专利名称：Egr-1拮抗剂在制备治疗Ⅱ型糖尿病的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Egr-I作为治疗II型糖尿病靶标的应用，尤其是涉及Egr-I拮抗剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途。
背景技术：
II型糖尿病是一种常见病，多发病，在我国以及全世界都具有很高的发病率，在我国，II型糖尿病已经成为发病率增长最快的疾病。最新资料表明，我国糖尿病患者已超过6000万，占全球糖尿病患者的五分之一。预计截止到2025年我国糖尿病患者总数将接近1亿。II型糖尿病是一种多病因的代谢疾病，除内在的遗传因素外，还与人们生活环境、生活方式及行为有很大的关系，特别是过度肥胖引起的一些代谢紊乱易导致II型糖尿病。II型糖尿病又称为非胰岛素依赖型糖尿病，是指肌肉和脂肪组织对胰岛素产生抗性，作为补偿，胰岛β细胞则分泌更多的胰岛素，但仍不能把血糖维持在正常范围内。另外，过量的胰岛素分泌使胰岛β细胞功能受到损伤，导致胰岛素分泌不足。胰岛素抵抗是指机体靶组织对胰岛素的反应性低于正常的一种病理生理状态，经常与肥胖，II型糖尿病早期阶段等临床疾病相伴随，是这些疾病的一个重要的特征，也是导致这些疾病发生的重要因素。但是造成胰岛素抵抗以及由此导致的肥胖，II型糖尿病等相关疾病的分子机制并不是很清楚。这就导致了其防治的困难。Egr-I基因普遍存在于从酵母到人的真核细胞基因组中，进化上高度保守。多种外界刺激都可促进Egr-I表达并使其活化，活化的Egr-I与靶基因启动子区上特异结合位点作用而调控不同靶基因的转录。目前已证实多种行使各类功能的基因的转录需要Egr-I 参与，包括与细胞生长分化和细胞凋亡、炎性细胞趋化、免疫刺激等相关的多种基因。Egr-I 的生物学功能主要是通过激活或抑制这些靶基因的表达实现的。有研究表明，在前列腺癌组织中，转录因子Egr-I过表达，而且利用特定的反义寡核苷酸抑制Egr-I的表达，能够逆转前列腺癌细胞的转化。值得一提的是，已经有临床前研究利用针对Egr-I的反义寡核苷酸防止肺移植后形成炎症和血栓。另外，Egr-I在肺慢性阻塞性疾病(C0PD)、动脉粥样硬化、儿童哮喘、白血病等疾病中都有重要的调节作用。
发明内容
本发明的提供一种新的II型糖尿病相关疾病的药物靶点。本发明涉及人类基因功能，特别是涉及与II型糖尿病的Egr-I基因功能。检测II 型糖尿病病人脂肪组织以及相关动物体内实验证明了 Egr-I基因的高表达，通过建立胰岛素抵抗脂肪细胞的细胞模型进行进一步的研究，表明Egr-I在胰岛素抵抗的情况下受到胰岛素信号通路的调节。胰岛素长期刺激实验表明，正常脂肪细胞应答胰岛素这一过程是依赖于Egr-I的转录活性的，Egr-I的表达受到胰岛素的调控。本发明还通过构建了控制 Egr-I表达的相关腺病毒和Egr-I的干扰序列进行深入的探究，研究发现干扰Egr-I的表达可以缓解胰岛素抵抗，说明抑制Egr-I的表达能够增加胰岛素敏感性，防止胰岛素抵抗。因此Egr-I可以作为II型糖尿病相关疾病理想的药物靶点。因此，本发明在另一方面提供了 Egr-I拮抗剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途。在一个实施方案中，所述Egr-I拮抗剂增加胰岛素敏感性，防止胰岛素抵抗。在一个实施方案中，本发明的Egr-I拮抗剂是抑制Egr-I基因转录和/或翻译的拮抗剂，优选为针对Egr-I的siRNA。在一个实施方案中，所述siRNA靶向下列序列5’_U⑶ CCCAGGACAAUUGMAUUUGCU-3，(SEQ ID NO: 1)，并且所述 siRNA 的序列优选为 5，_AGCAAAUUUC AAUUGUCCUG GGAGA-3， (SEQ ID NO:2)。在另一个实施方案中，本发明的Egr-I拮抗剂是包含锌指结构域(Egr-Ι第 331-427位氨基酸)的显性无效Egr-I，优选为表达所述显性无效Egr-I的DNEgr-I腺病
