专利名称：Ggpps拮抗剂在制备治疗ii型糖尿病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及GGPPS在II型糖尿病药物治疗中的应用，尤其涉及GGPPS拮抗剂在制备治疗II型糖尿病药物中的用途。
背景技术：
II型糖尿病又称非胰岛素依赖糖尿病、成年型糖尿病，是一种多病因的代谢疾病。 其发病因素很多，除内在的遗传因素外，还与人们生活环境、生活方式及行为有很大的关系，尤其是过度肥胖引起的一些代谢紊乱易导致II型糖尿病。另外，90%患者于在35 40岁之后发病。II型糖尿病主要表现为患者肌肉和脂肪组织能够对胰岛素产生抗性，而作为补偿，胰岛β细胞则分泌更多的胰岛素，但依旧不能把血糖维持在正常范围内。而过量的胰岛素分泌使胰岛β细胞功能受到损伤，导致胰岛素分泌不足。II型糖尿病在世界各地均有很高的发病率，尤其在过去的50年中II型糖尿病发病率伴随肥胖率显著增长，直至2010年全球患者数已超过II亿8千万。而在我国，II型糖尿病已经成为发病率增长最快的疾病。最新资料表明，我国糖尿病患者已超过6000万，约占全球糖尿病患者的五分之一。预计截止到2025年我国糖尿病患者总数将接近1亿。胰岛素抵抗是指机体靶组织对胰岛素的反应性低于正常的一种病理生理状态，经常与肥胖，II型糖尿病早期阶段等临床疾病相伴随，是这些疾病的一个重要的特征，也是导致这些疾病发生的重要因素。但是造成胰岛素抵抗以及由此导致的肥胖，II型糖尿病等相关疾病的分子机制并不是很清楚。这就导致了其防治的困难。胰岛素抵抗细胞模型的构建主要分为两个部分将3T3-L1前脂细胞诱导为脂肪细胞以及将后者诱导为胰岛素抵抗脂肪细胞。构建胰岛素抵抗细胞模型是进行顶相关疾病(如II型糖尿病)的病理机制探索及药物研发的重要途径。根据英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS) II型糖尿病患者的胰岛β细胞由于出现功能的渐进恶化，随着II型糖尿病病程的进展，多数II型糖尿病患者最终都需要胰岛素治疗以达到良好的血糖控制。 ggpps基因即香叶基香叶基二磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase l，ggppsl)基因。在蛋白质异戊二烯化修饰过程中起到关键作用， ggpps的底物GGPP是小G蛋白发生香叶基化的重要前体。香叶基化是蛋白质的翻译后修饰之一，一般发生在蛋白质C末端保守的半胱氨酸。发生香叶基化的蛋白质包括Ras和 Ras相关的小G蛋白如I h0，Rab，Rac，以及三聚体G蛋白的γ亚基，这些受调控的蛋白质都是信号传递通路中重要的分子开关调节蛋白。有研究报道，以GGPPS为药物靶点对于成骨细胞分化与骨骼构建有改善作用(Weivoda and Hohl 2011)，也有研究阐述了 GGPPS可作为香烟烟雾引发的肺部疾病的治疗靶点(Shen，G0ng et al. 2011)，但就GGPPS用于治疗 II型糖尿病之间的靶点药物并没有任何报道。
发明内容
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有鉴于此，本发明的目的在于通过考察GGPPS基因在II型糖尿病模型中表达与功能活性，确认GGPPS能否作为II型糖尿病治疗的药物靶点以及增效药物，从而提高II型糖尿病患者的治疗效果及生命质量。为达上述目的，发明人考察了 GGPPS在胰岛素抵抗细胞模型与胰岛素长期刺激胰岛素抵抗细胞模型以及II型糖尿病患者组织检测表达变化，同时进行了干扰GGPPS对胰岛素抵抗的缓解，糖耐量实验以及胰岛素信号通路IRS检测。结果发现通过胰岛素的刺激在胰岛素抵抗细胞模型中GGPPS显著增长；降低了胰岛素信号通路敏感性同样在II型糖尿病患者的脂肪组织中检测发现GGPPS蛋白与mRNA水平均高于对照组；根据糖耐量实验结果显示GGPPS+雄性小鼠对于葡萄糖耐受量较GGPPS+/-雄性小鼠更高且对胰岛素敏感性更强； 胰岛素通路IRS检测结果显示GGPPS+小鼠的^S ser612磷酸化程度显著降低使胰岛素敏感性得到恢复，胰岛素抵抗症状得到缓解。本发明治疗II型糖尿病的药物施用方式可以是口服、特定组织器官施用、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。