结合b7-h1和pd-1的抗体和其他分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及能够与B7-H1或PD-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1或B7-DC与PD-1结合的能力或能够影响B7-H1或PD-1的信号传导活性。本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。
【专利说明】结合B7-H1和PD-1的抗体和其他分子
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求美国专利申请号61/477,414 (2011年4月20日提交；处理中)的优先权,通过引用将该申请整体并入本文。
[0003]序列表的引用
[0004]本申请根据37C.F.R.1.821et seq.包括一个或多个序列表，其以纸质和计算机可读介质两种形式被公开，并通过引用将该纸质和计算机可读公开形式整体并入本文。
[0005]发明背景
发明领域
[0006]本发明涉及能够与B7-H1或Η)-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1或B7-DC与Η)-1结合的能力或能够影响B7-H1或ro-1的信号传导活性。本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。
[0007]相关领域的描述
[0008]A.细胞介导的免疫应答
[0009]人类和其他哺乳动物的免疫系统负责提供抗感染和疾病的保护。此保护由体液免疫应答和细胞介导的免疫应答二者提供。体液应答导致能够识别并中和外来靶标(抗原)的抗体和其他生物分子的产生。相比之下，细胞介导的免疫应答包括通过T细胞活化巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和抗原特异性细胞毒性T-淋巴细胞，和响应于抗原识别释放多种细胞因子(Dong, C.等人(2003) “Immune Regulation by Novel CostimulatoryMolecules, ” Immunolog.Res.28 (I): 39-48)。
[0010]T细胞最佳介导针对抗原的免疫应答的能力要求两种不同的信号传导互作(Viglietta, V.等人(2007) “Modulating Co-Stimulation, ”Neurotherapeutics 4:666-675 ；Korman, A.J.等人(2007) “Checkpoint Blockade in CancerImmunotherapy, ” Adv.1mmunol.90:297-339)。第一，已排列在抗原呈递细胞(APC)表面的抗原必须被呈递至抗原特异性的幼稚⑶4+T细胞。此呈递通过T细胞受体(TCR)递送指导T细胞启动将对所呈递的抗原特异性的免疫应答的信号。第二，通过APC和不同的T细胞表面分子之间的互作介导的一系列共刺激和抑制信号，触发了 T细胞的第一活化和增殖及最后它们的抑制。因此，第一信号给予免疫应答的特异性而第二信号则用来确定应答的性质、程度和持续时间。
[0011]免疫系统由共刺激和共抑制配体和受体严格控制。这些分子提供了用于T细胞活化的第二信号并提供了正信号和负信号的平衡网络以最大化抗感染的免疫应答同时限制对自身的免疫(Wang, L.等人(2011年 3 月 7 日)“VISTA’A Novel Mouse Ig SuperfamilyLigand That Negatively Regulates T Cell Responses, ^J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:1-16 ；Lepenies, B.等人(2008) “The Role Of Negative CostimulatorsDuring Parasitic Infections,，，Endocrine, Metabol ic&Immune Disorders-DrugTargets8:279-288) ο 抗原呈递细胞的 B7.1 (CD80)和 Β7.2 (CD86)配体和 CD4+T-淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体之间的结合特别重要(Shan^A.H.等人(2002) “TheB7_CD28Superfamily，”Nature Rev.1mmunol.2:116-126 ；Dong, C.等人(2003) “ImmuneRegulation by Novel Costimulatory Molecules, ”Immunolog.Res.28(I):39-48 ；Lindleyj P.S.等人(2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28_MediatedCostimulation, ” Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1 或 Β7.2 与 CD28 的结合剌激 T 细胞活化；Β7.1或Β7.2与CTLA-4的结合则抑制此活化(Dong，C.等人(2003) “ImmuneRegulation by Novel Costimulatory Molecules, ”Immunolog.Res.28 (I):39-48 ；Lindleyj P.S.等人(2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28_MediatedCostimulation，，，Immunol.Rev.229:307-321 ；Greenwald, R.J.等人(2005)“The B7FamilyRevisited, ”Ann.Rev.1mmunol.23:515-548)。CD28 在 T 细胞的表面组成型表达(Gross，J.，等人(1992) “Identification And Distribution Of The Costimulatory ReceptorCD28In The Mouse，” J.1mmunol.149:380-388)，而 CTLA4 的表达在 T 细胞活化之后被快速上调(Linsley，P.等人(1996) “Intracellular Trafficking Of CTLA4And FocalLocalization Towards Sites Of TCR Engagement，，，Immunity4:535-543)。由于 CTLA4 是较高亲和力的受体(Sharpe，Α.Η.等人(2002) “The B7_CD28Superfamily，” Nature Rev.1mmunol.2:116-126)，结合首先启动了 T细胞的增殖(经由⑶28)并随后抑制增殖(经由CTLA4的新生表达)，从而当增殖不再被需要时抑制该作用。
[0012]⑶28受体的配体的进一步的研究已导致一组B7相关的分子(“B7超家族”)的鉴定和表征(Coyle，A.J.等人(2001) “The Expanding B7Superfamily:1ncreasingComplexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function，，，NatureImmunol.2 (3): 203-209 ；Sharpe, A.H.等人(2002) “The B7_CD28Superfamily，，，NatureRev.1mmunol.2:116-126 ；Greenwald, R.J.等人(2005) “The B7Family Revisited，，，Ann.Rev.1mmunol.23:515-548 ；Collins,M.等人(2005)“The B7Family Of Immune-RegulatoryLigands，，，Genome Biol.6:223.1-223.7 ；Lokej P.等人(2004) “Emerging MechanismsOf Immune Regulation:The Extended B7Family And Regulatory T Cells.，’ArthritisRes.Ther.6:208-214 ；Korman, A.J.等人(2007) “Checkpoint Blockade in CancerImmunotherapy, ”Adv.1mmunol.90:297-339 ;Flies，D.B.等人(2007)“The NewB7s:Playinga Pivotal Role in Tumor Immunity,，’J.1mmunother.30(3): 251-260 ；Agarwalj A.等人(2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In TransplantationAnd Tolerance, ”Curr.0pin.0rgan Transplant.13:366-372 ；Lenschow,D.J.等人(1996) “CD28/B7System of T Cell Costimulation, ” Ann.Rev.1mmunol.14:233-258 ；Wang, S.等人(2004) uCo-Signaling Molecules Of The B7_CD28Family In PositiveAnd Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect.6:759-766)。目前具有家族的几个已知成员:B7.1 (⑶80)、B7.2 (⑶86)、可诱导的共剌激因子配体(IC0S-L)、程序性死亡-1配体(PD-L1 ;B7-H1)、程序性死亡_2配体(PD-L2 ;B7_DC)、B7-H3、B7-H4 和 B7-H6 (Collins，M.等人(2005) “The B7Family Of Immune-RegulatoryLigands，，，Genome Biol.6:223.1-223.7 ；Flajnik, M.F.等人(2012) “Evolution OfThe B7FamiIy: Co-Evolution Of B7H6And Nkp30，Identification Of A New B7FamilyMember, B7H7, And Of B7’s Historical Relationship With The MHC,，，Immunogeneticsepub do1.0rg/10.1007/s00251-012-0616_2)。
[0013]B.B7-H1/PD1 互作
[0014]1.B7-H1
[0015]B7-H1 (H)-L1，CD274)是B7超家族的特别重要的成员，由于其关键性地参与塑造对肿瘤的免疫应答(Flies, D.B.等人(2007) “The New B7s:Playing a Pivotal Role inTumor Immunity, ” J.1mmunother.30(3):251-260 ;美国专利号 6，803，192 ；7, 794，710 ;美国专利申请公布号 2005/0059051 ；2009/0055944 ；2009/0274666 ；2009/0313687 ；PCT 公布号TOO1/39722 ;W002/086083)。B7-H1是约33kDa的I型跨膜蛋白。已推测其在特定事件诸如妊娠、组织同种异体移植、自身免疫疾病和其他疾病状态诸如肝炎期间抑制免疫系统中发挥主要作用。
[0016]B7-H1在不同的人和小鼠组织，诸如在该两种物种的心脏、胎盘、肌肉、胎肝、脾、淋巴结和胸腺，和仅在小鼠中的肝、肺和肾中广泛表达(Martin-Orozco，N.等人(2007) “Inhibitory Costimulation And Ant1-Tumor Immunity,，，Semin.Cancer Biol.17⑷:288-298)。在人中，B7-H1蛋白表达已发现于人内皮细胞(Chen,Y.等人(2005) “Expression of B7_Hlin Inflammatory Renal TubularEpithelial Cel I s,，，Nephron.Exp.Nephrol.102: e8 l_e92 ; de Hai j, S.等人(2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-LAndB 7-H 1，，，Kidney Int.68:2091-2102 ；Mazanet,M.M.等人(2002) “B7_HlIsExpressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T Cell CytokineSynthesis, ” J.1mmunol.169:3581-3588)、心肌(Brown, J.A.等人(2003) “BlockadeOf Programmed Death-1Ligands On Dendritic Cells Enhances T Cell ActivationAnd Cytokine Production,，，J.1mmunol.170:1257-1266)、合胞滋养层(Petroff, M.G.等人(2002) “B7Family Molecules:Novel Immunomodulators At The Maternal-FetalInterface, ”Placenta23:S95-S101 )、一些组织的定居巨噬细胞，或在已用干扰素(IFN)-Y或肿瘤坏死因子(TNF)-a活化的巨噬细胞中(Latchman，Y.等人(2001) “H)-L2Is ASecond Ligand For PD-1And Inhibits T Cell Activation,，，Nat.1mmunol2:261-268)、和在肿瘤中(Dong, H.(2003) “B7-HI Pathway And Its Role In The Evasion Of TumorImmunity, ”J.Mol.Med.81:281-287)。在小鼠中，B7-H1蛋白表达发现于心脏内皮、胰腺的胰岛细胞、小肠和胎盘中(Martin-Orozco, N.等人(2007) “Inhibitory Costimulation AndAnt1-Tumor Immunity,，’Semin.Cancer Biol.17 (4): 288-298)。
[0017]2.PD-1
