包含高氧亲和力的修饰血红蛋白的氧气输送方法和组合物的制作方法

专利名称：包含高氧亲和力的修饰血红蛋白的氧气输送方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液制品，更特别涉及包含具有高氧亲和力的修饰血红蛋白的组合物以及制备该组合物的方法。
背景技术：
循环系统及血红蛋白特件血液是为组织输送营养并从组织中移去排泄废物的工具。血液由其中悬浮红细胞(RBC或红血球)、白细胞(WBC)和血小板的血浆组成。红细胞约占血液中的细胞的99%，其主要功能是为组织输送氧气并 从中移去二氧化碳。心脏的左心室泵送血液通过循环系统的动脉和较小的微动脉。血液然后进入毛细血管，从中进行营养和细胞废物的大部分交换。(参见例如A.C.Guyton, "Human PhysiologyAnd Mechanisms Of Disease"(第三版；W.B.Saunders C0., Philadelphia, Pa.), 228-229页(1982))。此后，血液经过微静脉和静脉而返回心脏的右心房。尽管返回心脏的血液较之从心脏泵出的血液氧气不足，但安静时，返回的血液仍包含约75%的初始氧含量。红细胞可逆的氧合功能(即输送氧气)是通过蛋白质血红蛋白实现的。哺乳动物血红蛋白的分子量约64，000道尔顿，由约6%血红素和94%珠蛋白组成。其天然形式包含两对亚基(即其为四聚体)，各自包含血红素基团和珠蛋白多肽链。血红蛋白在水溶液中处于四聚体(MW64，000)和二聚体(MW32，000)形式之间的平衡；红细胞外的二聚体由肾脏过早排出(血浆半衰期约2-4小时)。除血红蛋白外，RBC还包含基质(RBC膜)，其中包含蛋白质、胆固醇和磷脂。外源性血.液制品由于医院及其它环境下的血液制品需求，已经针对血液代用品(bloodsubstitute)和血浆扩容剂进行了广泛研究。血液代用品是能够携带并为组织供应氧气的血液制品。血液代用品具有多种用途，包括替代手术过程中和急性出血后的失血，以及创伤性损伤后的复苏过程。血浆扩容剂是输入血管系统、但一般不能携氧的血液代用品。血浆扩容剂可用于例如替代烧伤中的血浆损失、治疗容量不足性休克以及实现血液稀释(例如维持血量正常和降低血粘度)。基本上，血液代用品可用于所述目的或当前给予患者库存血液的任何目的。(参见例如Bonson等人美国专利4，001，401以及Morris等人专利4，061，736)。当前的人血液供给伴有若干局限性，可以通过使用外源性血液代用品而缓和。举例说明，安全有效的血液代用品的广泛利用将降低对库存(异体)血液的需要。此外，这种血液代用品允许在创伤性损伤后立即输注复苏液，而不考虑交叉配型(血液则需要)，从而节省了为缺血性组织再供给氧气的重要时间。而且，可以在手术前给予患者血液代用品，使得可以取出患者自体血液，如果需要，能够在该过程中稍后回输，或在手术后回输。因此，使用外源性血液制品不只保护患者免于接触非自体(异体)血液，也保存自体或异体(库存、交叉配型的)血液以供其最适用途。当前血液代用品的局限制备血液代用品(有时称作”携氧血浆扩容剂”)的努力迄今所制备的产品效果差强人意，或其生产费时、费钱或兼而有之。生产这些产品的费用常常很高，以致实际上妨碍了产品的广泛应用，尤其是在那些存在巨大需求的市场中(例如新出现的第三世界经济)。血液代用品可以分为以下三类:i)基于全氟化碳的乳剂，ii)脂质体包封血红蛋白，iii)修饰的无细胞血红蛋白。如下所述，尽管认为包含修饰的无细胞血红蛋白的产品最有希望，但均未完全成功。基于全氟化合物的组合物溶解氧气，而不与其结合为配基。为了用于生物系统，全氟碳化合物必须与脂类、一般为卵黄磷脂乳化。尽管全氟化碳乳剂制备便宜，但不能在临床耐受剂量下携带足够有效的氧气。相反，已经表明脂质体包封血红蛋白是有效的，但其广泛使用极为昂贵。(一般参见Winslow, Robert Μ., ^Hemoglobin-based RedCell Substitutes, ^Johns Hopkins University Press, Baltimore(1992))。当今临床试验的大部分血液代用品产品是基于修饰的血红蛋白。这些产品通常称作基于血红蛋白的氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers, HBOC), 一般包含化学修饰血红蛋白的均一水溶液，基本不含其它红细胞残存(基质)。虽然人的无基质血红蛋白(stroma-free haemoglobin, SFH)是制备HBOC最常用的原材料,但也使用其它来源的血红蛋白。例如，血红蛋白可以得自或来源于动物血液(例如牛或猪血红蛋白)、或经分子改造为生产目的血红蛋白产品的细菌、或酵母、或转基因动物或植物。