专利名称：一种美洲大蠊提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种美洲大蠊提取物的制备方法。
背景技术：
美洲大蠊(Periplaneta americana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味:咸、寒；治:血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如:偷油婆、茶婆子、灶蚂子等。蜚蠊科(Blattidae)是一个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了 3.2亿年，与恐龙属同一时代出现的生物。无疑它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效。发明专利(专利号03117804.9) “美洲大蠊药用浸膏提取工艺”中用热水将美洲大蠊灭活后，采用80%乙醇回流提取、回收乙醇并进行油水分离，醇提后药渣加入适量水65 75°C温浸提取，药液浓缩后进行油水分离，合并醇提药液低于75°C真空浓缩成浸膏；发明专利(申请号200610021993.6) “美洲大蠊提取物、含该提取物的药物组合物及其制备方法”中美洲大蠊原料经石油醚脱脂后，采用水提醇沉法或醇提水沉法制备浸膏等。相关文献报道及相关发明专利中美洲大蠊提取物或成品色泽较深、腥臭味较重。某些患者使用过程中有抵触情绪，甚至出现恶心、呕吐等胃肠道不适的情况，导致不能继续治疗，延误病情。
发明内容
本发明所要解决的问题是:如何提供一种美洲大蠊提取物的制备方法，该制备方法能克服现有技术中所存在的缺陷，能显著改善美洲大蠊提取物性状，特别是解决了成品色泽深、腥臭味重的弊端，增强患者治疗过程中的依从性。并且本发明的美洲大蠊提取物在制备治疗创面修复的药物中有很好的疗效。一种美洲大蠊提取物，其特征在于该提取物的制备过程包括如下方法:
①.取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫，称取适量，加丙酮进行回流，得到脱脂原
料；
②.加水煎煮提取2 4次；
③.将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度1.02 1.25 (60°C测)，加入乙醇，静置，滤
过；
④.将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水，滤过或离心；
⑤.将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；⑥.将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦.将步骤⑥所得的流出液减压浓缩、干燥，粉碎。进一步，美洲大蠊提取物的制备方法具体包括如下步骤:
①.取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫，挑去杂质及非药用部位，称取精选的原料适量，加丙酮回流2-4次，每次加入2-5倍量，每次回流0.5-1.5小时得到脱脂原料，挥去丙酮；
②.加水煎煮提取2 4次，每次加入药材重量5 20倍体积的水，每次煎煮提取
0.5 2小时，滤过；
③.将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度1.02 1.25 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达55% 90%，在-5°C 25°C静置6 24小时，滤过；
④.将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于0.1 2克原生药，滤过或离心；
⑤.将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥.将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦.将步骤⑥所得的流出液70°C以下减压浓缩、干燥，粉碎。再进一步， 一种美洲大蠊提取物的制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤:
①.取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫，挑去杂质及非药用部位；称取步骤①精选的原料适量，加丙酮回流3次，每次加入8-12倍量，每次回流I小时得到脱脂原料，挥去丙酮；
②.加水煎煮提取2-4次，每次加入药材重量8-15倍体积的水，每次煎煮提取0.5 2小时，滤过；
③.将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度1.02 1.15 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达75% 85%，在(TC 15°C静置8 18小时，滤过；
④.将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于0.5 2克原生药，滤过或离心；