[0018]程序性死亡-1 (“ro-1”)是B7-H1和B7-DC的受体。Η)_1是T细胞调节因子的扩展的CD28/CTLA4家族的约31kD的I型跨膜蛋白成员(Ishida，Y.等人(1992) “InducedExpression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, UponProgrammed Cell Death, ”EMBO J.11:3887-3895 ;美国专利申请公布号 2007/0202100 ；2008/0311117 ；2009/00110667 ；美国专利号 6，808，710 ;7，101，550 ;7，488，802 ;.7，635，757 ;7，722，868 ；PCT 公布号 W001/14557)。与 CTLA4 相比，PD-1 更广泛地负调节免疫应答。[0019]PD-1在经活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达(Agata，Y.等人(1996) “Expression Of The PD-1Antigen On The Surface Of StimulatedMouse T And B Lymphocytes, Int.1mmunol.8 (5): 765-772 ；Yamazaki, T.等人(2002) “Expression Of Programmed DeathlLigands By Murine T Cells And APC，”J.1mmunol.169:5538-5545)并在天然杀伤(NK)T细胞中处于低水平(Nishimura，H.等人(2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive SelectionIn The Thymus Of PD-1-Deficient Mice，” J.Exp.Med.191:891-898 ;Martin_0rozco，N.等人(2007) “Inhibitory Costimulation And Ant1-Tumor Immunity，，，Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。 [0020]PD-1的胞外区由与CTLA4中等同的域具有23%同一性的单个免疫球蛋白(Ig)V 域组成(Martin-Orozco，N.等人(2007) “Inhibitory Costimulation AndAnt1-Tumor Immunity, ” Semin.Cancer Biol.17 (4): 288-298)。胞外 IgV 域之后是跨膜区和细胞内尾部(tail)。细胞内尾部包含位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)和基于免疫受体酪氨酸的转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)的两个憐酸化位点，其表明 PD-1 负调节 TCR 信号(Ishida，Y.等人(1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel MemberOf The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death，，，EMB0J.11:3887-3895 ;Blank，C.等人(2006 年 12 月 29 日电子出版)“Contribution Of ThePD-Ll/PD-lPathway To T-Cell Exhaustion:An Update On Implications For ChronicInfections And Tumor Evasion Cancer，，，Immunol.1mmunother.56 (5): 739-745)。
[0021]已报道了能够与鼠(murine) F1D-1免疫特异性结合的抗体(见，例如，Agataj T.等人(1996) “Expression Of The PD-1Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse TAnd B Lymphocytes,，，Int.1mmunol.8(5): 765-772)。
[0022]C.B7-H1 和 PD-1 的互作
[0023]已发现B7-H1和TO-?的互作向T细胞和B细胞提供重要的负的共剌激信号(Martin-Orozco，N.等人(2007) “Inhibitory Costimulation AndAnt1-Tumor Immunity, ” Semin.Cancer Biol.17(4): 288-298)并行使细胞死亡诱导因子的功能(Ishida，Y.等人(1992) “Induced Expression Of PD-1, A NovelMember Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed CellDeath，，，EMB0 J.11:3887-3895 ；Subudhij S.K.等人(2005) “The Balance Of ImmuneResponses:Costimulation Verse Coinhibition, ” J.Molec.Med.83:193-202)。
[0024]低浓度的TO-?受体和B7-H1配体之间的互作导致强烈抑制抗原特异性⑶8+T细胞的增殖的抑制信号的传递；在高浓度与ro-1的互作则不抑制T-细胞增殖但显著减少多种细胞因子的产生(Sharpe，A.H.等人(2002) “The B7_CD28Superfamily，”NatureRev.1mmunol.2:116-126)。已发现可溶性B7-Hl_Fc融合蛋白抑制T细胞增殖和由静息和先前被活化的CD4和CD8T细胞二者，和甚至来自脐带血的幼稚T细胞的细胞因子产生(Freeman，G.J.等人(2000) “Engagement Of The PD-1Immunoinhibitory ReceptorBy A Novel B7Family Member Leads To Negative Regulation Of LymphocyteActivation, ”J.Exp.Med.192:1-9 ；Latchmanj Y.等人(2001) “PD_L2Is A Second LigandFor PD-1And Inhibits T Cell Activation, Mature Immunol.2:261-268 ;Carter, L.等人(2002) “PD_1:PD_L inhibitory pathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells andis overcome by IL-2,，，Eur.J.1mmunol.32 (3): 634-643 ;Sharpe, A.H.等人(2002) “TheB7-CD28Superfamily, ” Nature Rev.Tmmunol.2:116-126)。
[0025]B7-H1-PD-1互作导致G0_G1中细胞周期停滞但不会增加细胞死亡(Latchman, Y.等人(2001) “PD_L2Is A Second Ligand For PD-1And Inhibits T CellActivation, Mature Tmmunol.2:261-268 ；Carter, L.等人(2002)“PD_1:PD_L inhibitorypathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is overcome by IL-2, ^ Eur.J.1mmunol.32(3):634-643)。因此，当抗原刺激是弱的或有限的时，B7-H1-PD-1复合具有拮抗B7-CD28信号的能力并在下调T细胞应答中发挥关键作用。 [0026]由B7-H1和TO-?介导的信号转导是复杂的。两种分子另外都与其他蛋白结合。B7-H1 能够与 B7-1 (CD80)结合(Butte，M.J.等人(2008) “Interactionof PD-Ll and B7-1, ’’Molecular Immunol.45:3567-3572) ;PD_1 能够与 B7-DC(PD-L2)结合(Χ?ζ?:τ-Μο1η?；，E.等人(2008) “Crystal Structure Of The ComplexBetween Programmed Death-1 (PD-1)And Its Ligand PD-L2, ^Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 105 (30): 10483-10488)。B7-1与CD28互作以递送在免疫应答的早期阶段中是重要的用于 T 细胞活化的共刺激信号(Elloso, Μ.M.等人(1999) “Expression and Contributionof B7-1(CD80)and B7-2(CD86)in the Early Immune Response to Leishmania majorInfection, ” J.1mmunol.162:6708-6715)。B7-DC 是 T 细胞的强的刺激因子，增强 T 细胞增殖和IFN-Y产生。然而，其通过其与ro-1的互作还呈现对免疫应答的抑制效应(Ishiwata, K.等人(2010 年 I 月 10 日电子出版)“Costimulator Responses Induced byNippostrongylus brasiliensis, ” J.Tmmunol.184:2086-2094)。微生物和肿瘤似乎利用TO-?和B7-H1以逃避被免疫系统清除。与TO-?和B7-H1互作的不同的受体和配体的结合亲和力的不同已被提出以提供疾病模型中ro-Ι和B7-H1的阻断的不同的功能结果(Butte，M.J.等人(2008) “Interaction of PD-Ll and B7-1, Molecular Immunol.45:3567-3572)。还暗示TO-?通路在慢性感染过程的免疫功能的损害(“T细胞耗竭(T cell exhaustion)”)中发挥关键作用，且阻断F1D-1功能能够恢复许多T细胞功能(Rodriquez-Garcia, Μ.等人(2010 年 11 月 19 日)“Expression Of PD-Ll And PD_L20n Human MacrophagesIs Up-Regulated By HIV-1And Differentially Modulated By IL-10, ”J.LeukocyteBiol.89:do1:10.1189/jib.0610327:1-9)。
[0027]B7-H1和TO-?在抑制T细胞活化和增殖中的作用已表明这些生物分子可能用作用于炎症和癌症治疗的治疗靶标。已提出使用抗-PDl抗体以治疗感染和肿瘤并上调适应性免疫应答(见，美国专利申请公布号2010/0040614 ；2010/0028330 ；2004/0241745 ；2008/0311117 ；2009/0217401 ;美国专利号 7，521，051 ;7，563，869 ;7，595，048 ；PCT 公布号W02004/056875 ;W02008/083174)。相反地，已表明调节 PD-1 与 B7-H1 互作的因子(agent)在上调或下调免疫应答中具有效用(见，美国专利号7，029，674 ;7，488，802 ;美国专利申请公布号 2007/0122378 ；2009/0076250 ；2009/0110667 ；2009/0263865 ；2009/0297518 ；PCT公布号W02006/133396)。同样，已提出使用抗-B7-H1抗体以治疗感染和肿瘤并上调适应性免疫应答(美国专利申请公布号2009/0055944 ；2009/0274666 ；2009/0317368 ;美国专利号6，803，192 ；7, 794，710 ；PCT 公布号 W001/39722 ；W002/086083)o
[0028]然而，尽管所有的此类进展，对能够调节B7-H1和TO-?之间的互作的组合物仍有需求。本发明涉及此类组合物和它们治疗癌症和其他疾病和病症的用途。[0029]发明概述
[0030]本发明涉及能够与B7-H1或TO-?免疫特异性结合的抗体和它们的抗原结合片段及其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1与ro-1结合的能力或能够影响B7-H1或ro-1的信号传导活性。本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。
[0031]详细地，本发明提供了包含与B7-H1或TO-?、且特别是人B7-H1或人Η)_1免疫特异性结合的抗体的抗原结合片段，优选以内源或转染的浓度在活细胞表面表达的分子。本发明特别涉及此分子的实施方案，其中抗原结合片段与Β7-Η1结合，且其中活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞或抗原呈递细胞，和此分子的实施方案，其中抗原结合片段与ro-1结合且其中活细胞是T细胞。
[0032]本发明涉及能够与B7-H1或TO-?免疫特异性结合的抗体和它们的抗原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1与ro-1结合的能力或能够影响B7-H1或ro-1的信号传导活性。本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。
[0033]详细地，本发明提供了包含与B7-H1或TO-?、且特别是人B7-H1或人H)_l免疫特异性结合的抗体的抗原结合片段，优选以内源或转染的浓度在活细胞表面表达的分子。本发明特别涉及此分子的实施方案，其中抗原结合片段与B7-H1结合，且其中活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞或抗原呈递细胞，和此分子的实施方案，其中抗原结合片段与ro-1结合且其中活细胞是T细胞。
[0034]本发明还涉及此类分子的实施方案，其中该分子是单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。本发明包括其中此类抗体是单特异性、双特异性、三特异性或多特异性的实施方案。
[0035]本发明还涉及与B7-H1结合的此类分子或抗体的实施方案，且其中其抗原结合片段包含6个CDR，其中CDR包含抗-B7-H1抗体1E12、1F4、2G11、3B6和3D10的CDR的至少一个共有CDR和选自以下的所有剩余CDR:
[0036](A)抗-B7-H1抗体1E12的三条轻链和三条重链CDR ；
[0037](B)抗-B7-H1抗体1F4的三条轻链和三条重链⑶R ；
[0038](C)抗-B7-H1抗体2G11的三条轻链和三条重链CDR ；
[0039](D)抗-B7-H1抗体3B6的三条轻链和三条重链CDR ;或
[0040](E)抗-B7-H1抗体3D10的三条轻链和三条重链CDR。
[0041]本发明还涉及与B7-H1结合的此类分子或抗体的实施方案，且其中其抗原结合片段包含6个⑶R，其中6个⑶R是:
[0042](A)抗-B7-H1抗体1E12的三条轻链和三条重链CDR ；
[0043](B)抗-B7-H1抗体1F4的三条轻链和三条重链⑶R ；
[0044](C)抗-B7-H1抗体2G11的三条轻链和三条重链⑶R ；
[0045](D)抗-B7-H1抗体3B6的三条轻链和三条重链CDR ;或[0046](E)抗-B7-H1抗体3D10的三条轻链和三条重链CDR。
[0047]本发明还涉及此类抗体的实施方案，其中抗体与B7-H1结合并包含抗体h3D10Varl, h3D10Var2、h3D10Var3、h3D10Var4、h3D10Var5、h3D10Var6、h3D10Var7、h3D10Var8、h3D10Var9、h3D10Varl0、h3D10Varll、h3D10Varl2、h3D10Varl3 或 h3D10Varl4