图1显示了 14例II型糖尿病病人脂肪组织中Egr-I的表达水平。其中提取人组织标本RNA，并用实时荧光定量PCR检测基因表达。图2 A，含有大量脂滴的脂肪细胞，油红染色后脂肪细胞；B，胰岛素抵抗细胞IRS 的活性；C，胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取能力。图3 胰岛素抵抗细胞中Egr-I应答胰岛素刺激上调并调控细胞的葡糖摄取能力A，胰岛素抵抗细胞中Egr-I依然能应答胰岛素刺激而上调；B，在胰岛素抵抗细胞中过表达DN-Egr-I使细胞对葡糖的摄取得到显著恢复。图4显示了胰岛素长期刺激下Egr-I的表达与IRS活性的关系。正常3T3-L1 细胞以及脂肪细胞在不同时间点胰岛素的刺激下Egr-I以及^S活性的变化。图5显示了长期胰岛素刺激下Egr-I调控细胞葡糖摄取能力。过表达DnEgr-I 的正常3T3-L1前脂细胞(A)和脂肪细胞(B)在长期胰岛素刺激下的葡萄糖摄取实验。图6显示了 Egr-I RNAi有效的下调了小鼠体内的Egr-1 mRNA水平。灰色柱形图代表作为对照的糖尿病小鼠，黑色代表尾静脉注射Egr-I RNAi的糖尿病小鼠。图7 A图，db/db小鼠在喂食后血糖水平出现明显上升，在干扰Egr-I表达水平后，喂食后血糖水平的升高得到抑制。B图，GTT实验，糖尿病小鼠在GTT后血糖水平显著上升，干扰Egr-I后，血糖的升高被显著抑制。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。一般材料和方法
技术领域：
本发明以下实施例中使用了以下所列的材料和方法。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1 材料3T3-L1细胞系购自上海细胞所，胰岛素(诺和灵R)，地塞米松购自鼓楼医院， [3H]-D-Glucose购自中国同位素总公司，IBMX购自Sigma公司，抗_p_IRS (Tyr)抗体， 抗-IRS抗体，抗-Egr-I抗体购自Santa Cruz公司，胎牛血清购自PAA公司。抗_p_ERK 抗体，抗-ERK抗体购自(上海康城生物技术公司)反转录试剂盒Traverse-Ace以及荧光定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司。TNF-α细胞因子购自Sigma公司，油红染料购自南京生兴生物技术公司。抗-p-IRS(Ser308)，抗-p-IRS(Ser612)均购自 Cell signaling 公司，野生型及db/db小鼠(Bks)购自南京大学模式动物研究所，罗氏血糖仪，葡萄糖购自 Sigma公司。II型糖尿病病人组织标本由江苏省中医院提供。2细胞培养
前脂细胞(3T3-L1)培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的DMEM 培养基中，于37° C、5% C02浓度条件下的细胞培养箱中培养。3脂肪细胞以及胰岛素抵抗细胞的诱导
前脂细胞(3T3-L1)接种并长满后培养基换为含有10%胎牛血清，150nmol/L胰岛素， 250nmol/L地塞米松以及0. 5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的刺激液1，培养2天后，换为含有10%胎牛血清和150nmol/L胰岛素的培养基，再培养2天后，细胞换回正常的含10%胎牛血清的DMEM培养基，6天后即出现大量含有脂滴的脂肪细胞。3T3-L1前脂细胞在诱导为脂肪细胞后，用含有终浓度为5ng/ml的TNF-α细胞因子的DMEM培养基诱导3天，每M小时换液，3天后即为胰岛素抵抗脂肪细胞。4油红染色
将诱导好的脂肪细胞用PBS洗3遍，加入油红染料，吸干，10倍显微镜镜检。5葡萄糖摄取实验
每个细胞样本加入[3H]-D-Gluc0se使终浓度为200uCi/mmol/L，同时加入终浓度为 IOnm的胰岛素，3小时后，用冰预冷的PBS洗3遍，加入IOM KOH裂解细胞，用等体积无水乙醇沉淀葡萄糖过夜，IOOOOg离心10分钟，用无菌水200ul重悬沉淀，用闪烁计数器检测。6免疫印迹分析