化学修饰一般为分子内交联、寡聚化和/或聚合物缀合之一，来修饰血红蛋白，使其在循环中的保留时间较之未修饰血红蛋白延长，其氧结合特性则与血液类似。分子内交联使四聚体血红蛋白单位的亚基化学结合在一起，以防止其形成如前所述过早排出的二聚体。(参见例如Rausch等人美国专利5，296，465)。制备HBOC产品的高额费用大大限制其商业生存力。此外，本发明人发现，已知的HBOC倾向于在微动脉壁而非毛细血管处向组织释放过量的氧气。这可导致HBOC对毛细血管周围的组织供氧不足。尽管HBOC最初的氧气载荷可能相对高于天然红细胞正常达到的量，极低亲和力的突变体除外。多数情况下，设计HBOC的氧亲和力等于或低于天然血红蛋白。但如上所述，这可能导致组织供氧不足。因此，本发明涉及包含在含水稀释剂中具有高氧亲和力的HBOC的血液代用品。发明概述本发明的方法和组合物可用于多种环境下，包括急诊室、手术室、军事冲突、肿瘤医院和兽医诊所。本发明的低毒性和高稳定性允许室温保存，而不损害所述血液代用品的效力。本发明还避开了血型的交叉配型以及相关的实验室检测要求，允许更早、更安全介入患者治疗。本发明的低毒性、长期稳定性以及通用性加在一起，因而表现为一种特别有用的血液代用品。
一方面，本发明提供了包含表面修饰的氧合血红蛋白的血液代用品产品，其中在相同条件下检测时，该表面修饰的氧合血红蛋白的P50低于相同动物来源(即来自相同种类动物)的天然无基质血红蛋白。合适的动物来源包括，例如人、牛、猪、马。在一个优选实施方案中，该血液代用品产品采取包含表面修饰的氧合血红蛋白和含水稀释剂的组合物的形式。在一个特定实施方案中，该表面修饰的氧合血红蛋白的P50小于IOtorr,优选小于 7torr。另一方面，本发明提供了通过在氧合血红蛋白上共价连接一种或多种聚环氧烷(polyalkylene oxides)而生成的血液代用品产品。在一个特定实施方案中，该血液代用品产品通过共价连接聚环氧烷的聚合物而生成，例如具有化学式H(OCH2CH2)nOH的聚乙二醇(PEG)，其中η大于或等于4。优选该产品的闻铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10。另一方面，本发明提供了包含PEG-血红蛋白缀合物、在24° C对自身氧化稳定的血液代用品产品，其中高铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10，并且该PEG-血红蛋白缀合物的Ρ50小于lOtorr。另一方面，本发明提供了制备血液代用品组合物的方法，其包含以下步骤:a)制备高铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10的血红蛋白；b)在血红蛋白上共价连接聚环氧烷，形成P50小于IOtorr的表面修饰的氧合血红蛋白；以及c)将表面修饰的氧合血红蛋白悬浮于合适的稀释剂中。制备血红蛋白优选另外包含从红细胞中分离血红蛋白。此外，制备血红蛋白的步骤可以另外包含从红细胞中分离血红蛋白，其中血红蛋白的高铁血红蛋白/总血红 蛋白之比为0.10或以上，并将该血红蛋白暴露在氧气条件下(即大气中)足够时间，以使高铁血红蛋白/总血红蛋白之比降低到小于0.10。该步骤可在缺少含巯基还原剂的条件下进行。另一方面，本发明提供了使用血液代用品产品为组织输送氧气的方法，包含将处于含水稀释剂中的产品给予有此需要的哺乳动物。 本发明的其它方面如说明书全文所述。附图简述

图1 描述 MalPEG-Hb 和 Si7H 的 FPLC 层析图。图2描述MalPEG-Hb和SHl的氧平衡曲线。图3描述两种PEG修饰的血红蛋白(PHP和Ρ0Ε)以及未修饰血红蛋白(SFH)的FPLC洗脱特征。注意PHP和POE的特征在性质上而非数量上相类似。同样注意POE曲线中显然是未修饰血红蛋白的小峰。图4描述两种PEG修饰的血红蛋白(PHP和Ρ0Ε)的氧平衡曲线。注意两者均没有显著协同性。图5描述MalPEG-血红蛋白在室温下随时间的氧化速率。从以同样方式保存的两只独立的瓶子中，一式两份测定样品。氧化速率为每小时总血红蛋白的1%，10小时内从5.0到 5.5%ο图6描述接受PHP或POE的两组动物的Kaplan-Meier生存分析。图7描述接受两种PEG修饰血红蛋白(PHP和Ρ0Ε)动物的平均动脉压。反应是即时性的，接受PHP的动物反应较大。但在出血期间，POE动物的血压维持较好。图8描述MalPEG-Hb于-20° C保存6天、+4° C保存5天以及室温(24° C)保存10小时的各种随时间氧化速率的总结。图9描述MalPEG-Hb于+4° C保存5天的随时间氧化速率。图10描述MalPEG-Hb于室温保存10小时的随时间氧化速率。发明描述本发明涉及包含高氧亲和力HBOC的血液代用品。对于某些应用，这些组合物能够比氧亲和力类似于天然血红蛋白的血液代用品更有效地为组织输送氧气。定义为帮助理解后文公开内容所示本发明，下文定义了许多术语。