本发明的药物也可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明中，所述小干扰RNA为对应标靶序列为序列表中SEQ ID NO: 1或2的DNA 序列的小干扰RNA。根据本发明的记载和本领域的公知常识，抑制GGPPS对于治疗II型糖尿病有增敏作用。GGPPS基因重组表达载体例如本申请中构建的Ade-ggpps/siRNA重组腺病毒可以单独或与其他有功能活性基因重组表达载体联合，再辅以药学上可接受的载体，用以制备治疗II型糖尿病的增敏药物。进一步，根据本发明的记载和本领域的公知常识可知，任何在转录和/或翻译水平上抑制GGPPS基因的拮抗剂均可单独或与其他具有功能活性的多肽、蛋白质、融合蛋白等联合，再辅以药学上可接受的载体，用于制备治疗II型糖尿病的增敏药物。本发明的有益效果在于本发明首次公开了 GGPPS基因和蛋白的拮抗剂可以用于制备治疗II型糖尿病的增敏药物，有助于提高胰岛素把组织对于胰岛素的敏感性，增强胰岛素的疗效，提高II型糖尿病患者的生命质量，在II型糖尿病治疗领域具有潜在、良好的应用前景。
图1为胰岛素抵抗细胞模型的建立。在用TNF-α细胞因子诱导脂肪细胞3天后， 采用免疫印迹的方法检测胰岛素信号通路中IRS的酪氨酸磷酸化水平的变化。胰岛素抵抗细胞在胰岛素刺激后葡萄糖摄取的程度显著下降。图2显示了 GGPPS在胰岛素抵抗细胞模型中的变化。图3显示干扰GGPPS恢复胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性。图4显示GGPPS在II型糖尿病人中呈特异性高表达。**表示两者相比具有统计学显著差异。图5显示敲除GGPPS提高小鼠糖耐量。
图6显示敲除GGPPS提高小鼠的胰岛素敏感性。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件
一般材料和方法 1材料
3T3-L1细胞系购自上海细胞所，胰岛素(诺和灵R)，地塞米松购自鼓楼医院， [3H]-D-Glucose购自中国同位素总公司，IBMX购自Sigma公司，anti-p-IRS (Tyr)抗体，anti-IRS抗体，胎牛血清购自PAA公司，Anti-p-ERK抗体，anti-ERK抗体购自 (上海康城生物技术公司)反转录试剂盒Traverse-Ace以及荧光定量PCR试剂盒购自 TOYOBO公司。TNF-α细胞因子购自Sigma公司，油红染料购自南京生兴生物技术公司。 anti-p-IRS(Ser308)，anti-p-IRS(Ser612)均购自 Cell signaling 公司，野生型及db/db 小鼠(Bks)购自南京大学模式动物研究所，罗氏血糖仪，glucose购自Sigma公司。II型糖尿病病人组织标本由江苏省中医院提供。细胞培养
前脂细胞(3T3-L1)培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的DMEM 培养基中，于37° C、5% C02浓度条件下的细胞培养箱中培养。脂肪细胞以及胰岛素抵抗细胞的诱导
前脂细胞(3T3-L1)接种并长满后培养基换为含有10%胎牛血清，150nmol/L胰岛素， 250nmol/L 地塞米松以及 0. 5mmol/L 3-isobutyl-l-methylxanthine 的刺激液 1，培养 2天后，换为含有10%胎牛血清和150nmol/L胰岛素的培养基，再培养2天后，细胞换回正常的含10%胎牛血清的DMEM培养基，6天后即出现大量含有脂滴的脂肪细胞。3T3-L1 前脂细胞在诱导为脂肪细胞后，用含有终浓度为5ng/ml的TNF-α细胞因子的DMEM培养基诱导3天，每24小时换液，3天后即为胰岛素抵抗脂肪细胞。油红染色
将诱导好的脂肪细胞用PBS洗3遍，加入油红染料，吸干，10倍显微镜镜检。葡萄糖摄取实验
每个细胞样本加入[3H]-D-Gluc0se使终浓度为200uCi/mmol/L，同时加入终浓度为 IOnm的胰岛素，3小时后，用冰预冷的PBS洗3遍，加入IOM KOH裂解细胞，用等体积无水乙醇沉淀葡萄糖过夜，IOOOOg离心10分钟，用无菌水200ul重悬沉淀，用闪烁计数器检测。免疫印迹分析