的可变域。
[0048]本发明还涉及以上描述的分子或抗体的实施方案，其中分子或抗体与ro-1结合，且其中抗原结合片段包含6个⑶R，其中⑶R包含抗-PD-1抗体1E3、1E8和1H3的⑶R的至少一个共有⑶R和选自以下的所有剩余⑶R:
[0049](A)抗-PD-1抗体1E3的三条轻链和三条重链⑶R ；
[0050](B)抗-PD-1抗体1E8的三条轻链和三条重链⑶R ;或
[0051](C)抗-PD-1抗体1H3的三条轻链和三条重链⑶R。
[0052]本发明还涉及此类抗体的实施方案，其中6个⑶R是:
[0053](A)抗-PD-1抗体1E3的三条轻链和三条重链⑶R ；
[0054](B)抗-PD-1抗体1E8的三条轻链和三条重链⑶R ;或
[0055](C)抗-PD-1抗体1H3的三条轻链和三条重链⑶R。
[0056]本发明还涉及此类抗体的实施方案,其中抗体与F1D-1结合并包含抗体hlH3Varl、hlH3Var2、hlH3Var3、hlH3Var4、hlH3Var5、hlH3Var6、hlH3Var7、hlH3Var8、hlH3Var9、hlH3Varl0、hlH3Varll、hlH3Varl2、hlH3Varl3 或 hlH3Varl4 的可变域。
[0057]本发明还涉及以上描述的分子或抗体的实施方案，其中分子或抗体被可检测地标记或包含缀合的毒素、药物、受体、酶、受体配体。
[0058]本发明还涉及以上所描述的分子或抗体的实施方案，其中该分子或抗体:
[0059](A)调节由B7-H1或Η)_1介导的信号转导；
[0060](B)减弱Β7-Η1与Β7-Η1受体结合的能力或减弱I3D-1与Η)_1配体结合的能力；
[0061](C)促进(agonize) Β7-Η1或TO-?介导的信号转导；
[0062](D)介导T细胞增殖；或
[0063](E)增强 IFN-Y 产生。
[0064]本发明还涉及包含治疗有效量的任何以上描述的分子或抗体和生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明还涉及此药物组合物在癌症、自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目或健康的疾病的治疗中的用途。本发明还涉及此药物组合物的用途，其中治疗是预防性的，并在癌症、自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目或健康的疾病的任何症状之前提供，或用于移植易发生的病症的治疗。
[0065]本发明还涉及任何以上描述的分子或抗体用于通过测定受试者的细胞关于它们与B7-H1或ro-1结合的能力，诊断受试者中的癌症、自身免疫疾病(特别是移植物抗宿主病)、传染病(特别是慢性病毒疾病)或影响T细胞数目或健康的疾病的用途。
[0066]本发明特别涉及此类分子、抗体和组合物的实施方案，其中B7-H1是人B7-H1且PD-1 是人 PD-1。
[0067]本发明特别涉及用于诊断受试者中疾病(特别是癌症)的方法，包括测定受试者的细胞关于它们与任何以上 描述B7-H1结合分子结合的能力，其中该方法提供了用于诊断受试者中疾病存在的细胞学分析。[0068]本发明另外涉及用于诊断受试者中疾病(特别是影响T细胞数目和/或健康的疾病)的方法，包括测定该受试者的细胞关于它们与ro-1结合分子结合的能力，其中该方法提供了用于诊断受试者中疾病的存在和/或进展、或用于评价受试者对治疗的响应的细胞学分析。
[0069]附图简述
[0070]图1显示所检测的与B7-H1结合的抗体的杂交瘤上清液的结合。阳性对照(PC):来自用于杂交瘤制备的小鼠的1:1000稀释的血清；阴性对照(NC):5%牛奶/PBS。显示关于与B7-H1-FC结合和用抗-小鼠IgG的检测的数据。
[0071]图2显示关于确定经分离的抗-B7-H1抗体是否能够调节B7-H1与H)_l结合的实验的结果。阳性对照:克隆MIH-1和29E.2A3 (两者都是抗_人⑶274 (B7-H1));两个阴性对照:来自不相关的杂交瘤(随机Ab)的条件培养基和载体对照(VC)。
[0072]图3显示所检测的抗-B7-H1抗体与CH0-hB7_Hl结合的中值荧光强度(MFI)。没有发现所检测的克隆与亲本CHO系交叉反应，显示所表达的抗体是人B7-H1免疫特异性的。
[0073]图4显示所选择的抗-人B7-H1抗体的表达人B7-H1的CHO细胞结合测定的中值荧光强度(MFI)结果。
[0074]图5比较了抗-人B7-H1抗体5H1和1E12的表达人B7-H1的CHO细胞结合测定的中值荧光强度(MFI)结果。
[0075]图6显示经分离的抗-人ro-1抗体的抗原结合和同种型。
[0076]图7A-7B显示表明几`种经分离的杂交瘤表达中和抗-人TO-?抗体的实验的结果。
[0077]图8显示所检测的抗-PD-1抗体与CHO-hro-Ι结合的中值荧光强度(MFI )。没有发现所检测的克隆与亲本CHO系交叉反应，显示所表达的抗体是人ro-1特异性的。
[0078]图9显示所选择的抗-人ro-1抗体的表达人ro-1的cho细胞结合测定的中值荧光强度(MFI )。阳性对照:EH12(从BioLegend商业可得的抗-人PD-1抗体);mIgGl:鼠IgG阴性对照。
[0079]图10显示不同浓度的抗-人ro-1抗体的基于细胞竞争试验的中值荧光强度(MFI)结果。
[0080]图11显示20 μ g/ml浓度的抗-人I3D-1抗体的基于细胞竞争试验的中值荧光强度(MFI)结果。
[0081]图12显示如下实验的结果:其中将用人全长ro-1转染的CHO细胞与饱和剂量的抗-人ro-Ι单克隆抗体(mAb)或对照Ig—起预孵育，然后用生物素标记的hB7-Hl-FC或hB7-DC mlg 染色。
[0082]图13，图A-B显示以下的比较结合:(A)商业可得的抗_PD_1抗体H112与(B)具有嵌合(“ch”)鼠抗-人I3D-1Fab区和人IgGlFc区的鼠单克隆抗体。
[0083]图14，图A-B显示本发明的抗-PD-1抗体对生物素化的B7-Hl_Fc和生物素化的B7-DC-Fc与TO-?结合发挥阻断效应的能力。
[0084]图15显示1H3抗-人H)_l嵌合抗体与CH0.hPD-Ι细胞的结合曲线，如通过抗_hlg抗体所检测的。
[0085]图16A-16B显示相对于阴性对照抗体(帕利珠单抗；SYNAGIS?，Medimmune, Inc.)，1H3抗-人Η)_1嵌合抗体与人的原代T细胞CD8+ (图16Α)及CD4+ (图16B)结合的能力的研究的结果。
[0086] 图17显示本发明的抗体增强抗原特异性T细胞应答的能力，如当破伤风毒素(TT)回忆(recall)时通过CFSE稀释所测量的。
[0087]图18A-18D 说明人源化的 1H3 变体(hlH3Varl_hlH3Varl4)与 CH0.hPDl 细胞结合的能力。
[0088]图19A-19B说明人源化的抗_PD_1抗体阻断hPD_l_Fc和表达B7-H1 (图19A)或B7-DC (图19B)的HEK293细胞之间的互作的能力。
[0089]图20 显示 hlH3Varl_hlH3Var6 的结合曲线。
[0090]发明详述
[0091]本发明涉及能够与B7-H1或TO-?免疫特异性结合的抗体和它们的抗原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1或B7-DC与TO-?结合的能力或能够影响B7-H1或ro-1的信号传导活性。本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的治疗中的用途。
[0092]将一个分子称为能够与第二分子“免疫特异性结合”，如果此结合呈现抗体与其相应的抗原的特异性和亲和力。将抗体称为能够与抗原(且尤其，抗原:B7-H1或ro-1)的靶区或构象(“表位”)“免疫特异性结合”，如果此结合涉及免疫球蛋白分子的抗原识别位点。与特定抗原免疫特异性结合的抗体可与其他抗原以较低的亲和力结合，如果该其他抗原具有被抗原识别位点识别的一些序列或构象相似性，如，例如，通过本领域已知的免疫测定、BIACORE?测定或其他测定所确定的，但将不会与完全不相关的抗原结合。然而，优选地，抗体(和它们的抗原结合片段)将不会与其他抗原交叉反应。凭借未被包含在抗原识别位点的分子的其他区/域中的结合域，诸如Fe区，抗体还可以以非免疫特异性的方式与其他分子诸如与FcR受体结合。
[0093]如本文所用的，术语“调节”涉及改变作用或结果的能力。特别地，本发明涉及能够调节B7-H1和ro-Ι之间的结合和/或调节作为B7-H1-PD-1结合的结果发生的信号转导的分子(特别是免疫特异性结合人B7-H1或人ro-1的抗体或它们的抗原结合片段)。此调节可导致B7-H1与ro-1结合的能力的减弱或完全阻断。在另外的实施方案中，此调节可减弱或完全中和B7-H1或ro-1介导信号转导的能力。在另外的实施方案中，此调节可通过以下增强或另外促进通过B7-H1或TO-?的信号转导:1)增强B7-H1和TO-1之间的互作并推动B7-H1-PD-1结合或ii)直接与B7-H1和TO-?结合并因此模拟内源配体的活性，等。在仍然另外的实施方案中，此调节可改变B7-H1和ro-1之间互作的性质以致改变所引起的信号转导的性质。例如，本发明的分子能够通过与B7-H1或ro-1结合改变此类分子与其他配体和受体结合的能力(例如，影响ro-Ι与B7-DC结合的能力或B7-H1与B7-1 (⑶80)结合的能力)并从而改变它们的整体活性。优选地，此调节将提供可测量的免疫系统活性至少10%的变化，更优选地，此活性至少50%的变化，或至少2倍、5倍、10倍，或仍然更优选地，此活性至少100倍的变化。
[0094]如本文所用的，术语“抗体”意图指具有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”意图将免疫球蛋白的此域与由抗体广泛共享的域(诸如抗体Fe域)区别。可变区包含其残基负责抗原结合的“高变区”。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，典型在轻链可变域中的约残基24-34 (LI),50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重链可变域中的约残基 27-35 (HO,50-65 (H2)和 95-102 (H3);Kabat 等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(即，轻链可变域中残基 26-32 (LI),50-52 (L2)和 91-96 (L3)和重链可变域中 26-32 (HI),53-55 (H2)和 96-101 (H3);Chothia, C.等人(1987) "Canonical Structures For The HypervariableRegions Of Immunoglobulins, 〃J.Mol.Biol.196:901-917)。“构架区”或“FR” 残基是除本文所定义的高变区残基之外的可变域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆骑化抗体(camelized antibodies)(见例如，Muyldermans 等人，2001, Trends Biochem.Sc1.26:230 ；Nuttall 等 Α? 2000, Cur.Pharm.Biotech.1:253 ；Reichmann 和 Muyldermans, 1999, J.Tmmunol.Meth.231:25 ;国际公布号冊94/04678和冊94/25591;美国专利号6，005，079)、单链卩￥ (scFv)(见，例如，seePluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg andMoore eds.Springer-Verlag, New York,第 269-315 页(1994))、单链抗体、二硫键连接的Fv (sdFv)、胞内抗体(intrabodies)和抗-独特型(抗_Id)抗体(包括,例如,本发明抗体的抗-1d和抗-抗-1d抗体)。特别地，此类抗体包括任何类型(例如，IgG, IgE, IgM, IgD,IgA和IgY)、类(例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
[0095]如本文所用的，术语抗体的“抗原结合片段”指的是包含抗体的互补决定区(“CDR”)和任选包含抗体的“可变区”抗原识别位点的构架残基，并呈现免疫特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个部分。此类片段包括Fab’、F(ab’)2、Fv、单链(ScFv)和其突变体、天然存在的变体和包含抗体“可变区”抗原识别位点和外源蛋白(例如，毒素、用于不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体，等)的融合蛋白。如本文所用的，术语“片段”指的是包含至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基或至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。
[0096]人的、嵌合的或人源化抗体是用于人的体内使用特别优选的，然而，可方便地采用鼠抗体(murine antibodies)或其他物种的抗体用于许多用途(例如,体外或原位检测分析、急性体内使用，等)。完全人抗体是用于人受试者治疗处理特别期望的。