术语〃血红蛋白〃 一般是指红细胞内包含的输送氧气的蛋白质。每个血红蛋白分子具有4个亚基，两条α链和两条β链，组成四聚体结构。每个亚基还包含一个血红素基团，其含铁的中心结合氧。因而每个血红蛋白分子可结合4个氧分子。术语〃修饰血红蛋白〃包括但不限于通过化学反应改造的血红蛋白，例如分子内或分子间交联、遗传操作、聚合和/或缀合其它化学基团(例如，聚环氧烷诸如聚乙二醇，或其它加成物诸如蛋白质、肽、糖类、合成聚合物等)。本质上，如果血红蛋白的任何结构或功能性质由其天然状态而改变，则是〃修饰的〃。此处所用术语〃血红蛋白〃本身是指天然、未修饰的血红蛋白以及修饰的血红蛋白。术语〃表面修饰血红蛋白〃用来指已经连接(最通常共价连接)化学基团诸如葡聚糖或聚环氧烷的上述血红蛋白。术语〃表面修饰氧合血红蛋白〃是指表面修饰时处于〃R〃状态的血红蛋白。术语〃无基质血红蛋白〃是指已经从中去除所有红细胞膜的血红蛋白。术语〃高铁血红蛋白〃是指包含三价态铁的血红蛋白，不能起氧载体作用。术语〃MalPEG_Hb〃是指已经缀合malemidyl活化的PEG的血红蛋白。这种MalPEG-Hb可由下式进一步指定:Hb- (S-Y-R-CH2-CH2- [O-CH2-CH2] n0_CH3) m 式 I其中Hb是指四聚体血红蛋白，S是表面巯基，Y是Hb和Mal-PEG之间的琥珀酰亚胺基共价连接，R是烷基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基(取决于原材料的来源和化学合成方法)，
n是组成PEG聚合物主链的氧化乙烯基单元，其中η定义聚合物长度(例如MW=5000)，O-CH3是末端甲氧基。PHP和POE是两种不同的PEG修饰血红蛋白。术语〃全氟化碳〃是指包含氟原子的合成的惰性分子，并完全由卤素(Br，F，Cl)和碳原子组成。其乳剂形式比等量的血浆或水能够多溶解很多倍的氧气，因而正开发为血液物质。术语〃血浆扩容剂〃是指能够给予受试者以治疗失血的任何溶液。术语〃携氧能力〃或简称〃氧容量〃是指血液代用品携氧的能力，但未必与输送氧的效力相关。既然已知每克血红蛋白结合1.34ml氧气，一般根据血红蛋白浓度计算携氧能力。因此，血红蛋白的@/(11浓度乘以系数1.34，得到1111/(11的氧容量。可由任何已知方法测定血红蛋白浓度，例如使用β -血红蛋白光度计(HemoCue, Inc., Angelholm, Sweden)。类似地，使用例如燃料池仪器(例如Lex-O2-Con; Lexington Instruments),通过血红蛋白或血液样品释放的氧气量测定氧含量。术语〃氧亲和力〃是指氧载体例如血红蛋白结合分子氧的亲和力。该特征由联系血红蛋白分子氧饱和度(Y轴)与氧分压(X轴)的氧平衡曲线定义。该曲线的位置由氧载体被氧半饱和时的氧分压P50值表示，与氧亲和力逆相关。因此，P50越低，氧亲和力越高。可以利用本领域已知的多种方法测定全血(以及全血组分诸如红细胞和血红蛋白)的氧亲和力。(参见例如Winslow等人J.Biol.Chem.252(7): 2331-37 (1977))。也可使用可商品化的 HEMOX TM Analyzer (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pennsylvania)测定氧亲和力。(参见例如 Vandegriff 和 Shrager 之于〃Methods in Enzymology〃(Everse 等人编著)232:460 (1994))。术语〃高渗〃表示胶体渗透压(oncotic)高于血液的胶体溶液(> 约25_27mm Hg)。可利用任何合适技术，例如在Wescor仪器中，测定胶体渗透压。术语〃携氧成分〃泛指能够在身体循环系统中携氧并将至少部分氧气输送给组织的物质。在优选实施方案中，该携氧成分是天然或小时血红蛋白，此处也称为〃基于血红蛋白的氧载体〃或〃HB0C〃。术语〃血液动力学参数〃泛指反映血压、血流和容量状态的测量，包括测量诸如血压、心输出量、右房压和左心室舒张末期压。术语〃类晶体〃是指小分子(通常小于_i)，诸如盐、糖和缓冲液。与胶体不同，
晶体不包含任何张力活性(oncotically active)成分，可极快速在循环和细胞间隙之间达到平衡。术语〃胶体〃与〃类晶体〃相反，是指大分子(通常大于Μ, )，根据其大小