细胞培养至可以进行蛋白抽提时，吸去培养基，用冰预冷的PBS洗两遍，加入300ul 裂解缓冲液(50.0 mmol/L Tris, 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 1.0 mmol/L Na3VO4, 2. 0 mmol/L NaF, 100. 0 μ g/ml PMSF, 1. 0 μ g/ml Ieup印tin, and 1.0 μ g/ml aprotinin )，冰浴30 min，期间每隔5分钟混勻一次，刮取细胞，12 000 g离心10分钟，收集上清。(或取自动物组织，提取蛋白)采用Bradford法测定蛋白质浓度。 取50 μ g的总蛋白进行SDS-PAGE胶电泳分离，按常规方法转印至PVDF膜上，一抗4°C孵育过夜，anti-p-IRS (Tyr) (1 500)，anti-IRS (1 500)，用 AP标记的二抗与NBT 和 BCIP显色或者采用 BM chemiluminescence Western Blotting Kit(购自 Roche 公司)检测结果。提取组织标本RNA
取Img组织标本，悬浮于Iml Trizol Gnvitrogen)，用组织勻浆器勻浆3-5分钟， 加1/5体积酚氯仿抽提蛋白，12000rpm，离心10分钟，抽取上清，加等体积的异丙醇，-20 度，20分钟沉淀RNA，12000rpm，离心10分钟，弃上清，沉淀溶于20ul DEPC(焦碳酸二乙脂)溶液，测定浓度。反转录PCR
通过Tranverse-Ace反转录试剂盒(Τ0Υ0Β0)，采用oligo-dT进行逆转录。取800ng 总RNA反转录合成单链cDNA，流程如下800ng总RNA，加入Iul mol/L Oligo dT引物 lul，补DEPC水至10ul。65° C，反应5 min后，迅速置于冰上，再加入反应缓冲液如1， IOmmol/L dNTP 2ul，20 U/ul 的 RNA酶抑制剂 lul。在 37° C 反应5 min 后，加入 Iul 10 U/ul逆转录酶，42° C反应1 h后在90° C处理10 min。实时荧光定量PCR
采用实时荧光定量PCR试剂盒(Τ0Υ0Β0)，具体体系如下
20 μ 1 体系，STOR(2*) :10μ 1，引物(上游)(10*) :2 μ 1，引物(下游)(10*) :2μ 1， cDNA模板2μ 1，加双蒸水至20 μ 1。ggpps实时定量PCR引物序列
ggpsl(鼠)正向5，- TTTTGCATACACTCGACACACT-3’ (SEQ ID N0:3) ggpsl (鼠)反向5，- GGCCTCAATTTGTTTGTAGGCTT-3，(SEQ ID N0:4) ggpsl (人)正向5，-CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3，(SEQ ID N0:5) ggpsl (人)反向5，-CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ (SEQ ID N0:6) 扩增条件
95°C预变性5分钟，95°C变性15秒，60°C退火15秒，72°C延伸，收集荧光信号45 秒，共40个循环，数据分析。构建
根据siRNA设计的一般原则设计选取靶序列。本实验选取的靶序列是5’-G⑶⑶CCCAUCU⑶CAUUA-3，(PI, GGPPS 小干扰 RNA 靴向序列)(SEQ ID N0:1)/ 5'-⑶CCCACUGAAGAAGAAUA-3，(P2 有义链，GGPPS 小干扰 RNA 靶向序列)(SEQ ID N0:2) 将上述序列交由上海生工生物技术有限公司合成。寡核苷酸退火将合成的寡核苷酸溶解在ddH20中，终浓度为lyg/ Ul。依次按以下步骤操作寡核苷酸Pl，P2各取1. 5 μ 1加入47 μ 1的退火缓冲液(100 mmol/L乙酸钾，30 mmol/L HEPES-K0H pH 7.4，2mmol/L 乙酸镁),94°C 孵育 4 min, 70°C 孵育 10 min，缓慢冷却至4°C。寡核苷酸磷酸化取Iul退火的寡核苷酸，加1 μ 1 Τ4 PNK缓冲液、1 ul 1 mmol/L AT P (储存液 IOmM)、lul T4 ΡΝΚ、6 μ IH2O,在 37°C 孵育 30 min，70°C孵育 10 min(灭活 PNK)。