[0097]可通过本领域已知的多种方法制备人抗体，包括以上描述的使用源自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法(见美国专利号4，444，887和4，716，111 ;和国际公布号 W098/46645、W098/50433、W098/24893、W098/16654、W096/34096、W096/33735 和W091/10741)。可使用不能够表达功能性内源免疫球蛋白、但能够表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备人抗体。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人重链和轻链基因之外，可将人可变区、恒定区和多变区(diversity region)引入小鼠胚胎干细胞。可单独地或与通过同源重组引入人免疫球蛋白位点(loci)同时地使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能。特别地，Jh区的纯合性缺失阻止了内源抗体的产生。扩增经修饰的胚胎干细胞并显微注射入胚泡以制备嵌合小鼠。随后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合的后代。用所选择的抗原，例如，本发明的多肽的整体或部分，使用常规方法免疫转基因小鼠。可使用常规杂交瘤技术从被免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体(见，例如，美国专利号5，916，771)。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并随后经受类别转换和体细胞突变。因此，使用此技术，制备治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体是可能的。关于用于制备人抗体的该技术的综述，见Lonberg和Huszar (1995, Int.Rev.Tmmunol.13:65-93,其通过引用整体并入本文)。关于用于制备人抗体和人单克隆抗体的该技术和用于制备此类抗体的操作说明的详细讨论，见，例如，国际公布号W098/24893、W096/34096、和W096/33735 ；和美国专利号 5，413，923、5，625，126、5，633，425、5，569，825、5，661，016、5，545，806、5，814，318和5，939，598，其通过引用整体并入本文。另外，可雇佣公司诸如Abgenix，Inc.(Freemont, CA)和Medarex (Princeton, NJ)以使用与以上描述相似的技术提供针对所选择的抗原的人抗体。[0098]“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分源自不同的免疫球蛋白分子的分子，诸如具有源自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。见例如，Morrison, 1985, Science229:1202 ；0i 等人，1986，BioTechniques4:214 ；Gillies 等人，1989，J.1mmunol.Methodsl25:191-202 ;和美国专利号 6，311，415、5，807, 715,4, 816，567和4，816，397。可使用本领域已知的多种技术，包括例如，CDR-移植(EP239, 400 ；国际公布号 W091/09967 ;和美国专利号 5，225，539、5，530，101和 5, 585, 089)、壤饰(veneering)或表面再塑(resurfacing) (EP592, 106 ；EP519, 596 ；Padlan, 1991, Molecular Immunology28(4/5):489-498 ；Studnicka 等人，1994，ProteinEngineering?: 805 ；和 Roguska 等人，1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:969)、和链改组(chain shuffling)(美国专利号5，565，332)制备包含来自非人物种的一个或多个CDR和来自人免疫球蛋白分子的构架区的嵌合抗体。
[0099]本发明特别涉及“人源化抗体”(见，例如，欧洲专利号EP239，400、EP592, 106和 EP519, 596 ;国际公布号 TO91/09967 和 TO93/17105 ;美国专利号 5，225，539、5，530，101,5,565，332,5,585，089,5,766，886 和 6，407，213 ；和 Padlan, 1991，MolecularImmunology28 (4/5): 489-498 ;Studnicka等人，1994，Protein Engineering? (6): 805-814 ；Roguska 等人，1994，PNAS91:969-973 ;Tan 等人，2002，J.1mmunol.169:1119-25 ;Caldas 等人，2000，Protein Eng.13: 353-60 ;Morea 等人，2000，Methods20: 267-79 ;Baca 等人，1997，J.Biol.Chem.272: 10678-84 ;Roguska 等人，1996，ProteinEng.9:895-904 ；Couto 等人，I"5, Cancer Res.55 (23Supp):5973s-5977s ；Couto 等人，1995，Cancer Res.55:1717-22 ；Sandhu,1994, Gene150:409-10 ；Pedersen 等人，1994，J.Mol.Biol.235:959-73 Jones 等人，1986，Nature321:522-525 ；Reichmann 等人，1988, Nature332:323-329 ;和 Presta, 1992，Curr.0ρ.Struct.Biol.2:593-596)。如本文所用的，术语“人源化抗体”指包含人构架区和来自非人(通常小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”且提供构架的人免疫球蛋白被称为“受体(acceptor)”。恒定区不需要存在，但如果它们存在的话，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即，至少约85%-90%相同、优选约95%相同或更多相同。因此，除了可能地CDR，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然的人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。人源化抗体是包含人源化的轻链和人源化的重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体将不包含典型的嵌合抗体，因为，例如，嵌合抗体的整个可变区是非人的。有人说通过“人源化(humanization)”过程“人源化(humanized)”供体抗体，因为所得人源化抗体期望与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体(recipient)抗体)，其中受体的高变区残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基所代替。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或在供体抗体中未被发现的残基。作出这些修饰以进一步改善抗体效能。通常，人源化的抗体将包含至少一个且典型两个可变域中的基本上所有可变域(substantially all of at least one, and typically two, variable domains),其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，典型地与Fe Y RIIB多肽免疫特异性结合、通过氨基酸残基取代、缺失或添加(即，突变)的引入被改变的人免疫球蛋白的一部分。
[0100]用于本发明方法的抗体可以是单特异性的。还感兴趣的是除了 B7-H1或ro-1之外与不同的靶标呈现特异性的双特异性抗体、三特异性抗体或更高的多特异性抗体。在优选的实施方案中，此类多特异性抗体将对不同的免疫细胞靶标呈现特异性。例如，此类抗体可与B7-H1和B7-DC 二者结合并因此调节二者的Η)_1依赖的应答。相反地，此类抗体可与PD-1和Β7-1结合并干扰二者的Β7-Η1依赖的应答。在另一个实施方案中，多特异性抗体与参与可选的免疫调节通路的分子(受体或配体)，诸如CTLA4、--Μ3、--Μ4、0X40、CD40、GITR、4-l-BB、B7-H4、LIGHT或LAG3结合以增强免疫调节作用。此外，多特异性抗体可与效应子分子诸如细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4TGF_P、IL-10、IL-17、IFNg、Flt3、BLys)和趋化因子(例如，CCL21)结合，其可以是用于调节急性和慢性免疫应答特别相关的。
[0101]另外，多特异性抗体可与对于将抗体靶向特定细胞类型或组织是重要的抗原结合。例如，与ro-Ι和⑶27 (或`B7-H1和⑶27) 二者结合的此类抗体可辅助共定位经活化的记忆B细胞(mBAet)和抗原呈递细胞(APC)以致通过此APC排列的TO-1可与mBAet B-细胞表面的配体互作以促进mBAc;t B-细胞的存活。由于mBArt B-细胞的丢失是HIV-感染致 AIDS 的进展中的促成事件(precipitating event) (Titanji, K.等人(2010) “AcuteDepletion Of Activated Memory B Cells Involves The PD-1Pathway In RapidlyProgressing SIV-1nfected Macaques, ” J.Clin.1nvest.120(11): 3878-3890)，结合 PD-1和CD27 二者的抗体在HIV感染的治疗中及在预防或推迟AIDS的发作中具有效用。如以上所讨论的，已暗示ro-1通路在慢性HIV感染过程中的免疫功能损害(“T细胞耗竭”)中发挥关键作用(Khaitan，A.等人(2011) “Revisiting Immune Exhaustion During HIVInfection，，，Curr.HIV/AIDS Rep.8:4-11 ；Rodri quez-Garcia, M.等人(2010 年 11 月19 日)“Expression Of PD-LlAnd PD_L20n Human Macrophages Is Up-Regulated ByHIV-1And Differentially Modulated By IL-10，”J.Leukocyte Biol.89:do1:10.1189/jib.0610327:1-9 ；Grabmeier-Pfistershammer, K.等人(2011) “Identification ofPD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-1nfectedPatients on Treatment,，，J Acquir.1mmune Defic.Syndr.56 (2): 118-124)。已显不巨噬细胞大大有助于HIV感染的起始步骤(Carter, C.A.等人(2008) “Cell Biology OfHIV-1Infection Of Macrophages,，，Ann.Rev.Microbiol.62:425-443 ;Noursadeghi, M.等人(2006)“HIV_lInfection Of Mononuclear Phagocytic Cells:The Case For BacterialInnate Immune Deficiency In AIDS,，，Lancet Infect.Dis.6:794-804)。因此，与 PD-1 和与巨噬细胞特异性标志物(诸如⑶14、⑶68、⑶163、TLR2等)结合的抗体(特别是如果与毒素缀合)在预防HIV感染中具有效用。另外，与T细胞耗竭的多个标志物(例如，PD-1和以下的任何一种或全部:CTLA4、HM3、I1M4或LAG-3)结合的抗体在免疫应答性的治疗或诊断中具有效用。其他感兴趣的靶标抗原包括癌细胞标志物。
[0102]另外，已发现ro-l+CD8+细胞具有抗-Hiv活性(Killian, M.S.等人(2011)“Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus TypelReplication IsMediated by Memory CD8+T Cells, ”J.Virol.85 (4): 1696-1705)。因此，与 PD-1 和 CD8 二者结合的抗体在例如，用于分离和制备用于在治疗患者的HIV感染和AIDS中最终使用的此类细胞的富集的群体的离体(ex vivo)方法中具有效用。
[0103]可用于此抗-PD-1或抗-B7-H1双特异性、三特异性或多特异性抗体的其他标志物包括 CD4、CD8、CD25 和 CTLA-4 (见，De Keersmaecker, B.等人(2011) ( “Fighting withthe Enemy’s ffeapons?The Role of Costimulatory Molecules in HIV,，，Curr.Mol ec.Med.566-5240/11:1-25 ;和Sarikonda, G.(2011)“Immunosuppressive Mechanisms DuringViral Infectious Diseases;’’Methods in Molec.Biol.677:431-447,通过引用将二者并入本文)。
[0104]类似地，尽管CD4T细胞是减慢结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的生长和传播所需的，PD-1介导的抑制也是预防CD4+T细胞促进严重疾病所需的(Barber, D.L.等人(2011) “CD4T Cells Promote Rather than Control Tuberculosis in theAbsence of PD-1-Mediated Inhibition,，，J.1mmunol.186:1598-1607 ;Sakai, S.等人(2010) uPD-1-PD-Llpathway impairs ThI immune response in the late stageof infection with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin, Intl.1mmunol.22(12):915-925 ；Lazar-Molnar,E.等人(2010) “ProgrammedDeath-1(PD-1)-Deficient Mice Are Extraordinarily Sensitive ToTuberculosis,，Troc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 107 (30): 13402-13407)。因此，与 CD4 和 PD-1二者结合的抗体在结核病的治疗中及在预防或推迟结核病的发作中具有效用。
[0105]编码用于优选的人受体构架序列的DNA序列包括但不限于来自人种系VH区段VH1-18和JH6和来自人种系VL区段VK-A26和JK4的FR区段。在特定的实施方案中，使用常规重组DNA技术将一个或多个CDR插入构架区内。该构架区可以是天然存在的或共有构架区，且优选地人构架区(见，例如，Chothia等人，1998，J.Mol.Biol.278:457-479关于人构架区的列表)。
[0106]本发明的人源化的或嵌合抗体可包含至少一个且典型两个可变域中的基本上所有可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的CDR区且所有或基本上所有的构架区为人免疫球蛋白共有序列的构架区。优选地，本发明的抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的 至少一部分，典型为人免疫球蛋白的至少部分。可选择本发明的抗体的恒定域用于抗体的所提出的功能，特别地可能所需要的效应子功能。在一些实施方案中，本发明的抗体的恒定域是(或包含)人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。在特定实施方案中，当本发明的人源化的抗体期望用于治疗用途时使用人IgG恒定域，特别是IgGl和IgG3同种型的恒定域并需要抗体效应子功能诸如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。例如，PD-1在T细胞和罕见的周围T细胞淋巴瘤诸如血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL)上高度表达。具有ADCC或CDC活性的抗-PD-1抗体作为用于治疗此类癌症的治疗剂特别重要。在可选的实施方案中，当本发明的抗体期望用于治疗目的时，使用IgG2和IgG4同种型并且不需要抗体效应子功能。例如，如果你希望通过靶向τ细胞表面的ro-1增加T细胞活性，那么将杀死T细胞的效应子功能可能是不合需要的。本发明包含Fe恒定域，所述Fe恒定域包含改变抗体效应子功能的一种或多种氨基酸修饰，诸如在美国专利申请公布号2005/0037000和2005/0064514中公开的那些。