和电荷跨生物膜达到平衡，包括蛋白质诸如白蛋白和明胶，以及淀粉诸如pentastarch和hetastarcho 术语〃胶体渗透压〃是指胶体为平衡流体跨膜平衡而施加的压力。术语〃对自身氧化稳定〃是指HBOC维持低速率自身氧化的能力。如果在24° ClO小时之后高铁血红蛋白/总血红蛋白之比增加不超过2%，则认为HBOC在24° C稳定。例如，假设自身氧化速率为0.21Γ1，那么如果最初的高铁血红蛋白百分比为5%，若该百分比增加不超过7%，则认为HBOC在室温下10小时是稳定的。术语〃高铁血红蛋白/总血红蛋白之比〃是指脱氧血红蛋白与总血红蛋白的比值。术语〃混合物〃是指两种或多种物质混合一起，而不发生丧失其各自特性的反应；术语〃溶液〃是指液体混合物；术语〃水溶液〃是指包含一些水的溶液，也可能包含一种或多种其他液体物质，与水形成多组分溶液；术语"大约"是指实际值位于一个范围之内，例如指示值的10%术语〃聚乙二醇〃是指化学通式H(OCH2CH2)n OH的液体或固体聚合物，其中η大于或等于4。可以使用任何PEG成分，无论取代或未取代。此处所用其它术语的含义应易为本领域适当技术人员所理解。氧气输送和消耗的性质虽然成功使用本发明的组合物和方法并不需要理解氧气输送和消耗的机理，但有关其中某些推断机理的基础知识可能有助于理解后文之论述。一般认为毛细血管是组织主要的氧输送者。但对于静态组织，现有发现表明，在微动脉和毛细血管氧释放之间大致存在均匀分配。也就是说，认为动脉系统中的血红蛋白在微动脉网中输送约三分之一的氧含量，在毛细血管输送三分之一，余者通过静脉系统离开微循环。动脉本身是氧气利用的场所。例如，动脉壁需要能量以通过抵抗血管阻力收缩，进行血流调节。因此，动脉壁通常是氧气自血液中扩散的重要场所。然而，现有的携氧组合物(例如HBOC)可能在动脉系统中释放过多的氧含量，从而诱导自动调节性的毛细血管灌流减少。因此，具有过多的氧气或过低的氧亲和力实际上可能妨碍血液代用品的输氧效率。通过测量管壁梯度，可以确定血管壁的耗氧速率，即机械功所需氧气和生化合成所需氧气之合。参见例如Winslow等人之于"Advances in BloodSubstitutes" (1997), Birkhauser 编著，Boston, MA, 167-188 页。现有技术可以在多种血管中进行精确氧分压测量。所测梯度与测量区域中组织的氧利用率成正比。该测量表明，血管壁具有基本的氧气利用，随激动(infla_ation)和收缩的提高而提高，随松弛而降低。血管壁梯度与组织氧合成反比。血管收缩提高氧梯度(组织代谢)，血管舒张则降低该梯度。高梯度表示血管壁使用的氧气较多，组织可利用的氧气则较少。相信同样现象遍及微循环。血管收缩和氧亲和力的关系开发高氧亲和力HBOC的基本原理部分基于过去使用无细胞血红蛋白代替红细胞输血的研究。这些溶液的某些生理效应尚未完全了解。其中可能最有争议的是导致血管收缩的倾向，在动物和人中可能出现高血压(Amberson, W.，"Clinical experiencewith hemoglobin-saline solutions,〃.Science 106:117-117(1947))(Keipert, P., A.Gonzales,C.Gomez, V.Macdonald, J.Hess 和 R.Winslow, "Acute changes in systemicblood pressure and urine output of conscious rats following exchangetransfusion with diaspirin-crossI inked hemoglobin solution,〃Transfusion33:701-708, (1993))。美军开发了用bisdibromosalicyl-延胡索酸α链间交联的人血红蛋白(a aHb)作为原型红细胞代用品，但在证明其剧烈增加肺及全身血管阻力之后，被军队放弃了 (Hess, J., V.Macdonald, A.Murray, V.Coppes 和 C.Gomez, "Pulmonaryand systemic hypertension after hemoglobin administration, "Blood78:356A(I991))。该产品的商品化形式也在令人失望的III期临床试验后被放弃了(WinsloW，R.M.^aa-Crosslinked hemoglobin:Was failure predicted by preclinical testing 〃Voxsang79:1-20 (2000)。无细胞血红蛋白引起血管收缩的最常见的最新解释是，它易于结合内皮细胞来源的松弛因子一氧化氮(NO)。实际上，已经制备了 NO亲和力降低的重组血红蛋白，在最高载量的大鼠实验中似乎较少高血压(Doherty, D.H.