⑤.将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥.将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦.将步骤⑥所得的流出液70°C以下进行减压浓缩、干燥，粉碎。经过发明人研究，优选的制备方法为步骤③所述滤液浓缩至相对密度1.05 (60°C测)。优选的步骤⑤所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。优选的步骤⑥所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度为100 200目。本发明还提供了上述方法制备的美洲大蠊提取物。
本发明还提供一种美洲大蠊提取物在制备定向诱导间充质干细胞分化为表皮细胞的诱导液中的应用。上述美洲大蠊提取物可加入药学上可接受的辅料制成凝胶剂、涂膜剂、贴剂、片齐U、胶囊、软胶囊、口服液、滴丸、喷雾剂、颗粒剂或注射液等多种内服外用制剂。本发明的有益效果:采用本发明所得的美洲大蠊提取物水溶性良好、色泽浅、几乎无腥臭味，质量稳定可靠，患者依从性高，在治疗各种创面等方面具有很好的临床推广运用价值。
图1左上:CD29阳性表达率98.6±1.8% ;右上:CD34阳性表达率0.6±0.2% ;左下:CD44阳性表达率93.3±2.1% ;右下:CD90阳性表达率89.2±4.5%。
具体实施例方式下面结合实施例以及实验室数据对本发明作进一步描述: 实施例1
称取美洲大蠊鲜虫40kg，加丙酮加热回流4次，每次加入3倍量，每次回流I小时，挥去丙酮，加水煎煮提取3次，每次加入药材重量5倍体积的水，每次煎煮提取I小时，滤过；滤液70°C减压浓缩至相对密度1.08(60°C测)，加入乙醇至含醇量达75%，在0°C静置12小时，滤过；滤液常压回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于I克原生药，滤过；滤液通过DlOl型大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；所得的流出液70°C减压浓缩、干燥，粉碎，得浅黄色美洲大蠊提取物2.3公斤，无腥臭味。实施例2
称取美洲大蠊干虫30kg，加丙酮加热回流3次，每次加入4倍量，每次回流60分钟，挥去丙酮，加水煎煮提取3次，每次加入药材重量10倍体积的水，每次煎煮提取I小时，滤过；滤液75°C减压浓缩至相对密度1.05 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达80%，在4°C静置12小时，滤过；滤液减压回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于I克原生药，滤过；滤液通过HPD100型大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；所得的流出液75°C减压浓缩、干燥，粉碎，得浅黄色美洲大蠊提取物3.2公斤，无腥臭味。实施例3
称取用美洲大蠊干虫25kg加丙酮加热回流3次，每次加入3倍量，每次回流30分钟，挥去丙酮，加水煎煮提取2次，每次加入药材重量20倍体积的水，每次煎煮提取2小时，滤过；滤液68°C减压浓缩至相对密度1.25 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达55%，在25°C静置24小时，滤过；滤液减压回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于2克原生药，离心；上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；所得的流出液79°C减压浓缩、干燥，粉碎，得浅黄色美洲大蠊提取物2.8公斤，无腥臭味。实施例4称取用美洲大蠊干虫40kg，加丙酮加热回流3次，每次加入2倍量，每次回流40分钟，挥去丙酮，加水煎煮提取3次，每次加入药材重量12倍体积的水，每次煎煮提取0.5小时，滤过；滤液80°C减压浓缩至相对密度1.15 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达90%，在-5°C静置6小时，滤过；滤液减压回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于1.5克原生药，滤过；滤液通过HPD400型大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；所得的流出液65°C减压浓缩、干燥，粉碎，得浅黄色美洲大蠊提取物3.8公斤，无腥臭味。参比实施例1
将干燥的美洲大蠊粗碎，每IOOKg粗粉加300Kg水，浸泡0.5小时后，温度约在70°C，提取三次，第一次7小时；第二次加水200Kg，提取5小时；第三次加水200Kg，提取3小时；合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05^1.08 (70°C)时，加入浓度为93% w/w的乙醇，使成含醇量为40%，70°C保温搅拌20分钟，静置10小时，弃去上层油脂，下层药液过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.15^1.18 (70°C)，常压浓缩至水分< 25%的膏，即得含美洲大蠊提取物，备用。以下通过具体药效学实验证明本发明的有益效果:
试验例I 本发明药物组合物诱导间充质干细胞定向分化为表皮细胞
1、材料和仪器
材料:骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者，无血液系统疾病和家族遗传病史，患者知情同意
药物、试剂及仪器:
美洲大蠊提取物(以下简称ML提取物)是由实施例2方法制备的D u Ib e c c ο最低必需培养基(D M E M )、D is P a s e I 1、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(E D T A )、淋巴细胞分离液、相关抗体等无菌超净工作台CO2恒温培养箱
C X 4 O普通光学显微镜和C K 4 O倒置相差显微镜 Beckman21R低温高速离心机 MD100 - 2电子天平 培养瓶、培养皿、培养板等
2、分组 共四组:
空白组:采用含10% FBS的L 一 DMEM培养基培养；
阳性组:在空白组基础上加入诱导剂(成分为10-7mol/L地塞米松+20 ng/mL EGF, +15ng/mL bFGF+ 1%ITS(胰岛素转铁蛋白))；
药物组:采用含0.01g/ml ML提取物的L 一 DMEM培养基培养；
药物+阳性组:在空白组基础上加入诱导剂及0.01g/ml美洲大蠊提取物。3、实验方法
(一)骨髓间充质干细胞的分离培养(I)分离培养
无菌条件下取临床骨髓穿刺检查正常患者2mL健康骨髓，用DMEM培养液等倍稀释混匀后，加入到含Ficoll淋巴细胞分离液的试管中，400g离心30min，收集界面层的单个核细胞，D-Hank’s液洗涤细胞2次，重悬细胞于含体积分数为10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，置37°C、含体积分数为5% CO2、饱和湿度恒温培养箱培养。3d后首次换液，弃去未贴壁细胞，保留贴壁细胞继续培养。待细胞基本长满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化传代。(2)传代2次后对细胞进行鉴定:形态观察及免疫荧光检测
收集细胞，调整细胞悬液浓度，每张爬片上接种10000个细胞。第二天，取出玻璃爬片，PBS清洗3次。固定液固定15分钟。封闭液封闭I小时。一抗孵育2h-12h。PBS清洗3次，二抗孵育lh_2h。DAPI孵育5分钟。PBS清洗封片。检测的间充质干细胞细胞表面标志物为:大鼠抗人的抗体⑶29，⑶34，⑶44，⑶90的表达情况，以鉴定该培养细胞是否为骨髓间充质干细胞。免疫荧光。检测结果见图1，左上:⑶29阳性表达率98.6± 1.8%;右上:⑶34阳性表达率0.6±0.2% ;左下:CD44阳性表达率93.3 ±2.1% ;右下:CD90阳性表达率89.2 ±4.5%，说明成功得到了间充质干细胞。(二)定向诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞
(I)培养
取第3代间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化成细胞悬液，随机分为四组:空白组(采用含10% FBS的L 一 DMEM培养基培养)、阳性组(在空白组基础上加入诱导剂)、药物组(采用含0.01g/ml ML提取物的L 一 DMEM培养基培养)、药物+阳性组(在空白组基础上加入诱导剂及0.01 g/ml ML提取物)，将第3代细胞接种在PLL处理过的玻璃爬片上，分别加入上述培养基，每组各设3个平行组，按照常规细胞培养。(2)检测
按照常规细胞培养要求继续培养7天后，收集细胞，按照免疫荧光检测的方法进行培养细胞爬片制作，进行细胞角蛋白CK19(该指标为表皮细胞特征性标志物)表达的检测。通过CK19表达情况鉴定表皮干细胞是否形成。荧光染色结果显示:空白组无CK19表达为阴性，阳性组、药物组及药物+阳性组均有CK19的表达，其中药物组(ML提取物)CK19表达显著，说明ML提取物具有诱导人间充质干细胞hMSCs分化为表皮干细胞的作用。试验例2提取物对小鼠的急性毒性及半数致死剂量
1、实验材料
1.1.实验药物:
实施例2提取物干粉，黄棕色粉末，味腥，易吸潮，易溶于水。提取物溶液浓度分别为0.lg/ml，0.2g/ml，0.4g/ml红棕色澄清液体，以上样品均由四川好医生攀西药业有限责任公司提供。1.2.实验动物及环境条件:
昆明种小鼠，SPF级(三级)合格动物。试验环境条件:本试验应用设施符合SPF (三)级标准的动物实验室内进行。室内通过自动空调控制室温在19 21°C，相对湿度控制在50 65%。通过自动换气装置调节室内空气。人工控制荧光照明，每天8 20时明，2(Γ8时暗。实验动物分笼饲养，动物每笼不超过5只，自由饮水，常规全价饲料，定时定量喂养，每天下午4时左右，小鼠喂食8g/20g b.w.。1.3.实验试剂
氯化钠注射液(0.9%)，规格:500ml:4.5g，其它试剂均为市售，分析纯。1.4.试验仪器
JA1003电子天平，上海精科天平，d=lmg ；
EB-3200D电子天平，由日本岛津生产，d=0.0lg ；
YB电子天平，上海海康电子仪器厂生产，d=0.1g ；
手术器械、秒表、直尺、灌胃针等。、实验方法与结果
2.1、提取物对小鼠的急性毒性试验药物配制:采用四川好医生攀西药业有限责任公司按照实施例2方法制备的提取物，制成浓度分别为0.lg/ml,0.2g/ml，0.4g/ml红棕色澄清液体，用量筒计量最后所得药液体积，供实验用。预试验:取体重18 22g小鼠40只，雌雄各半，按体重随机分成10组，每组4只，自由饮水，禁食6小时后，各组按0.4ml/10g体重分别灌胃70%、56%、45%提取物液体，对照组灌胃等体积生理盐水，观察小鼠给药后毒性反应及死亡情况，观察7天，每天一次，各组动物死亡情况如表1: 表I本发明美洲大蠊提取物的毒性结果
权利要求