[0107]在一些实施方案中，本发明的抗体包含轻链和重链的至少可变域二者。在其他实施方案中，本发明的抗体还可包含重链的CHl、铰链区、CH2、CH3和CH4区的一种或多种。抗体可选自包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE的免疫球蛋白的任何类和包括IgG1' IgG2, IgG3和IgG4的任何同种型。在一些实施方案中，恒定域是补体固定恒定域，其中抗体呈现细胞毒性活性是理想的，且类典型地是IgG115在其中此细胞毒性活性是不需要的其他实施方案中，恒定域可以是IgG2类的。本发明的抗体可包含来自不止一个类或同种型的序列，且选择特定的恒定域以优化期望的效应子功能在本领域普通技术人员能力之内。
[0108]人源化抗体的构架和⑶R区不需要精确对应亲本序列，例如，可通过至少一个残基的取代、插入或缺失诱变供体CDR或共有构架以致CDR或构架残基在那个位点处不对应共有或供体抗体。然而 ，此类突变优选不是大量的。通常，至少75%、更通常90%、且最优选大于95%的人源化抗体的残基将对应于亲本构架区(FR)和CDR序列的残基。可使用本领域已知的多种技术制备人源化的抗体，包括，但不限于CDR-移植(欧洲专利号EP239, 400 ;国际公布号W091/09967 ;和美国专利号5，225，539、5，530，101和5，585，089)、镶饰或表面再塑(欧洲专利号EP592, 106和EP519, 596 ；Padlan, 1991, Molecular Immunology28(4/5):489-498 ；Studnicka 等人，1994，ProteinEngineering? (6): 805-814 ；和 Roguska 等人，1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.91:969-973)、链改组(美国专利号5，565，332)和在例如美国专利号6，407，213,5, 766，886,5, 585，089，国际公布号 W09317105，Tan 等人，2002，J.1mmunol.169:1119-25，Caldas 等人，2000, Protein Eng.13:353-60，Morea 等人，2000, Methods20:267-79，Baca 等人，1997, J.Biol.Chem.272:10678-84, Roguska 等人，1996，Protein Eng.9:895-904, Couto 等人，1995, Cancer Res.55 (23Supp): 5973s-5977s, Couto 等人，1995，Cancer Res.55:1717-22 ;Sandhu, 1994，Gene 150: 409-10，Pedersen 等人，1994，J.Mol.Biol.235:959-73，Jones 等人，1986，Nature321:522-525, Reichmann 等人，1988，Nature332:323,和Presta, 1992，Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 中公开的技术。通常，将用来自 CDR 供体抗体的对应的残基取代构架区中的构架残基以改变、优选改进抗原结合。通过本领域众所周知的方法鉴定这些构架取代，例如，通过CDR和构架残基的互作的建模以鉴定对于抗原结合重要的构架残基和序列比较以鉴定特定位置处异常的构架残基(见，例如，Queen等人，美国专利号5，585,089 ;美国公布号2004/0049014和2003/0229208 ;美国专利号6，350，861 ;6，180，370 ;5，693，762 ;5，693，761 ;5，585，089 ;和 5，530，101 和 Riechmann 等人，1988, Nature332:323)。
[0109]可通过本领域已知的用于多肽的制备有用的任何方法制备本发明的抗体，例如，体外合成、重组DNA制备和类似的方法。优选地，通过重组DNA技术制备人源化抗体。可使用重组免疫球蛋白表达技术制备本发明的抗体。在美国专利号4，816，397(Boss等人)、美国专利号 6，331，415 和 4，816，567 (二者都属于 Cabilly 等人)、英国专利 GB2, 188，638 (Winter等人)和英国专利GB2，209，757中描述了免疫球蛋白分子包括人源化抗体的重组制备。用于免疫球蛋白包括人源化的免疫球蛋白的重组表达的技术，还可见于Goeddel等人，GeneExpression Technology Methods in Enzymology 第 185 卷 Academic Press(1991),和Borreback, Antibody Engineering, ff.H.Freeman (1992)。涉及重组抗体的产生、设计和表达的另外的信息可见于 Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego(1993)。 [0110]用于制备本发明的重组嵌合抗体的示例性的方法可包含以下:a)通过传统的分子生物学方法构建编码和表达抗体重链的表达载体，其中将鼠抗-B7-H1 (或抗-PD-1)单克隆抗体的CDR和可变区融合至源自人免疫球蛋白的Fe区，从而制备用于表达嵌合抗体重链的载体；b)通过传统的分子生物学方法构建编码和表达鼠抗-B7-H1 (或-PD-1)单克隆抗体的抗体轻链的表达载体，从而制备用于表达嵌合抗体轻链的载体；c)通过传统的分子生物学方法将表达载体转移至宿主细胞以制备用于表达嵌合抗体的经转染的宿主细胞；和d)通过传统的细胞培养技术培养经转染的细胞以便制备嵌合抗体。
[0111]用于制备本发明的重组人源化抗体的示例性方法可包含以下:a)通过传统的分子生物学方法构建编码和表达抗体重链的表达载体，其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变区构架的最小部分源自非人免疫球蛋白，诸如鼠抗-B7-H1 (或抗-PD-1)单克隆抗体，且抗体的剩余部分源自人免疫球蛋白，从而制备用于表达人源化抗体重链的载体；b)通过传统的分子生物学方法构建编码和表达抗体轻链的表达载体，其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变区构架的最小部分源自非人免疫球蛋白，诸如鼠抗-B7-H1 (或抗-PD-1)单克隆抗体，且抗体的剩余部分源自人免疫球蛋白，从而制备用于表达人源化抗体轻链的载体；c)通过传统的分子生物学方法将表达载体转移至宿主细胞以制备用于表达人源化抗体的经转染的宿主细胞；和d)通过传统的细胞培养技术培养经转染的细胞以便制备人源化的抗体。
[0112]关于任一示例性的方法，可用可包含不同的选择标记、但除了重链和轻链编码序列之外优选是相同的此类表达载体共转染宿主细胞。该方法提供用于等量表达重链和轻链多肽。可选地，可使用编码重链和轻链多肽二者的单个载体。用于重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA或二者。所使用的表达本发明的重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、或更优选地真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK-293细胞)。表达载体的选择取决于宿主细胞的选择，并可选择表达载体以便在所选择的宿主细胞中具有期望的表达和调节特征。可被使用的其他细胞系包括但不限于，CHO-KK NSO 和 PER.C6 (CrucelI, Leiden, Netherlands)。此外，当选择宿主细胞时可优化密码子使用以考虑物种特定的密码子使用偏好并增强蛋白表达。例如，关于CHO细胞表达，编码抗体的DNA可并入优先被中国仓鼠(Cricetulus griseus)(中国仓鼠卵巢细胞源自其)使用的密码子。可釆用密码子优化的方法以促进被期望宿主细胞的改进的表达(见，例如，Wohlgemuth，1.等人(2011) “Evolutionary OptimizationOf Speed And Accuracy Of Decoding On The Ribosome, Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sc1.366(1580):2979-2986 Jestin，J.L.等人(2009) “OptimizationModels And The Structure Of The Genetic Code，”J.Mol.Evol.69 (5):452-457 ;Bollenbachj T.等人(2007) “Evolution And Multilevel Optimization Of The GeneticCode，，，Genome Res.17 (4): 401-404 ;Kurland，C.G.等人(1984) “Optimization OfTranslation Accuracy, Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.31:191-219 ；Grosjean, H.等人(1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The OptimalCodon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In EfficientlyExpressed Genes, ”Genel8(3): 199-209)。
[0113]使用本领域技术人员众所周知的技术，任何以上描述的抗体可被用于产生抗-个体基因型抗体(见，例如，Greenspan, N.S.等人(1989) “ Idiotypes: Structure AndImmunogenicityinFASEB J.7:437-444 ;和 Nisinoff，A.(1991) “ Idiotypes: Concepts AndApplications, ” J.1mmunol.147(8):2429-2438)。
[0114]如果有需要，可通过筛选呈现此期望特征的变体以进一步改进任何以上抗体的结合特性。例如，可使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生此类抗体。在噬菌体展示方法中，可将功能抗体域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。在特定实施方案中，可利用此嗷菌体以展示抗原结合域，诸如从所有组成成分(repertoire)或组合抗体库(例如，人或鼠)表达的Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。可用抗原选择或鉴定表达结合感兴趣抗原的抗原结合域的噬菌体，例如，使用经标记的抗原或结合至或被捕获至固体表面或珠子的抗原。用于这些方法的噬菌体典型为丝状噬菌体，包括fd和M13。表达抗原结合域作为噬菌体基因III或基因VIII蛋白的重组融合蛋白。可被用于制造本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman，U.等人(1995) “Phage Display `Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments，，，J.1mmunol.Methods，182:41-50，1995 ;Ames，R.S.等人(1995)“Conversion Of Murine Fabs IsolatedFrom A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins,，’J.1mmunol.Methods, 184:177-186 ；Kettleborough, C.A.等人(1994) “Isolation OfTumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-AntibodyLibraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These AntibodyFragments, ”Eur.J.1mmunol.，24:952-958，1994 ；Persic, L 等人(1997) “An IntegratedVector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their FragmentsAfter Selection From Phage Display Libraries，，，Gene，187:9-18 ;Burton，D.R.等人(1994) “Human Antibodies From Combinatorial Libraries, ”Adv.1mmunol.57:191-280 ；PCT 公布 W092/001047 ；W090/02809 ；W091/10737 ；W092/01047 ；W092/18619 ；W093/11236 ；W095/15982 ；W095/20401 ;和美国专利号 5，698，426 ;5，223，409 ;5，403，484 ;5，580，717 ；5，427，908 ;5，750，753 ;5，821，047 ;5，571，698 ;5，427，908 ;5，516，637 ;5，780，225 ；5，658，727 ;5，733，743 和 5，969，108 中公开的那些。[0115]如以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，可分离并使用来自噬菌体的抗体编码区以产生全部抗体，包括人源化抗体或任何其他期望片段，并可在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如以下详细描述的。例如，使用本领域已知的方法还可采用重组制备Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术，诸如在PCT 公布 W092/22324 ;Mullinax，R.L.等人(1992) “Expression Of A HeterodimericFab Antibody Protein In One Cloning Step, ^BioTechniquesj 12(6):864-869 ；和Sawai 等人(1995) “Direct Production Of The Fab Fragment Derived From The SpermImmobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction And cDNA ExpressionVectors, ” Am.J.Reprod.1mmunol.34:26-34 ；和 Better, M.等人(1988) “Escherichiacoli Secretion Of An Active Chimeric Antibody Fragment，，，Science240:1041-1043中公开的那些。可被用于制备单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利号4，946，778 和 5，258，498 ;Huston，J.S.等人(1991) “Protein Engineering OfSingle-Chain Fv Analogs And Fusion Proteins, ” Methods in Enzymology203:46-88 ；Shuj L.等人，“Secretion Of A Single-Gene-Encoded Immunoglobulin FromMyeloma Cells，”Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA)90:7995-7999 ;和 Skerra.A.等人(1988) “Assembly Of A Functional Immunoglobulin Fv Fragment In Escherichiacoli, ” Science240:1038-1040 中描述的那些。