，Μ.P.Doyle, S.R.Curry, R.J.Val i, T.J.Fattor, J.S.01 son 和 D.D.Lemon, "Rate of reactionwith nitric oxide determines the hypertensive effect of cell-freehemoglobin, "Nature Biotechnologyl6:672-676(1998))(Lemon, D.D., D.H.Doherty, S.R.Curry, A.J.Mathews, M.P.Doyle, T.J.Fattor 和 J.S.0lson, "Control of thenitric oxide-scavenging activity of hemoglobin, ^Art Cells, Blood Subs., andImmob.Biotech24:378 (1996))。但研究提示，NO结合可能并非血红蛋白血管活性的唯一解释。已经发现，某些大的血红蛋白分子，例如由聚乙二醇(PEG)修饰的血红蛋白分子，实际上没有高血压效应，即使其NO结合速率与严重高血压的a aHb相同(Rohlfs, R.J., Ε.Bruner, A.Chiu, A.Gonzales, M.L.Gonzales, D.Magde, M.D.Magde, K.D.Vandegriff 和 R.M.Winslow, "Arterial blood pressure responses tocell-free hemoglobin solutions and the reaction with nitric oxide, 〃JBiolChem273:12128-12134(1998))。此外，发现在出血之前以交换输血给予PEG-血红蛋白时，在防止出血后果方面格外有效(Winslow, R.M., A.Gonzales, M.Gonzales, M.Magde, M.McCarthy, R.J.Rohlfs和 K.D.Vandegriff, "Vascular resistance and the efficacy ofred cell substitutes, "JAppl Physiol85:993-1003 (1998))。该保护效应与缺少高血压相关，提示血管收缩导致迄今研究的许多基于血红蛋白产品的失望性能。基于上述观察，形成了解释血管收缩的假说，来替代或可能补充NO结合效应。尽管不希望受任何特定理论的限制，但相信血红蛋白血管活性效应的基本成分是血红蛋白在无细胞间隙扩散的反射性反应。在体外毛细血管系统中测试该假说，证明扩散常数降低的PEG-血红蛋白以非常类似于天然红细胞的方式转移O2(McCarthy，M.R., K.D.Vandegriff 和 R.M.Winslow,〃The role of facilitated diffusion inoxygen transport by cell-free hemoglobin:1mplications for the design ofhemoglobin-based oxygen carriers, ^Biophysical Chemistry92:103-117(2001))。由于血红蛋白到血管壁饱和度的改变是血红蛋白自身扩散梯度的决定因素，预期氧亲和力在血红蛋白于血浆空间的易化扩散中起作用。由于释放O2到微动脉血管壁将引起血管收缩，无细胞血红蛋白的氧亲和力可能还起调节血管紧张度的作用(Lindbom, L., R.Tuma和K.Arfors, "Influence ofoxygen on perfusion capillary density and capillary red cell velocity inrabbit skeletal muscle, ^Microvasc Resl9:197-208 (1980))。在仓鼠皮肤皱裙中，该血管的PO2为20-40Torr,而正常红细胞氧平衡曲线最陆(Intaglietta, M., P.Johnson和 R.Winslow, "Microvascul ar and tissue oxygen distribution, ^CardiovascRes32:632-643 (1996))。因而从理论观点来看，为了防止无细胞血红蛋白在微动脉调节性血管中释放O2，其P50低于红细胞(即较高的O2亲和力)可能是重要的。