质粒酶切、去磷酸化与纯化
按如下体系以Bgl II和Hind III双酶切穿梭质粒，37 0C孵育4 h。85°C，加热15 min以终止反应。直接向反应体系中加入0. 1 μ 1的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化反应1 h。用1%的琼脂糖凝胶电泳。在长波紫外灯照射下，割取目的片段，用DNA胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收。Bgl II和Hind III双酶切穿梭质粒反应体系 IOXbuffer1.0 μ 1
穿梭质粒8. 0 μ 1 ( 2. 0μ g)
Bgl II0. 2 μ KlOU/ μ 1)
Hind III0. 2 μ 1 (IOU/ μ 1)
H2O0. 6 μ 1
连接与转化连接反应体系
IOXLigase buffer1. 0 μ 1
Τ4 DNA Ligase0. 5 μ 1
酶切过的载体5.0μ1
P10. 5 μ 1
P20. 5 μ 1
H2O2· 5 μ 1
将5.0 μι的酶切过的载体转移到无菌微量离心管中，加Ρ1、Ρ2各0.5 μι，加水至 8.5 μ ，于45° C加温5 min以使重新退火的粘端解链，将混合物冷却至0°C，再分别加入连接酶缓冲液1.0 μ 1, Τ4 DNA连接酶0.5 μ ，混勻，于16°C孵育过夜。次日取5.0 μ 1转化大肠杆菌感受态细胞。重组质粒的鉴定
挑克隆，小量提取质粒，以EcoR I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。预期阳性克隆酶切产物会释放一个300 bp的条带，而阴性对照相应条带只有MO bp。为了进一步从序列的准确性上得到验证，选取EcoR I酶切后电泳出现300bp条带的阳性重组质粒送至上海生工有限公司测序。重组穿梭质粒基因沉默效率检测
在重组包装病毒之前，我们用磷酸钙沉淀法将重组穿梭质粒瞬时转染细胞对其基因沉默效率进行了检测。重组腺病毒的构建
重组质粒pATC-GGPPS/siRNA经Riie I酶切线性化后，用电穿孔法将其与质粒 pAdEasy-Ι共同转化感受态菌BJ5183 (条件电脉冲25 μ F，电压2.5 kV,电阻200 Ω )， 进行同源重组。用he I酶切鉴定同源重组的质粒，以电穿孔法将重组子转化入大肠杆菌 DHlOa内，大量制备重组腺病毒质粒DNA备用转染。重组腺病毒的包装和收获将重组质粒用磷酸钙法转染ΗΕΚ493Α细胞。转染后 7-10天，出现细胞病变效应(cytopathic effects, CPE)，表现为贴壁细胞变圆、核浓缩、 脱落，出现病毒空斑。收集细胞，反复冻融3次，离心，收集上清于-70 0C保存备用。
病毒颗粒浓度的测定在对孔细胞培养皿中，待培养的4孔四3细胞生长至90% 汇合时，吸去培养液，加入0.5 mL无血清DMEM培养液，分别滴加入5、10、30及40 ul的病毒稀释液(稀释约500倍)，小心混勻，置于含5%C02培养箱中培养。Ih后，小心加入0.5 mL含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液，混勻、培养，观察CPE ;3 d后，待加入5ul病毒稀释液的孔完全出现CPE现象时，计数细胞并计算病毒颗粒的浓度。病毒颗粒的浓度=(细胞数X 20/病毒稀释液的体积)X病毒稀释倍数。免疫沉淀
取含相同蛋白量(150 μδ)的细胞裂解液，加入相关抗体2 μδ,4 ° C轻摇1小时后，再加入Protein G-agrose珠子30 μ ，在4 ° C，孵育过夜。离心，弃上清，用洗涤缓冲液(50. 0 mmol/L Tris, 150. 0 0. 1% SDS, 1. 0% NP-40, 1. 0 mmol/L Na3V04, 2.0 mmol/L NaF, 100.0 μ g/ml PMSF, 1.0 μ g/ml Ieup印tin，and 1.0 μ g/ ml aprotinin )洗涤沉淀1次，提高至NaCl浓度至400 mmol/L洗涤第二次，第三次采用原缓冲液洗涤，弃上清。加入等体积2XSDS样品缓冲液，95° C加热样品5 min，通过 SDS-PAGE胶电泳分离，进行免疫印迹分析。小鼠禁食12小时后，腹腔注射葡萄糖(1. 8mg/g)，分别在不同时间点尾部取血，用血糖仪检测小鼠血液中葡萄糖含量。小鼠禁食12小时后，再喂食12小时，尾部取血，检测小鼠血液中葡萄糖含量。 实施例1