[0116]可将噬菌体展示技术用于增加本发明的抗体对于B7-H1和/或Η)-1的亲和力。该技术在获得可被用于本发明的组合方法的高亲和力抗体中将是有用的。被称为亲和力成熟的该技术釆用诱变或CDR步行(CDR walking)和使用此类受体或配体(或它们的胞外域)或其抗原片段的再选择以鉴定当与初始或亲本抗体相比时以较高的亲和力与抗原结合的抗体(见，例如，Glas er，S.M.等人(1992) “Antibody Engineering By Codon-BasedMutagenesis In A Filamentous Phage Vector System，，，J.1mmunol.149:3903-3913)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸导致氨基酸突变的半随机化的所有组成成分(sem1-randomized repertoire)。可构建由变体克隆的池组成的文库，每一个变体克隆根据单个CDR中的单个氨基酸变化而不同且包含代表每一个CDR残基的每一种可能的氨基酸取代的变体。可通过将被固定的突变体与经标记的抗原接触筛选具有对抗原的增加的结合亲和力的突变体。可将本领域已知的任何筛选方法用于鉴定具有对抗原增加的亲合力(avidity)的突变抗体(例如，ELISA)(见，例如，Wu，H.等人(1998) “StepwiseIn Vitro Affinity Maturation Of Vitaxinj An Alphav Beta3_Specific HumanizedMab，nProc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 95 (II):6037-6042 ；Yelton, D.E.等人(1995) “AffinityMaturation Of The BR96Ant1-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis，，，J.1mmunol.155:1994-2004)。如果可能，可使用随机化轻链的⑶R步行(见，Schier等人(1996) “Isolation Of Picomolar Affinity Ant1-C-Erbb-2Single-Chain Fv ByMolecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center OfThe Antibody Binding Site，”J.Mol.Biol.263:551-567)。
[0117]本发明因此涉及使用随机诱变与噬菌体展示的方法相结合以鉴定改进的CDR和/或可变区。噬菌体展示技术可以可选地被用于通过定向诱变(例如，亲和力成熟或“CDR-步行”)增加(或减弱)CDR亲和力。该技术使用靶标抗原或其抗原片段以鉴定具有当与初始或亲本抗体相比时以较高(或较低)亲和力与抗原结合的CDR的抗体(见，例如，Glaser, S.Μ.等人(1992)“Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A FilamentousPhage Vector System，” J.1mmunol.149:3903-3913)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸导致氨基酸突变的半随机化的所有组成成分。可构建由变体克隆的池组成的文库，每一个变体克隆根据单个CDR中的单个氨基酸变化而不同且包含代表每一个CDR残基的每一种可能的氨基酸取代的变体。可通过将被固定的突变体与经标记的抗原接触筛选具有对抗原的增加的(或减弱的)结合亲和力的突变体。可将本领域已知的任何筛选方法用于鉴定具有对抗原增加的(或减弱的)亲合力的突变抗体(例如，ELISA)(见，Wu，H.等人(1998) "StepwiseIn Vitro Affinity Maturation Of Vitaxinj An Alphav Beta3_Specific HumanizedMab，nProc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 95 (I I):6037-6042 ；Yelton, D.E.等人(1995) “AffinityMaturation Of The BR96Ant1-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis，，，J.1mmunol.155:1994-2004)。如果可能，可使用随机化轻链的⑶R步行(见，Schier等人(1996) “Isolation Of Picomolar Affinity Ant1-C-Erbb-2Single-Chain Fv ByMolecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center OfThe Antibody Binding Site，”J.Mol.Biol.263:551-567)。
[0118]用于实现此亲和力成熟的方法在例如:Krause，J.C.等人(2011) “An InsertionMutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances FunctionOf A Human Antibody，”MBi0.2 (I)pi1:e00345_10.do1:10.1128/mBi0.00345-10 ;Kuan,C.T.等人(2010) “Affinity-Matured Ant1-Glycoprotein NMB RecombinantImmunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas，，，Int.J.Cancerl0.1002/ijc.25645 ;Hackel，B.J.等人(2010) “Stability And CDR Composition Biases EnrichBinder Functionality Landscapes，，，J.Mol.Biol.401 (I):84-96 ；Montgomery, D.L.等人
(2009)“Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal AntibodyAgainst HIV-1 gp41，”MAbs I(5):462-474 ;Gustchina，E.等人(2009) “AffinityMaturation By Targeted D`iversification Of The CDR_H2Loop Of A Monoclonal FabDerived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed AgainstThe Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41Yields A Set Of Fabs With ImprovedHIV-1 Neutralization Potency And Breadth, ”Virology393(I):112-119 ；Finlay, W.J.等人(2009) “Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Ant1-RAGETherapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational PlasticityBoth Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions，，，J.Mol.Biol.388 (3): 541-558 ；Bostrom, J.等人(2009) “Improving Antibody Binding AffinityAnd Specificity For Therapeutic Development，，，Methods Mol.Biol.525:353-376 ；Steidlj S.等人(2008) “In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF AntibodiesBy Targeted CDR-Diversificationj ”Mol.1mmunol.46 (I): 135-144 ;和 Barderasj R.等人(2008)“Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling, Troc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 105(26):9029-9034 中被描述。
[0119]本发明特别涉及任何以上描述的抗体和它们的抗原结合片段的“衍生物”的制备和使用。术语“衍生物”指与抗原免疫特异性结合但相对于“亲本”(或野生型)分子包含一、二、三、四、五或更多个氨基酸取代、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。此氨基酸的取代或增加可引入天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。此类氨基酸可被糖基化(例如，具有改变了的甘露糖、2-N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-神经氨酸乙二醇(5-glycolneuraminic acid)等内容(content))、乙酰化、聚乙二醇化(pegylated)、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团、蛋白酶剪切、与细胞配体或其他蛋白连接衍生化，等。在一些实施方案中，改变了的碳水化合物修饰调节以下的一种或多种:抗体的溶解、促进抗体的亚细胞转运和分泌、促进抗体组装、构象完整和抗体介导的效应子功能。在特定的实施方案中，相对于缺少碳水化合物修饰的抗体，改变了的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子功能。导致改变了的抗体介导的效应子功能的碳水化合物修饰是本领域众所周知的(例如，见Shields, R.L.等人(2002) “Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked OligosaccharideImproves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent CellularToxicity”.J.Biol.Chem.277(30):26733-26740 ;Davies J.等人(2001) “ExpressionOf GnTIII In A Recombinant Anti_CD20CH0 Production Cell Line!Expression OfAntibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through HigherAffinity For FC Gamma RIII，，，Biotechnology&Bioengineering74(4):288-294)。 改变碳水化合物内容(carbohydrate content)的方法是本领域技术人员已知的，见，例如，S.C.等人(1988) iiGlycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody
Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen, J.Exp.Med.168 (3): 1099-1109 ;Tao，Μ.H.等人(1989) “Studies Of Aglycosylated ChimericMouse-Human IgG.Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector FunctionsMediated By The Human IgG Constant Region, ” J.1mmunol.143 (8):2595-2601 ；Routledgej E.G.等人(1995) “The Effect Of Aglycosylation On The ImmunogenicityOf A Humanized Therapeutic CD3Monoclonal Antibody，，，Transplantation60 (8): 847-53；Elliott, S.等人(2003) “Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo ActivitiesThrough Glyco engineering，，，Nature Bio techno 1.21:414-21 ； Shi elds, R.L.等人(2002) “Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves BindingTo Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity., J.Biol.Chem.277(30):26733-26740)。