_0] 携氧成分在优选实施方案中，氧载体(即携氧成分)是基于血红蛋白的氧载体或HBOC。血红蛋白可能是天然(未修饰)的；后来利用化学反应进行修饰，例如分子内或分子间交联、聚合或加成化学基团(例如聚环氧烷或其它加成物)；或可能经重组改造的。人α-和β-珠蛋白基因均已克隆并测序。Liebhaber等人P.N.A.S.77:7054-7058 (1980) ;Marotta等人J.Biol.Chem.353:5040-5053(1977) (β -珠蛋白cDNA)。此外，如今使用定位诱变已经产生了许多重组制备的修饰血红蛋白，尽管这些〃突变〃血红蛋白种类据报道具有并不理想的高氧亲和力 ο 参见例如 Nagai 等人 P.N.A.S.,82:7252-7255 (1985)。本发明不受血红蛋白来源的限制。例如，血红蛋白可能来源于动物和人。某些应用优选的血红蛋白来源是人、牛和猪。此外，可能利用其它方法产生血红蛋白，包括化学合成和重组技术。血红蛋白可能以游离形式加入到血液制品组合物中，或可能包封到囊中，例如合成颗粒、微球或脂质体。本发明优选的携氧成分应该无基质、无内毒素。许多授权的美国专利公开了携氧成分的典型例子，包括Hsia的美国专利4，857，636 ；ffalder的美国专利4，600，531,Morris等人的美国专利4，061，736 ；Mazur的美国专利3，925，344 ；Tye的美国专利4，529，719 ；Scannon的美国专利4，473，496 ；Bocci等人的美国专利4，584，130 ；Kluger等人的美国专利5，250, 665 ；Hoffman等人的美国专利5，028, 588以及Sehgal等人的美国专利 4，826，811 和 5，194，590。除前述血红蛋白来源以外，最近发现马血红蛋白作为本发明组合物中的携氧成分具有某些优点。一个优点在于，容易获得从中纯化马血红蛋白的商品化数量的马血。另一意想不到的优点在于，马血红蛋白具有可能增强其在本发明血液代用品中用处的化学特性。先前的报告已经指出，马血红蛋白比人血红蛋白更快速自身氧化为高铁血红蛋白，使其作为血液代用品成分不太理想。参见例如J.G.McLean和1.M.Lewis, Research inVet.Sc1.，19:259-262(1975)。为了将自身氧化减到最小，McLean和Lewis在红细胞裂解后使用还原剂谷胱甘肽。然而，用于制备本发明组合物的血红蛋白，不论来源于人或马，均布需要在红细胞裂之后使用还原剂来防止自身氧化。最近报道马血红蛋白的氧亲和力不同于人血红蛋白。参见例如M.Mellegrini等人Eur.J.Biochem..268:3313-3320 (2001)。这种差异阳碍了诜择马血红蛋白来制各樽拟人血红蛋白的血液代用品。但在引入本发明的组合物时，未观察到含人和马血红蛋白缀合物的氧亲和力之间的显著差异(小于10%)。因此，与这些表面上不理想的特性相反，在本发明的组合物中，马血红蛋白等效、若不然则优于人血红蛋白。对于本发明中的使用而言，在相同条件下测量时，HBOC的氧亲和力高于全血，优选是全血的两倍，或者高于无基质血红蛋白(SFH)。在大多数情况下，这意味着血液代用品中的HBOC的P50 将小于10，更优选小于7。游离态SHl的P50约15torr，而全血的P50约28torr。先前提议提高氧亲和力从而降低P50，可能增强对组织输氧，虽然暗示低于SFH的P50不可接受。参见Winslow等人之于〃Advances in BloodSubstitutes" (1997), Birkhauser 编著,Boston, MA, 167 页以及美国专利 6, 054, 427。该提议与广泛秉承的看法相悖，即，用作血液代用品的修饰血红蛋白应该氧亲和力较低，并且P50应该接近全血。因此，由于卩比卩多醒化(pyridoxylated)的血红蛋白相比SFH更易于释放氧，许多研究者使用磷酸卩比唆醒(pyridoxyl phosphate)将SFH的P50从10提高到约20-22。许多不同的科学方法可以制备高氧亲和力的HB0C(即P50低于SFH)。例如，研究已经鉴定了在氧亲和力中起作用的氨基酸残基，例如B-93半胱氨酸，因而如今可以轻易进行定位诱变来操纵氧亲和力到达理想水平。参见例如美国专利5，661，124。美国专利6，054，427讨论了其它多种方法。血红蛋白相关毒件已知血红蛋白从亚铁(Fe2+)到铁(Fe3+)或高铁血红蛋白形式可逆变化时，表现自身氧化。发生这种情况时，分子氧以过氧化阴离子(O2-)的形式从氧合血红蛋白中解离。这还导致血红素-珠蛋白复合物去稳定，最后珠蛋白链变性。相信氧自由基形成以及蛋白质变性在 HBOC 的体内毒性中起作用(Vandegriff, K.D., Blood Substitutes, PhysiologicalBasis of Efficacy, 105-130 页，Winslow 等人编著，Birkhauser, Boston, MA (1995))。大多数HBOC的氧亲和力和血红蛋白氧化具有负相关，S卩，氧亲和力越高，自身氧化速率越低。然而，不同的血红蛋白修饰对氧亲和力和自身氧化速率的作用不一定可以预测。此外，氧亲和力和自身氧化速率之间的最佳平衡不甚明了。本发明部分涉及意外发现，即，此处所述PEG-Hb缀合物的自身氧化速率极低。测量氧化速率时，数值应该尽可能低(即，每小时总血红蛋白的0.2%、更优选每小时总血红蛋白的0.1%，在室温下至少3小时、更优选至少10小时)。