细胞培养至可以进行蛋白抽提时，吸去培养基，用冰预冷的PBS洗两遍，加入300 μ 1 裂解缓冲液(50.0 mmol/L Tris, 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 1.0 mmol/L Na3V04, 2.0 mmol/L NaF, 100. 0 μ g/ml PMSF, 1.0 μ g/ml 亮肽酶素 (Ieupeptin),以及1. 0 μ g/ml抑肽酶)，冰浴30 min，期间每隔5分钟混勻一次，刮取细胞，12 000 g离心10分钟，收集上清。采用Bradford法测定蛋白质浓度。取50 μ g 的总蛋白进行SDS-PAGE胶电泳分离，按常规方法转印至PVDF膜上，一抗4°C孵育过夜， 抗-Egr-I (1 1000)，抗-p-IRS (Tyr) (1 500)，抗-IRS (1 500)，用 AP 标记的二抗与 NBT 和 BCIP 显色或者采用 BM chemi luminescence Western Blotting Kit(购自 Roche 公司)检测结果。7提取组织标本RNA
取Img组织标本，悬浮于Iml Trizol Gnvitrogen)，用组织勻浆器勻浆3_5分钟，加 1/5体积酚氯仿抽提蛋白，12000rpm，离心10分钟，抽取上清，加等体积的异丙醇，-20度， 20分钟沉淀RNA，12000rpm，离心10分钟，弃上清，沉淀溶于20ul DEPC (焦碳酸二乙脂)溶液，测定浓度。
8 反转录 PCR
通过Tranverse-Ace反转录试剂盒(Τ0Υ0Β0)，采用oligo-dT进行逆转录。取800ng 总RNA反转录合成单链cDNA，流程如下800ng总RNA，加入lmol/L Oligo dT引物lul， 补DEPC水至10ul。65° C，反应5 min后，迅速置于冰上，再加入反应缓冲液如1，IOmmol/ L dNTP 2 ul,20 U/ul 的 RNA 酶拮抗剂 11。在 37° C 反应 5 min 后，加入 Iul 10 U/ul 逆转录酶，42° C反应1 h后在90° C处理10 min。9实时荧光定量PCR
采用实时荧光定量PCR试剂盒(Τ0Υ0Β0)，具体体系如下
20 μ 1 体系，STOR(2*) :10μ 1，引物(上游)(10*) :2 μ 1，引物(下游)(10*) :2μ 1， cDNA模板2μ 1，加双蒸水至20 μ 1。egr-1实时定量PCR引物序列
egr-1 (鼠)正向5，-TCGGCTCCTTTCCTCACTCA-3，(SEQ ID N0:3) egr-1 (鼠)反向5’ - CTCATAGGGTTGTTCGCTCGG-3，(SEQ ID N0:4) egr-1 (人)正向5，- CAGCAGTCCCATTTACTCAG-3，(SEQ ID N0:5) egr-1 (人)反向5，- GACTGGTAGCTGGTATTG-3，(SEQ ID N0:6) 扩增条件
950C预变性5分钟，95°C变性15秒，60°C退火15秒，72°C延伸，收集荧光信号45秒，共 40个循环，数据分析。10糖耐量实验GTT
小鼠禁食12小时后，腹腔注射葡萄糖(1.8mg/g)，分别在不同时间点尾部取血，用血糖仪检测小鼠血液中葡萄糖含量。11摄食血糖实验
小鼠禁食12小时后，再喂食12小时，尾部取血，检测小鼠血液中葡萄糖含量。12 DNEgr-I腺病毒的构建
采用本领域公知的方法构建表达显性无效Egr-I的腺病毒。具体而言，利用PCR构建包含锌指结构域(Egr-1上第331-427位氨基酸)的显性无效Egr-1 (dominant negative Egr-I，DNEgr-I)，特异性扩增引物为 5，-CGCGGGATCCACACCCCCCCATGAACGCCCATATGCTTGC-3， (SEQ ID NO:7)(有义链)，和 5，-CGCGGGATCCTCTAGATTAGTCTGCTTTCTTGTCCTTCTGTCT-3， (反义链)(SEQ ID NO: 8)。将DNEgr-I的序列从原始质粒克隆到pAdTrack_CMV质粒，AdEasy System将这些pAdTrack-CMV质粒再重组到腺病毒中，即得到DNEgr-I腺病毒。该病毒能够表达Egr-I的锌指结构域，与野生型Egr-I蛋白竞争结合DNA启动子区，从而抑制细胞内 Egr-I的转录活性。13干扰序列的设计合成
siRNA 由 hvitrogen 公司设计以靶向下列序列Egr_l，5-UCUCCCAGGACAAUUGAAAUUUGC U-3 (SEQ ID N0:1)；乱序5-CCUACGCCACCAAUUUC⑶-3 (SEQ ID NO: 9) siEgr-1 靴向序列位于Egr-1基因的第二个外显子。实施例1