[0120]在一些实施方案中，人源化的抗体是衍生物。此人源化的抗体包含一个或多个非人CDR中的氨基酸残基的取代、缺失或添加。当与非衍生物人源化的抗体相比时，人源化的抗体衍生物可基本上具有相同的结合、更好的结合、或更差的结合。在特定的实施方案中，CDR的一、二、三、四或五个氨基酸残基已被取代、缺失或添加(即，被突变)。
[0121]使用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于，特定的化学裂解、乙酰化、配制(formulation)、衣霉素的代谢合成等，可通过化学修饰来修饰衍生物抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体衍生物将具有与亲本抗体相似的或相同的功能。在另一个实施方案中，相对于亲本抗体，抗体衍生物将呈现被改变的活性。例如，相比于亲本抗体，衍生物抗体(或其片段)可以与其表位更紧密地结合或可以更耐受蛋白水解。
[0122]衍生化的抗体中的取代、添加或缺失可以在抗体的Fe区并可从而用来修饰抗体与一个或多个Fe Y R的结合亲和力。用于修饰抗体具有与一个或多个Fe Y R的经修饰的结合的方法是本领域已知的，见，例如，PCT公布号W004/029207、W004/029092、W004/028564、W099/58572、W099/51642、W098/23289、W089/07142、W088/07089 和美国专利号 5，843，597和5，642，821。在一些实施方案中，本发明包含具有对于活化的Fcy R，例如，FcyRIIIA的已被改变的亲和力的抗体。优选地，此类修饰还具有被改变的Fe介导的效应子功能。影响Fe介导的效应子功能的修饰是本领域众所周知的(见美国专利号6，194，551和W000/42072)。在一个特定的实施方案中，Fe区的修饰导致抗体具有被改变的抗体介导的效应子功能、与其他Fe受体(例如，Fe活化受体)的被改变的结合、被改变的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、被改变的Clq结合活性、被改变的补体依赖性的细胞毒性活性(⑶C )、吞噬活性或其任何组合。
[0123]衍生化的抗体可被用于改变哺乳动物、优选人中的亲本抗体的半衰期(例如，血清半衰期)。优选地，此改变将导致大于15天、优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月的半衰期。本发明的人源化的抗体或其片段在哺乳动物、优选人中增加的半衰期导致哺乳动物中所述抗体或抗体片段的较高的血清滴度，并因此减少所述抗体或抗体片段的施用频率和/或减少待被施用的所述抗体或抗体片段的浓度。可通过本领域技术人员已知的技术产生具有增加的体内半衰期的抗体或其片段。例如，可通过修饰(例如，取代、缺失或添加)经鉴定参与Fe域和FcRn受体之间互作的氨基酸残基产生具有增加的体内半衰期的抗体或其片段。可设计本发明的人源化的抗体以增加生物半衰期(见，例如，美国专利号6，277，375)。例如，可在Fe-铰链域中设计本发明的人源化的抗体以具有增加的体内或血清半衰期。
[0124]可通过将聚合物分子诸如高分子量的聚乙二醇(PEG)附着至所述抗体或抗体片段产生具有增加的体内半衰期的抗体或其片段。可通过PEG与所述抗体或抗体片段的N-或C-末端的位点特异性缀合或经由存在于赖氨酸残基上的氨基，用或不用多功能连接体将PEG附着至所述抗体 或抗体片段。将使用导致最小的生物活性损失的直链或支链聚合物衍生化。将通过SDS-PAGE和质谱紧密地监测缀合的程度以确保PEG分子与抗体的适当的缀合。可通过，例如，尺寸排阻或离子交换色谱法将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物(conjugates)分离。
[0125]还可通过Davis等人(见美国专利号4，179，337)描述的方法和偶联剂修饰本发明的抗体以提供可被注射入哺乳动物的循环系统的基本上不具有免疫原性应答的组合物。
[0126]本发明包含本发明的人源化的抗体的构架残基的修饰。可用来自CDR供体抗体的对应的残基取代构架区中的构架残基以改变、优选改进抗原结合。通过本领域众所周知的方法鉴定这些构架取代，例如，通过CDR和构架残基的互作的建模以鉴定对于抗原结合重要的构架残基和通过序列比较以鉴定特定位置处的异常构架残基(见，例如，美国专利号 5，585，089 ;和 Riechmann, L.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies ForTherapy, ” Nature332:323-327)。
[0127]本发明还包含与异源分子(即，不相关的分子)重组融合或化学缀合(包括共价地和非共价地两种缀合)的抗-人B7-H1和抗-人ro-1抗体(且更优选地，人源化抗体)和其抗原结合片段。该融合不一定是直接的，而是可通过连接体序列发生。
[0128]该融合融合蛋白的Fe部分可根据同种型或亚类而不同，可以是嵌合的或杂合的，和/或可以是被修饰的，例如以改进效应子功能、半衰期控制、组织可达性、增强生物物理表征诸如稳定性，并改进生产效率(和较少的成本)。在构建所公开的融合蛋白中有用的许多修饰和用于制造它们的方法是本领域已知的，见例如，Mueller, J.P.等人(1997) “Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With ChimericIgg2/G4Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine EndothelialCells,，，Mol.1mmun.34 (6): 441-452, Swann, P.G.(2008) “Considerations For TheDevelopment Of Therapeutic Monoclonal Antibodies, ^Curr.0pin.Tmmun.20:493-499(2008),和 Presta, L.G.(2008) “Molecular Engineering And Design Of TherapeuticAntibodies, ”Curr.0pin.Tmmun.20:460-470。在一些实施方案中，Fe 区是天然的 IgGl>IgG2或IgG4Fc区。在一些实施方案中，Fe区是杂合体，例如，由IgG2/IgG4Fc恒定区组成的嵌合体。Fe区的修饰包括但不限于，经修饰以防止与Fe Y受体和补体结合的IgG4、经修饰以改进与一个或多个Fe Y受体结合的IgGl、经修饰以最小化效应子功能(氨基酸变化)的IgGl、具有改变了的/不具有聚糖(典型通过改变表达宿主)的IgGl、和具有改变了的pH依赖的与FcRn的结合的IgGl。Fe区可包含整个铰链区或少于整个铰链区。 [0129]用用于非霍奇金淋巴瘤或Waldenstrom巨球蛋白血症的利妥昔单抗(抗⑶20的嵌合的小鼠/人IgGl单克隆抗体)治疗的患者中的治疗结果与具有对于人IgGl的Fe域的不同的内部亲和力的Fe Y受体的等位基因变体的个体表达相关。特别地，具有低亲和力活化Fe受体⑶16A (FcyRIIIA)的高亲和力等位基因的患者显示较高的应答率且，在非霍奇金淋巴瘤的病例中，改进了无进展存活期。在另一个实施方案中，Fe域可包含减少与低亲和力抑制性Fe受体CD32B (Fe y RIIB)结合并保持与低亲和力活化Fe受体CD16A (Fe y RIIIA)结合的野生型水平或增强与低亲和力活化Fe受体⑶16A (Fe Y RIIIA)的结合的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0130]另一个实施方案包含已减少与增加它们的半衰期的FcR结合的IgG2_4杂合体和IgG4突变体。代表性的IG2-4杂合体和IgG4突变体在Angal，S.等人(1993) “ASingle Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of ChimericMouse/Human (IgG4) Antibody, ”Molec.1mmunol.30 (I): 105-108 ；Mueller, J.P.等人(1997) “Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With ChimericIgG2/G4Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine EndothelialCells, ’lol.1mmun.34(6):441-452 ;和美国专利号6，982，323中描述。在一些实施方案中，IgGl和/或IgG2域被缺失，例如，Angal等人描述了丝氨酸241被脯氨酸取代的IgGl和IgG2。
[0131]在优选的实施方案中，Fe域包含增强与CD16A的结合的氨基酸插入、缺失或取代。增加与CD16A的结合并减少与CD32B的结合的人IgGl的Fe域中的大量的取代是本领域已知的并在 Stavenhagen, J.B.等人(2007) “Fe Optimization Of TherapeuticAntibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And ControlsTumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors, ” CancerRes.57(18):8882-8890中描述。具有与CD32B减少的结合和/或与CD16A增加的结合的人IgGlFc域的示例性变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可以以任何组合存在于人IgGlFc域中。在一个实施方案中，人IgGlFc域变体包含F243L、R929P和Y300L取代。在另一个实施方案中，人IgGlFc域变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一个实施方案中，人IgGlFc域变体包含N297Q取代，由于该突变破坏了 FcR结合。
[0132]在一个实施方案中，此类异源分子是具有至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、或至少100个氨基酸的多肽。此类异源分子可选地可以是酶、激素、细胞表面受体、药物部分，诸如:毒素(诸如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒A、假单胞菌外毒素(B卩，PE-40)、白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素或美洲商陆抗病毒蛋白)、蛋白(诸如肿瘤坏死因子、干扰素(例如，α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子、血小板衍化生长因子、组织型纤溶酶原激活因子或凋亡剂(例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子))、生物反应调节物(诸如，例如，淋巴因子(例如，白介素-1 (“IL-1”)、白介素-2 (“IL-2”)、白介素-6 (“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”))、或生长因子(例如，生长激素(“GH”))、细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或细胞自杀剂，诸如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(〖611(^081(16)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、单甲基auristatin F (MMAF)、单甲基auristatin E (MMAE ;例如,尼可占替诺)和嘌呤霉素和其类似物或同系物)、抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，双氯乙基甲胺、硫脲苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、BiCNU? (亚硝脲氮芥；BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和顺钼(II) (DDP)顺钼(cisplatin))、蒽环类抗生素(例如,柔红霉素(先前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(先前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))或抗有丝分裂因子(例如，长春新碱和长春花碱)。
[0133]用于将此治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的；见，例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies `For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，于 MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Reisfeld 等人(编者)，1985，第243-56 页，Alan R.Liss, Inc.) ;Hellstrom 等人，“Antibodies For Drug Delivery，，，于 CONTROLLED DRUG DELIVERY (第 2 版)，Robinson 等人(编者)，1987，第 623-53 页，Marcel Dekker, Inc.) ；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review”，于 MONOCLONAL ANTIBODIES ‘84:B10L0GICAL AND CLINICALAPPLICATIONS, Pinchera 等人(编者)，1985，第 475-506 页),Analysis, Results, AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy，，，于 M0N0CL0NALANTIB0DIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin 等人(编者)，1985,第 303-16 页，Academic Press ;Thorpe 等人(1982) “The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, ^Immunol.Rev.62:119-158 ；Carter, P.J.等人(2008) ^Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy,，，CancerJ.14 (3):154-169 ；Alley, S.C.等人(2010) ^Antibody-Drug Conjugates: TargetedDrug Delivery For Cancer, ^Curr.0pin.Chem.Biol.14(4):529-537 ；Carter, P.等人(2005) “Designer Antibody-Based Therapeutics For Oncology,，，Amer.Assoc.CancerRes.Educ.Book.2005 (I): 147-154 ；Carter, P.J.等人(2008) ^Antibody-Drug ConjugatesFor Cancer Therapy, ”Cancer J.14(3): 154-169 ；Chari, R.V.J.(2008) “Targeted CancerTherapy:Conferring Specificity To Cytotoxic Drugs, ^Acc.Chem Res.41(I):98-107 ；Doronina, S.0.等人(2003) “Development Of Potent Monoclonal Antibody AuristatinConjugates For Cancer Therapy,，，Nat.Biotechnol.21 (7): 778-784 ;Ducry, L.等人