本发明的HBOC因而在给药和/或室温保存期间保持稳定。携氧成分的修饰在一个优选实施方案中，该携氧成分是修饰的血红蛋白。优选的血红蛋白修饰是"表面修饰〃，即，在血红蛋白分子暴露的氨基酸侧链上共价结合化学基团。主要为提高血红蛋白的分子大小而进行修饰，大多通过共价结合聚合部分，例如合成的聚合物、糖类、蛋白质等。通常优选合成的聚合物。适当的合成亲水性聚合物包括,尤其是聚环氧烧,例如聚环氧乙烧(polyethyleneoxide) ((CH2CH2O)n)、聚环氧丙烧(polypropylene oxide) ((CH(CH3)CH2O)n)或聚环氧乙烧/聚环氧丙烷共聚物((CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH20)n)。适于实践本发明的其它直、支链以及任意取代的合成聚合物为医学领域所公知。因其药物可接受性以及商业可利用性，最常见的结合血红蛋白的化学基团是聚乙二醇(PEG)。PEG是化学通式为H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中η —般大于或等于4。PEG表述通常后接一个对应其平均分子量的数字。例如，PEG-200的平均分子量200，可能的分子量范围190-210。PEG可商品化获得多种不同形式，很多情况下为预活化并预备缀合蛋白质。本发明优选实施方案的重要方面在于，表面修饰在血红蛋白处于氧合或〃R〃态时发生。在缀合之前，将血红蛋白与大气平衡(或者可以进行活性氧合)，这很容易实现。通过对氧合血红蛋白进行缀合，所得血红蛋白的氧亲和力增强了。由于许多研究者描述在缀合前脱氧以减少氧亲和力，通常视这一步骤为禁忌。参见例如美国专利5，234.903。虽然表面修饰血红蛋白的性能在许多方面与血红蛋白和修饰剂(例如PEG)之间的连接无关，但相信较刚性的接头，例如不饱和的脂肪族或芳香族C1-C6接头取代物，与具有较柔性接头并因而具有可变形联结物的取代物相比，可能加强了缀合物的制备和/或特征。加成到血红蛋白分子的PEG数目可能因PEG的大小而不同。但所得修饰血红蛋白的分子大小应该大到足以避免被肾脏清除，以达到理想的半衰期。Blumenstein等人确定，该大小达到分子量84，000 以上。(Blumenstein等人之于〃Blood Substitutes and PlasmaExpanders, "Alan R.Liss 编著，New York, New York, 205-212 页(1978))。其中作者将血红蛋白缀合到不同分子量的葡聚糖。据其报道，血红蛋白(分子量64，000)和葡聚糖(分子量20, 000)的缀合物〃被缓慢从循环中清除、由肾脏清除几可忽略〃，而提高分子量84，000以上并未改变清除曲线。因而如Blum enstein等人所确定，优选HBOC的分子量至少84，000。在本发明的一个实施方案中，该HBOC是〃MalPEG〃，代表缀合了 malemidyl活化PEG的血红蛋白。这种MalPEG可由下式进一步指定:
Hb- (S-Y-R-CH2-CH2- [O-CH2-CH2] n0_CH3) m 式 I其中Hb是指四聚体血红蛋白，S是表面巯基，Y是Hb和Mal-PEG之间的succinimido共价连接,R是烧基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基(取决于原材料的来源和化学合成方法)，
n是组成PEG聚合物主链的氧化乙烯基单元，其中η定义聚合物长度(例如MW=5000)，O-CH3是末端甲氧基。类晶体(Crystalloid)成分在本发明一个实施方案中，该血液代用品可能还包含类晶体。该类晶体成分可以是任何类晶体，在血液代用品组合物中优选能够达到摩尔渗透压浓度大于800m0sm/l，即，使该血液代用品〃高渗〃。血液代用品中合适类晶体及其浓度的例子包括，例如3%NaCl、7%NaCl、7.5%NaCl和处于6%葡聚糖中的7.5%NaCl。更优选血液代用品的摩尔渗透压浓度为800-2400m0sm/l。先前报道了在另外包含胶体(B卩，比葡聚糖扩散差的分子)的摩尔渗透压浓度300-800m0sm/l的溶液中重组制备的血红蛋白的使用。参见例如美国专利5，661，124。然而，该专利没有教导制备摩尔渗透压浓度超过800的血液代用品，并提议血红蛋白浓度应为6-12g/dl。与此相反，本发明组合物的携氧效率允许使用较低浓度的血红蛋白，例如高于6g/dl或甚而高于4g/dl。当血液代用品另外包含类晶体并高渗时，本发明组合物可能提供比其它包括胶体成分的血液代用品改进的功能，可快速恢复血液动力学参数。小体积高渗类晶体输注(例如l-10ml/kg)提供了明显好处，在受控出血中可快速持久恢复可接受的血液动力学参数。