的0型口蹄疫疫苗接种5头6个月-2岁健康无口蹄疫抗体的黄牛。每头试验牛颈部肌肉注射疫苗10ml，隔离观察10天，同时设空白对照5头，颈部肌肉生理盐水，每天测温2次，注意临床症状，牙龈、口腔、四蹄是否有病变。小白鼠用本实施例的0型口蹄疫疫苗皮下接种20只健康成年小白鼠，每只注射 Iml,同时设20只空白对照。连续隔离观察7天，密切注意是否出现临床症状及其它异常变化。结果大剂量接种的牛、成年小白鼠后，未有异常情况。实施例3制备的药物组合物对牛口蹄疫的免疫保护作用实验动物同品种、来源的6-18月健康牛，血清中亚洲I型、0型口蹄疫病毒抗体均为阴性。实验分组本实施例产品按照ang/ml的比例，lml/只/次，臀部肌肉注射， 0. 2mg/kg体重，2日1次，连用5天。牛口蹄疫灭活苗阳性对照组商品化牛亚洲0型口蹄疫病毒灭活苗，600 μ g/ml，2 毫升/只/次，臀部肌肉注射。PBS阴性对照组PBS，lml/只/次，臀部肌肉注射。于各组给药后的第30天，在牛耳皮下注射0型口蹄疫病毒佳木斯毒株， 10000ID50/0. lml。于注射病毒后第5天判断发病情况。除注射病毒的舌面外，牙龈、口腔、四蹄、乳头任何部位出现水泡，即可判断为发病。阴性对照组的牛至两个蹄子出现水泡，方可判定攻毒实验成立。结果见表。实验结果表明，本实施例产品具有预防牛0型口蹄疫病毒感染的作用。
权利要求
1.一种动物疾病预防或治疗用品，其特征在于含有胸腺五肽和疫苗。
2.根据权利要求1所述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗包括猪用疫苗、禽用疫苗、牛羊疫苗、禽类疫苗以及家庭宠物疫苗。
3.根据权利要求1所述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗包括减毒疫苗和灭活疫苗。
4.根据权利要求1所述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗包括猪口蹄疫疫苗、牛口蹄疫、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗。
5.根据权利要求1-4任意一项所述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗和胸腺五肽以固体形态混合。
6.根据权利要求1-4任意一项所述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗和胸腺五肽以液体形态混合。
7.根据权利要求1-4任意一项所述动物疾病预防或治疗用品，其特征在于所述疫苗和胸腺五肽分别独立包装。
8.胸腺五肽在制备动物疫苗佐剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于包括如下步骤胸腺五肽与动物疫苗联合使用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述动物疫苗包括猪口蹄疫疫苗、牛口蹄疫、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗。
11.一种治疗动物疾病的用品包装，其特征在于包装中含有胸腺五肽和疫苗。
12.权利要求1所述的治疗动物疾病的用品的制备方法，其特征在于包括如下步骤A将一定量的胸腺五肽、动物疫苗、辅料、溶解在缓冲溶液，制成内水相溶液；B将药用高分子聚合物制成油相溶液；C将上述含活性成分的内水相溶液加入到油相溶液中，加入非离子表面活性剂，搅拌混合均勻，制成初乳；D将辅料和锌盐充分溶解于水制成外水相溶液；E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均勻，制成复乳W内/0/W外；F将复乳W内/0/W-外，转移到含盐水溶液中，搅拌均勻，使有机溶剂挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、冻干，得微球。
全文摘要
本发明属于动物保健药物的制备技术，特别涉及胸腺五肽在制备动物疫苗的佐剂上的应用。由于动物皮肤较厚，脾气暴躁，长期频繁注射给药就更加不方便，本发明因此开发了使用方便的胸腺五肽的动物用药，尤其是开发胸腺五肽制备动物疫苗的佐剂，为胸腺五肽在畜牧业的应用开辟了广阔的道路。
文档编号A61K39/39GK102406935SQ20111036437
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者赵联华 申请人:赵联华