专利名称：一种贯众提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药的提取物，具体地说是一种贵州中草药贯众的提取物，同时还涉及贯众的提取物的制备方法和应用。
背景技术：
人体衰老与恶性肿瘤的发生均于人体细胞中过量的自由基，特别是与活性氧自由基有关。人体每个细胞的DNA每天都要受到104次氧化攻击 而引起损伤。自由基摧毁细胞膜，使细胞不能吐故纳新，并丧失了对细菌和病毒的抵御能力；自由基攻击正在复制中的基因，造成基因突变，诱发癌症的发生。而癌症的发病率以每年在3%到5%的速度在提高，以癌症引起的死亡率已经成为世界第一的死亡率。因此，寻找有效的抗癌抗氧化的药物仍是全球性的严峻课题。发明人一直从事中草药有效成分的提取分离及活性研究，特别重视抗癌和抗氧化发面的药物的有效成分的提取及活性研究，发明人研究发现贯众提取物具有抗癌和和抗氧化的作用。贯众为鳞毛蕨科植物贯众属植物的干燥根茎及叶柄残基，附生林下，产于贵州、云南、四川、西藏等。其味苦、微寒，有小毒，归肝，胃经，具有清热解毒、驱虫等功能。现代药理研究表明，具有抗病毒、驱虫、抗肿瘤、兴奋子宫等作用，临床用于治疗肺炎、乙型肝炎、肠道寄生虫病、妇产科出血等。但在现有的中医中药资料中，尚未发现将贯众的提取物用于治疗癌症或具有抗癌和抗氧化作用的记载和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种贯众的提取物。同时，本发明的目的还在于提供一种贯众的提取物的制备方法。本发明的目的还在于提供一种贯众的提取物在制备抗癌和抗氧化药物方面的应用。为了实现上述目的，本发明一种贯众提取物及其制备方法和应用，其提取物是以中药贯众为原料，经乙醇浸提而得的一种贯众乙醇提取液，回收溶剂后得到乙醇总提取物，水分散后依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，回收乙酸乙酯和正丁醇溶剂后，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。将乙酸乙酯和正丁醇萃取物进行柱层析，得到16个粗分段。将贯众乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段进行抗癌抗氧化活性测试，测试结果表明，贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段均有较好的抗癌抗氧化的活性。本发明一种贯众提取物的制备方法，按以下步骤制备
(I)将干燥的贯众的块茎粉碎后，加入2-3倍原料和总量的80%的乙醇水溶液加热回流提取，第一次回流提取6小时，第二次回流提取3小时，第三次回流提取I小时，然后合并三次乙醇浸提液。(2)将三次合并的乙醇浸提液减压蒸馏，回收乙醇溶液，得到乙醇总提取物浸膏，将乙醇浸膏水分散，一次使用10升的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分别萃取3次。(3)将乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压蒸馏，回收溶剂，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。(4)将乙酸乙酯和正丁醇萃取物进行柱层析，得到16个粗分段。本发明一种贯众提取物的应用是指贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段用于制备抗癌药物方面的应用。本发明一种贯众提取物的应用是指贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段用于制备抗氧化药物方面的应用。将贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段使用DMSO溶解，阿霉素为阳性对照药，O. 1%的DMSO的培养基为阴性对照，使用MTT法，对人类前列腺癌细胞PC3，胃癌细胞BGC-823，乳腺癌细胞Bcap-37以及黑色肉瘤细胞A375体外抑制增殖的生物活性研究。研 究表明贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段对这四种癌细胞具有较好的抑制作用。将贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段使用无水乙醇溶解，维生素C为阳性对照药，无水乙醇为阴性对照，使用DPPH微孔板法测其抗氧化生物活性测试。测试结果表明贯众的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段具有较好的抗氧化生物活性，甚至高于维生素C的抗氧化能力