1.一种美洲大蠊提取物的制备方法包括如下的步骤: ①.取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫，称取适量，加丙酮进行回流，得到脱脂原料； ②.加水煎煮提取2 4次； ③.将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度1.02 1.25 (60°C测)，加入乙醇，静置，滤过； ④.将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水，滤过或离心； ⑤.将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； ⑥.将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； ⑦.将步骤⑥所得的流出液减压浓缩、干燥，粉碎。
2.一种美洲大蠊提取物的制备方法包括如下步骤: ①.取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫，挑去杂质及非药用部位，称取精选的原料适量，加丙酮回流2-4次，每次加入2-5倍量，每次回流0.5-1.5小时得到脱脂原料，挥去丙酮； ②.加水煎煮提取2 4次，每次加入药材重量5 20倍体积的水，每次煎煮提取0.5 2小时，滤过； ③.将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度1.02 1.25 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达55% 90%，在-5°C 25°C静置6 24小时，滤过； ④.将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于0.1 2克原生药，滤过或离心； ⑤.将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； ⑥.将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； ⑦.将步骤⑥所得的流出液70°C以下减压浓缩、干燥，粉碎。
3.一种美洲大蠊提取物的制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤: ①.取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫，挑去杂质及非药用部位；称取步骤①精选的原料适量，加丙酮回流3次，每次加入8-12倍量，每次回流I小时得到脱脂原料，挥去丙酮； ②.加水煎煮提取2-4次，每次加入药材重量8-15倍体积的水，每次煎煮提取0.5 2小时，滤过； ③.将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度1.02 1.15 (60°C测)，加入乙醇至含醇量达75% 85%，在(TC 15°C静置8 18小时，滤过； ④.将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当于0.5 2克原生药，滤过或离心； ⑤.将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；⑥.将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； ⑦.将步骤⑥所得的流出液70°C以下进行减压浓缩、干燥，粉碎。
4.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于:步骤③所述滤液浓缩至相对密度1.05 (60°C测)。
5.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于:步骤⑤所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。
6.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于:步骤⑥所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度为100 200目。
7.如权利要求1-6任意一项所述方法制备的美洲大蠊提取物。
8.美洲大蠊提取物在制备定向诱导间充质干细胞分化为表皮细胞的诱导液中的应用。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述的美洲大蠊提取物为权利要求1-6任意一项所述方法制备的美洲大蠊提取物 。
全文摘要
本发明公开了一种美洲大蠊提取物及其制备方法和用途，采用丙酮回流，水提，浓缩，向浓缩液中加入乙醇；回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；取回收乙醇后的滤液通过吸附树脂柱，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；通过聚酰胺柱，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；浓缩、干燥。本发明还公开了美洲大蠊提取物的新用途。本发明美洲大蠊提取物的制备方法克服传统制备方法的缺陷，具有较强的应用价值。
文档编号A61P17/02GK103222988SQ20131001412
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者耿福能, 马秀英, 吴桃清 申请人:四川好医生攀西药业有限责任公司