胰岛素抵抗细胞模型的建立
根据前面“一般材料与方法”一节的方法，我们诱导建立了胰岛素抵抗细胞模型。在用 TNF-α细胞因子诱导脂肪细胞3天后，采用免疫印迹的方法检测胰岛素信号通路中IRS 的酪氨酸磷酸化水平的变化。如图IA所示。TNF-α细胞因子诱导后，IRS的酪氨酸磷酸化水平显著下降。我们检测了胰岛素抵抗细胞葡萄糖摄取的程度。如图IB所示，胰岛素抵抗细胞在胰岛素刺激后葡萄糖摄取的程度显著下降。上述结果都表明胰岛素抵抗细胞模型得以成功建立。实施例2
GGPPS在胰岛素抵抗模型中的变化
我们通过免疫沉淀法检测了通过胰岛素刺激后，胰岛素抵抗细胞模型中GGPPS的水平变化。如图2所示，通过胰岛素的刺激在胰岛素抵抗细胞模型中GGPPS显著增长。实施例3
干扰GGPPS恢复胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性
我们使用上节“一般材料和方法”中构建的Ade-ggpps/siRNA重组腺病毒干扰胰岛素抵抗细胞中GGPPS的表达。在胰岛素刺激后的不同时间点，我们检测了 p-Erkl/2的水平。 如图3所示，与对照相比，在干扰了 GGPPS表达的胰岛素抵抗细胞中的p-ErklA水平显著降低。这表明干扰GGPPS恢复了胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性。实施例4
GGPPS在II型糖尿病人中呈特异性高表达
我们分别在蛋白质水平(图4A)和mRNA水平(图4B)上检测了 II型糖尿病患者脂肪组织中GGPPS的表达。如图4所示，II型糖尿病人中GGPPS的表达水平显著高于正常对照。实施例5
敲除GGPPS提高了小鼠糖耐量
我们按照上节“一般材料与方法”中的GTT法及ITT法检测了 GGPPS-/-雄性小鼠和 GGPPS-/-雄性小鼠的耐糖量。如图5所示，根据糖耐量实验结果显示GGPPS-/-雄性小鼠对于葡萄糖耐受量较GGPPS+/-雄性小鼠更高且对胰岛素敏感性更强。实施例6
敲除GGPPS提高了小鼠的胰岛素敏感性
我们进一步检测了 GGPPS-/-雄性小鼠和GGPPS-/-雄性小鼠中胰岛素通路IRS的磷酸化水平。如图6所示，检测结果显示GGPPS-/-小鼠的^S ser612磷酸化程度显著降低使胰岛素敏感性得到恢复，胰岛素抵抗症状得到缓解。
9
权利要求
1.GGPPS拮抗剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述GGPPS拮抗剂增加胰岛素敏感性。
3.GGPPS拮抗剂在制备治疗II型糖尿病的增敏药物中用途。
4.权利要求1-3任一项的用途，其中所述的GGPPS拮抗剂抑制GGPPS基因转录和/或翻译。
5.权利要求4的用途，其中所述GGPPS拮抗剂包括针对GGPPS的小干扰RNA。
6.权利要求5的用途，其中所述小干扰RNA靶向以下序列5’-G⑶⑶CCCAUC腳CAUUA-3，(SEQ ID N0:1)或 5，-⑶CCCACUGAAGAAGAAUA-3，(SEQ ID NO:2)。
7.权利要求6的用途，其中所述小干扰RNA的编码序列为 5，-G⑶⑶CCCAUCU⑶CAUUA-3，(SEQ ID N0:1)。
8.权利要求7的用途，其中所述GGPPS拮抗剂为表达所述小干扰RNA的真核表达载体。
9.权利要求8的用途，其中所述真核表达载体是Ade-ggpps/siRNA重组腺病毒。
全文摘要
本发明公开了GGPPS在II型糖尿病药物治疗中的应用，尤其提供了GGPPS拮抗剂在制备治疗II型糖尿病药物中的用途。本发明首次公开了GGPPS基因和蛋白的拮抗剂可以用于制备治疗Ⅱ型糖尿病的增敏药物，有助于提高胰岛素把组织对于胰岛素的敏感性，增强胰岛素的疗效，提高Ⅱ型糖尿病患者的生命质量，在Ⅱ型糖尿病治疗领域具有潜在、良好的应用前景。
文档编号A61P3/10GK102526763SQ20121007910
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者李朝军, 沈宁, 薛斌, 郁晓, 陆克 申请人:南京大学