贯众属植物的主要化学成分主要是萜类、酚类、留体类化合物，因此为研究其主要抗癌抗氧化化学成分，本发明涉及使用气质联用的方法对活性较好的提取层进行化学成分分析。图I :山地贯众乙酸乙酯层化学成分分析。在保留时间15分钟和30分钟左右峰面积较多，由此可知在此保留时间的化合物主要是萜类和酚类化合物，因此萜类和酚类物质可能是此萃取层的主要活性成分。图2 :山地贯众正丁醇层化学成分分析。在保留时间30分钟左右峰面积最多，由此可知在此保留时间出现的化合物主要是萜类化合物，因此在此萃取层主要的活性物质是萜类成分。图3 :山地贯众分离段Fr. 3化学成分分析。在保留时间20分钟左右峰面积最多，由此可知在此保留时间出现的化合物主要是酚类化合物，因此在此萃取层主要的活性物质是酚类成分。图4 山地贯众分离段Fr. 5化学成分分析。在保留时间20分钟左右峰面积最多，可能原因是洗脱剂极性变化不大，酚类依然是此分离段的主要成分。图5 山地贯众分离段Fr. 6化学成分分析。在保留时间30分钟左右峰面积最多，由此可知在此保留时间出现的化合物主要是萜类化合物，因此在此萃取层主要的活性物质是萜类成分。图6 山地贯众分离段Fr. 12化学成分分析。在保留时间30分钟左右峰面积最多，可能原因是洗脱剂极性增强，萜类物质也逐渐增多。
具体实施例方式实施例I
称取干燥的贯众块茎15千克粉碎后，加入2-3倍原料和总量的80%的乙醇水溶液加热回流提取，第一次回流提取6小时，第二次回流提取3小时，第三次回流提取I小时，然后合并三次乙醇浸提液。将三次合并的乙醇浸提液减压蒸馏，回收乙醇溶液，得到乙醇总提取物浸膏。实施例2
将乙醇浸膏水分散，一次使用10升的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分别萃取3次。将
乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压蒸馏，回收溶剂，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。乙酸乙酯和正丁醇萃取均为褐色粘稠物质。实施例3
将贯众乙酸乙酯进行硅胶(200-300目)柱层析，石油醚乙酸乙酯(20:1-1:1)，点板跟踪，合并比移值(Rf值)相同的流段，总共得到10个粗分段(Fr. I-Fr. 10)。实施例4
将贯众乙酸乙酯进行MCI柱层析，以甲醇水为洗脱剂，洗脱剂由20%的甲醇水溶液到100%的甲醇溶液，点板跟踪，合并Rf值相同的流段，总共得到6个粗分段(Fr. Il-Fr. 16)。实施例5
本实例为提取物的抗癌生物活性的测试实验 方法噻唑蓝(MTT)比色法
原理MTT 全称为 3-(4，5-Dimethylthiazol_2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，汉语化学名为3- (4，5-二甲基噻唑_2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝。MTT法，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT是一种接受氢离子的黄色染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色可溶性MTT还原为蓝紫色不溶性甲臢结晶。甲臢结晶的生成量与活细胞数目成正比，而死细胞无此功能。二甲基亚砜、SDS可溶解该结晶，利用酶标仪测定595 nm处的吸光度，可以间接反映活细胞的数量。在一定的细胞范围之内，MTT形成的结晶物的数量与细胞数成正比。仪器倒置生物显微镜XDS-IB (重庆光电仪器有限公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，96孔板酶标仪BI0-RAD680(美国BIO-RAD公司)，96孔板，以及各种规格的移液器
坐寸ο试剂胎牛血清(天津市灏阳生物制品科技有限公司)，胰蛋白酶(美国SIGMA公司)，RPMI 1640培养基(美国GIBICO公司)，MTT (北京鼎国生物技术发展有限公司)，SDS (北京鼎国生物技术发展有限公司)，二甲基亚砜(北京鼎国生物技术发展有限公司)。细胞培养PC3、BGC-823、Bcap-37和A375细胞均为贴壁细胞，用含10 %胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基用含在37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况，记录细胞生长状态。2天换一次培养液，当贴壁细胞铺满瓶底80%以上时，传代培养。传代培养步骤吸除培养瓶内废弃培养基，向瓶内加入无血清培养基洗一次，吸除无血清培养基，向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液O. 5 mL,置培养箱中大约2分钟，在倒置显微镜下观察，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入有血清培养基终止消化，用吸管吸取有血清培养基轻轻反复吹打瓶壁细胞，连续吹打直至细胞完全从瓶壁上脱落，形成单细胞悬液。用吸管吸出单细胞悬液，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，加入新的培养基，置于37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞为实验对象。