II型糖尿病病人脂肪组织中Egr-I表达量明显高于正常人
II型糖尿病病人组织标本由江苏省中医院提供。如图1显示，在14例II型糖尿病病人脂肪组织中Egr-I的mRNA的表达水平要显著高于正常人的对照组，表明Egr-I表达水平的变化可能在调控II型糖尿病中发挥了作用。我们在糖尿病小鼠、受胰岛素/葡萄糖刺激的糖尿病小鼠、高脂饮食3/6周的野生型小鼠上所做的动物实验也得到同样的结论。实施例2
胰岛素抵抗脂肪细胞模型的成功建立在正常脂肪细胞中，胰岛素信号受体底物IRS应答胰岛素会发生酪氨酸磷酸化，并激活下游胰岛素信号通路。在用TNF-α细胞因子诱导脂肪细胞3天后，我们采用免疫印迹的方法检测胰岛素信号通路中IRS的酪氨酸磷酸化水平的变化。图2-B、2-C所示结果表明诱导的胰岛素抵抗细胞模型成功建立。实施例3
胰岛素抵抗细胞中Egr-I应答胰岛素的刺激上调并调控细胞的葡糖摄取能力我们检测到胰岛素抵抗细胞中Egr-I的表达量在胰岛素刺激3小时后明显增加，如图 3-A所示，表明Egr-I在胰岛素抵抗的情况下仍然受到胰岛素信号通路的调节。DNEgr-I病毒能够表达Egr-I的锌指结构域，与野生型Egr-I蛋白竞争结合 DNA启动子区，从而抑制细胞内Egr-I的转录活性。我们将构建好的DNEgr-I病毒感染胰岛素抵抗细胞48小时。如图3-B所示，实验结果表明，Egr-I在调控细胞胰岛素抵抗的过程中具有重要作用，抑制Egr-I的转录活性后能提高细胞对胰岛素的敏感性。实施例4
长期胰岛素刺激下Egr-I调控细胞的葡糖摄取能力
图4结果显示在长期胰岛素刺激下，正常脂肪细胞开始出现胰岛素抵抗现象，而在这一过程中，Egr-I的表达受到到胰岛素的调控，同时Egr-I的表达伴随着^S的活性降低。 图5结果说明，长期胰岛素刺激下，正常脂肪细胞应答胰岛素的能力出现显著下降，而这一过程是受到Egr-I调控的。实施例5
Egr-I干扰序列的设计合成成功
通过尾静脉注射Egr-I RNAi，显著下调了 db/db小鼠肝脏Egr-I的mRNA水平(如图 6所示)。这表明Egr-I干扰序列成功干扰了 Egr-I的表达。实施例6
干扰Egr-I能够提高糖尿病小鼠的胰岛素敏感性，有助于缓解II型糖尿病病情如图7所示，喂食后Egr-I干扰db/db小鼠组的血糖水平较对照组组db/db小鼠的血糖水平明显得到抑制，同样，GTT实验的数据也显示，Egr-I干扰组db/db小鼠对血糖水平的控制要显著好于对照组db/db小鼠。这些结果说明，干扰Egr-I表达增强了脂肪细胞的胰岛素敏感性，对胰岛素抵抗具有缓解作用，因此，Egr-I可以作为临床治疗II型糖尿病和胰岛素抵抗有效的潜在靶标。
权利要求
1.以Egr-I为靶点的拮抗剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述Egr-I拮抗剂增加胰岛素敏感性，防止胰岛素抵抗。
3.权利要求1或2的用途，其中所述的Egr-I拮抗剂抑制Egr-I基因转录和/或翻译。
4.权利要求3的用途，其中所述Egr-I拮抗剂包括针对Egr-I的siRNA。
5.5.权利要求4的用途，其中所述siRNA靶向下列序列5’-UCUCCCAGGACAAUUGAAAUUU GCU-3，。
6.权利要求5的用途，其中所述siRNA的序列为5’ -AGCAAAUUUCAAUU⑶CCUG GGAGA-3’。
7.权利要求3的用途，其中所述Egr-I拮抗剂包括包含Egr-I第331-427位氨基酸的锌指结构域的显性无效Egr-I。
8.权利要求7的用途，其中所述Egr-I拮抗剂是表达所述显性无效Egr-I的DNEgr-I 腺病毒。
全文摘要
本发明提供了Egr-1作为治疗Ⅱ型糖尿病靶标的应用，尤其是提供了Egr-1拮抗剂在制备治疗Ⅱ型糖尿病的药物中的用途。本发明的Egr-1拮抗剂能增加胰岛素敏感性，防止胰岛素抵抗。本发明的Egr-1拮抗剂是能够抑制Egr-1基因转录和/或翻译的拮抗剂，其中优选为siRNA或显性无效Egr-1。
文档编号A61K48/00GK102552938SQ20121007910
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者李朝军, 沈宁, 罗欧阳, 薛斌, 郁晓 申请人:南京大学