(2010)“Antibody-Drug Conjugates:Linking Cytotoxic Payloads To MonoclonalAntibodies,，，Biocon jug Chem.21(1): 5-13 ；Senter, P.D.(2009) “Potent AntibodyDrug Conjugates For Cancer Therapy,，，Curr.0pin.Chem.Biol.13 (3): 235-244 ;和 Teicher, B.A.(2009) “Antibody-Drug Conjugate Targets,，，Curr Cancer DrugTargets.9(8):982-1004。
[0134]可将本发明的任何分子与标志物序列(marker sequences)诸如肽融合以便于纯化。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六-组氨酸肽，对应于源自流感血凝素蛋白的表位的血凝素 “HA” 标签(Wilson, 1.A.等人(1984) “The Structure Of An AntigenicDeterminant In A Protein,，，Cell, 37:767-778)和“flag，，标签(Knappik，A.等人(1994) “An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The DetectionAnd Purification Of Recombinant Antibody Fragments, ，T3iotechniquesl7(4):754-761)o
[0135]本发明还包含缀合至诊断或治疗剂或期望血清半衰期被增加的任何其他分子的抗体或它们的抗原结合片段。可诊断上使用(体内、原位或体外)抗体以，例如，监测疾病、疾患或感染的形成或进展作为临床检测过程的部分以，例如确定所给予的治疗方案的效果。通过将抗体偶联至可检测的物质可便于检测。可检测的物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属和非放射性顺磁金属离子。使用本领域已知的技术，可直接地或通过中间体(诸如，例如，本领域已知的连接体)间接地将可检测的物质偶联或缀合至抗体。见，例如，美国专利号4，741，900关于可被缀合至抗体用作根据本发明的诊断剂的金属离子。可通过将抗体偶联至可检测的物质实现此诊断和检测，所述可检测的物质包括但不限于，多种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物诸如但不限于链亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质诸如但不限于鲁米诺；生物发光物质诸如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质诸如但不限于铋(213Bi)、碳(14C )、铬(51Cr )、钴(57Co )、氟(18F )、钆(153Gd、159Gd )、镓(68Ga、67Ga )、锗(68Ge )、钦(166Ho )、铟(115In、113In、112In、mIn)、碘(1311、1251、1231、1211)、镧(14°La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钥(99Mo)、钯(1Q3Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(1Q5Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝("Tc)、铊(2Q1Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(9°Y)、锌(65Zn);使用多种正电子放射断层造影术的放射正电子的金属和非放射性顺磁金属离子。
[0136]可将本发明的分子缀合至第二抗体以形成抗体复共轭对缀合物(antibodyheteroconjugate),如由Segal在美国专利号4，676，980中所描述的。此类复共轭对缀合物抗体可另外与半抗原(诸如荧光素，等)、或与细胞标志物(例如，4-1-BB、B7-H4、⑶4、⑶8、CD14、CD25、CD27、CD40、CD68、CD163、CTLA4、GITR、LAG-3, 0X40、--Μ3、--Μ4、TLR2、LIGHT、
ICOS、B7-H3、B7-H7、B7-H7CR、CD70、CD47，等)或与细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4、TGF-3、IL-10、IL-17、I FN ν、Flt3、BLys)或趋化因子(例如，CCL21)等结合。
[0137]可将本发明的分子附着至固相支持体，其对于靶标抗原或能够与通过与本发明的抗体或抗原结合片段结合被固定在支持体上的靶标抗原结合的其他分子的免疫分析或纯化特别有用。此类固相支持体包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酸酯、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
[0138]本发明另外包括编码任何此类抗体、融合蛋白或片段的核酸分子(DNA或RNA)和能够传递或复制此核酸分子的载体分子(诸如质粒)。核酸可以是单链的、双链的，可包含单链和双链部分二者。
[0139]A.本发明优选的调节剂组合物
[0140]本发明特别涉及与B7-H1或与Η)-1免疫特异性结合和/或调节受试者中B7-H1与PD-1结合的能力的抗体。如本文所用的，“受试者”优选是哺乳动物诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类动物(例如，猴和人)，最优选地人。本发明因此特别涉及与人B7-H1或与人ro-Ι免疫特异性结合和调节人或人组织中(原位或离体)B7-H1与PD-1结合的能力的人源化抗体和其抗原结合片段。
[0141]最优选地，此类抗体和抗原结合片段将具有调节(特别当以内源浓度表达时且)排列在受试者的APC表面的B7-H1与(特别当以内源浓度表达时且)排列在此受试者的T细胞表面的ro-1的结合且反之亦然的能力的足够的亲合力。术语“内源浓度”指正常细胞、癌细胞或被感染的细胞中天然表达(即，不存在表达载体或重组启动子时)的内源分子的水平。
[0142]在一个实施方案中，此调节将包含抑制或以其他方式干扰此(优选内源表达并)排列的B7-H1和此(优选内源表达并)排列的ro-1的结合。在可选的实施方案中，此调节将包含增强或另外便于内源表达并排列的B7-H1和内源表达并排列的ro-1的结合。在又另一个实施方案中，此调节包括直接促进，据此抗-B7-H1或抗-PD-1的结合触发通过对应的受体的信号转导。
[0143](I)优选的抗-人B7-H1抗体和它们的⑶R
[0144]根据本发明，可通过筛选杂交瘤系以确定产生人B7-H1免疫特异性的抗体的那些杂交瘤系并随后任选地筛选此类系中关于呈现调节活性(例如，中和活性、促进活性、被改变的信号转导活性，等)的那些系制备此类分子。本发明特别提供了抗-人B7-H1克隆:1E12、1F4、2G11、3B6 和 3D10。
[0145]将由抗-人B7-H1克隆表达的抗体测序以显示它们的可变域。⑶R序列呈粗体和下划线显示:
[0146]抗-人B7-H1克隆 1E12
[0147]轻链可变区:
DIVMTQSHKL MSTSVGDRVS ITCKASQDVG fAVAWYQQKP GQSPKLLIYf
[0148]ASTROTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLADYFCQQ DSSYPLTFGA
GTKVELK (S EQ ID NO: I)
[0149]重链可变区:
【权利要求】
1.一种分子，所述分子包含与B7-H1或ro-1免疫特异性结合的抗体的抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的分子，其中所述被免疫特异性结合的B7-H1或Η)-1在活细胞的表面以内源或被转染的浓度表达。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分子，其中所述B7-H1是人B7-H1且所述TO-1是Apd-10
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分子，其中所述抗原结合片段与B7-H1结合，且其中所述活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞或抗原呈递细胞。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的分子，其中所述抗原结合片段与ro-1结合，且其中所述活细胞是T细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分子，其中所述分子是单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体是双特异性、三特异性或多特异性抗体。
8.根据权利要求3或4中任一项所述的分子、或根据权利要求6或7中任一项所述的抗体，其中分子或抗体与B7-H1结合，且其中所述其抗原结合片段包含6个CDR，其中所述CDR包含抗-B7-H1抗体1E12、1F4、2G11、3B6和3D10的CDR的至少一个共有CDR和选自以下的所有剩余的CDR: (A)抗-B7-H1抗体IE12的三条轻链和三条重链⑶R； (B)抗-B7-H1抗体1F4的三条轻链和三条重链⑶R； (C)抗-B7-H1抗体2G11的三条轻链和三条重链⑶R； (D)抗-B7-H1抗体3B6的三条轻链和三条重链⑶R;或 (E)抗-B7-H1抗体3D10的三条轻链和三条重链CDR。
9.根据权利要求8所述的分子或抗体，其中所述6个CDR是: (A)抗-B7-H1抗体IE12的三条轻链和三条重链⑶R； (B)抗-B7-H1抗体1F4的三条轻链和三条重链⑶R； (C)抗-B7-H1抗体2G11的三条轻链和三条重链⑶R； (D)抗-B7-H1抗体3B6的三条轻链和三条重链⑶R;或 (E)抗-B7-H1抗体3D10的三条轻链和三条重链CDR。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体与B7-H1结合并包含抗体 h3D10Varl、h3D10Var2、h3D10Var3、h3D10Var4, h3D10Var5、h3D10Var6、h3D10Var7、h3D10Var8、h3D10Var9、h3D10Varl0、h3D10Varll、h3D10Varl2、h3D10Varl3 或 h3D10Varl4的可变域。
11.根据权利要求3或5中任一项所述的分子、或根据权利要求6或7中任一项所述的抗体，其中分子或抗体与I3D-1结合，且其中所述抗原结合片段包含6个CDR，其中所述CDR包含抗-PD-1抗体1E3、1E8和1H3的⑶R的至少一个共有⑶R和选自以下的所有剩余的CDR: (A)抗-PD-1抗体1E3的三条轻链和三条重链⑶R； (B)抗-PD-1抗体1E8的三条轻链和三条重链⑶R;或 (C)抗-PD-1抗体1H3的三条轻链和三条重链⑶R。
12.根据权利要求11所述的分子或抗体，其中所述6个CDR是:(A)抗-PD-1抗体1E3的三条轻链和三条重链⑶R； (B)抗-PD-1抗体1E8的三条轻链和三条重链⑶R;或 (C)抗-PD-1抗体1H3的三条轻链和三条重链⑶R。
13.根据权利要求6、7、11或12中任一项所述的抗体，其中所述抗体与I3D-1结合并包含抗体 hlH3Varl、hlH3Var2、hlH3Var3、hlH3Var4、hlH3Var5、hlH3Var6、hlH3Var7、hlH3Var8、hlH3Var9、hlH3VarlO、hlH3VarlU hlH3Varl2、hlH3Varl3 或 hlH3Varl4 的可变域。
14.根据权利要求1-5、8-9、11-12中任一项所述的分子、或根据权利要求6_13中任一项所述的抗体，其中所述分子或抗体被可检测地标记或包含缀合的毒素、药物、受体、酶、受体配体。
15.根据权利要求1-5、8-9、11-12或14中任一项所述的分子、或根据权利要求6_14中任一项所述的抗体，其中所述分子或抗体: (A)调节由B7-H1或Η)-1介导的信号转导； (B)减弱B7-H1与B7-H1受体结合的能力或减弱I3D-1与PD-1配体结合的能力； (C)促进B7-H1或ro-1介导的信号转导； (D)介导T细胞增殖；或 (E)增强IFN-Y的产生。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求15所述的分子，和生理上可接受的载体或赋形剂。
17.根据权利要求16所述的药物组合物在癌症、自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目或健康的疾病的治疗中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗是预防性的，并在所述癌症、所述自身免疫疾病、所述传染病、或所述影响T细胞数目或健康的疾病的任何症状之前被提供。
19.根据权利要求1-5、8-9、11-12或14中任一项所述的分子、或根据权利要求6_14中任一项所述的抗体，用于通过测定受试者的细胞关于它们与B7-H1或ro-1结合的能力诊断所述受试者中的癌症、自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目和健康的疾病的用途。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的用途，其中: (A)所述传染病是慢性病毒疾病；或 (B)所述自身免疫疾病是移植物抗宿主病。
【文档编号】A61K39/395GK103608040SQ201280030691
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月20日
【发明者】索罗蒙·兰格曼, 琳达·刘, 沙浓·马沙尔, 胜·姚 申请人:安普利穆尼股份有限公司