实验方法取对数生长期细胞，用O. 25%胰蛋白酶消化后，重悬于含10 %FBS的RPMI 1640的培养基中，以2 X IO4个/mL的终浓度接种于96孔培养板上，每孔100 L，置于37 °C、5 % CO2的饱和湿度培养箱中培养。24小时后吸掉培养基，加入含不同浓度药物的有血清培养基，每孔200 L。放入培养箱培养72小时后吸掉含药培养基，加入浓度为O. 5mg/mL的MTT，每孔100 L，培养4小时后每孔再补加100 L 10%的SDS，放入培养箱10小时，使结晶充分溶解后取出，冷却至室温，在595 nm波长下测OD值，计算抑制率。实验中同时设空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。空白对照组不加细胞只加有血清RPMI1640培养基，阴性对照组加入与药物同体积的DMS0，阳性对照组加入与被测药物同浓度的ADM。实验结果以SPSS 13. O软件进行方差分析，P〈0. 05时为差异显著，P〈0. 01时为差 异极显著。细胞增殖的抑制率计算公式如下
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表I供试石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物在设定浓度下对癌细胞的体外增殖抑制活
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表2供试粗分段在浓度为100 μ g/ml下对癌细胞的体外增殖抑制活性
权利要求
1.一种贯众提取物其特征是提取物是以中药贯众的块茎为原料经乙醇浸提并经减压蒸馏而得到乙醇总提取物浸膏，乙醇总提取物浸膏水溶液依次分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压蒸馏回收溶剂后得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物，为褐色粘稠物质，再分别将乙酸乙酯和正丁醇萃取物使用柱层析进行粗分，得到粗分段，使用噻唑蓝(MTT)比色法以及1，I-二苯基-2-苦肼基[DPPH]微孔板法对萃取物和粗分段进行活性测试，测试结果表明乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段都表现出较好的抗癌以及抗氧化的活性。
2.根据权利要求I所述的一种贯众提取物及其制备方法，其特征在于按以下步骤制备 (1)将干燥的贯众的块茎粉碎后，加入2-3倍原料和总量的80%的乙醇水溶液加热回流提取，第一次回流提取6小时，第二次回流提取3小时，第三次回流提取I小时，然后合并三次乙醇浸提液 (2)将三次合并的乙醇浸提液减压蒸馏，回收乙醇溶液，得到乙醇总提取物浸膏，将乙醇浸膏水分散，一次使用10升的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分别萃取3次 (3)将乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压蒸馏，回收溶剂，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物 (4)将乙酸乙酯和正丁醇萃取物进行柱层析，得到16个粗分段。
3.根据权利要求I所述将乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及16个粗分段，分别使用MTT法进行抗癌生物活性测试和使用DPPH微孔板法进行抗氧化活性测试，测试表明，贯众乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段具有较好的抗癌和抗氧化的生物活性，以此可用于制备抗癌和抗氧化方面药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种贯众提取物及其制备方法和应用，设计一种中草药提取物，是以贵州中草药贯众块茎为原料，经乙醇浸提而得到乙醇总提取物，乙醇总提取物水溶液依次分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压蒸馏回收溶剂后得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物，再分别将乙酸乙酯和正丁醇萃取物使用柱层析进行粗分，得到粗分段。乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段都表现出抗癌以及抗氧化的特性。可用于制备抗癌以及抗氧化的药物。
文档编号A61P35/00GK102861109SQ20121040494
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者杨松, 杨胜杰, 薛伟, 胡德禹, 刘明川, 梁娜, 刘敏洁, 赵洪菊, 龚华玉 申请人:贵州大学