(参见例如Przybelski, R.J., E.K.Daily和M.L.Birnbaum, "Thepressor effect of hemoglobin—good or bad 〃 之于 Winslow, R.Μ., K.D.Vandegriff和 M.1ntaglietta 编著.Advances in Blood Substitutes.1ndustrial Opportunitiesand Medical Challenges.Boston, BirkMilSer (1997), 71-85) □但高渗类晶体溶液单独不能充分恢复大脑输氧。参见D.Prough等人〃Effects of hypertonic saline versusRinger’s solut ion on cerebral oxygen transport during resuscitation fromhemorrhagic shock, 〃J.Neurosurg.64:627-32(1986)。鉬成将氧载体及其它可选赋形剂与合适的稀释剂混合，配制本发明的血液代用品。尽管根据应用、特别是基于预期的给药后稀释，氧载体在稀释剂中的浓度可能改变，在优选实施方案中，由于本发明组合物的其它特征提供了增强的氧气输送及治疗效果，通常浓度不必高于6g/dl,更优选0.l-4g/dl。合适的稀释剂(即，供静脉内注射的药物可接受的稀释剂)包括，尤其是蛋白质、糖蛋白、多糖及其它胶体。这并非意味着这些实施方案受任何特定稀释剂的限制。因此，这意味着该稀释剂涵盖白蛋白、其它胶体或其它非携氧成分的无细胞水溶液，该水溶液的粘度至少2.5cP。在某些优选实施方案中，该水溶液的粘度为2.5-4cP。本发明也涵盖粘度为6cP或更高的溶液。SfflA.临床应用本发明及其实施方案将用于临床上指示快速恢复O2水平、或提高O2水平、或更换O2水平的应用中。参见例如美国专利6，054，427。本发明的方法和组合物适用的多种环境包括以下:
创伤.急性全血损失可导致胞间和细胞内空间的液体转移，以替换丧失的血容量，同时从低优先级的器官包括皮肤和消化道分流血液。从器官分流血液降低、有时消除了这些器官的O2水平，导致渐进性组织坏死。期望快速恢复O2水平，也许造成明显较好地抢救这类急性失血患者的组织。局部缺血.在局部缺血中，一个特定器官(或多个器官)氧气〃饥饿〃。器官的小部分，称为梗塞，因缺O2开始死亡。快速恢复O2水平对于阻止重要组织的梗塞形成极为重要。导致局部缺血的条件包括心脏病发作、中风或脑血管创伤。血液稀释:在此临床应用中，需要血液代用品来替换手术前取出的血液。期望取出患者血液，以防止手术后需要异体输血。在此应用中，给予血液代用品以替换(或代替)取出的自体血液的O2水平。如此允许使用取出的自体血液供手术期间或之后的必要输血。一种需要术前取血的这类手术为心肺分流术。败血症性休克.在急性败血症中，尽管大输液治疗并利用血管收缩剂治疗,某些患者可能变为高血压。在此情况下，一氧化氮(NO)的过量生成导致血压降低。由于血红蛋白以类似O2的亲和力结合NO，血红蛋白因而近乎是治疗这些患者的理想药剂。癌症.向肿瘤块含氧低的内核输送O2，可提高其放化疗敏感性。由于肿瘤的微血管系统不同于其它组织，藉由提高O2水平促进敏感性需要在低氧核心内卸载02。换言之，P50应该很低，防止过早卸载O2、提高O2水平，以确保使肿瘤对随后的放化疗最为敏感。慢性贫血.在这些患者中，损失或代谢的血红蛋白的置换受到损害或完全丧失。血液代用品可有效置换或提高患者下降的O2水平。镰状细胞贫血.在镰状细胞贫血中，患者因镰状形成过程中的O2水平损失以及极高的红细胞转换率而衰弱。镰状形成过程是PO2的函数，PO2越低，镰状形成率越高。理想的血液代用品应使患者在镰状形成危险期的O2水平恢复到正常范围内。

心麻痹.在某些心脏手术过程中，利用适当的电解质溶液并降低患者温度使心脏停止。降低稳度将显著降低P50，可能阻止在任何普通生理条件下的O2卸载。替换O2水平有可能减少这些过程中的组织损害和坏死。缺氧.士兵、高海拔居民以及极限条件下的世界级运动员因肺从空气中提取O2受限，而可能忍受降低的O2水平。受限的O2提取进一步限制了 O2输送。血液代用品可以置换或提高这些个体的O2水平。器官灌注.在器官离体维护期间，维持O2含量对于保持结构和细胞完整性并最大限度减少梗塞形成极为重要。血液代用品将维持这类器官的O2需求。细胞培养.该需求实际上与器官灌注相同，只是O2消耗率可能较高。血细胞生成.血液代用品作为血红素和铁的来源，用于在血细胞生成期间合成新的血红蛋白。B.兽医应用本发明也可用于非人类。本发明的方法和组合物可用于家养动物，例如家畜和宠物(例如狗、猫、马、鸟、爬行类)，以及在水族馆、动物园、海洋馆及其它动物收容设施中的其它动物。本发明适用于遭受因伤失血、溶血性贫血等的家养及野生动物的紧急治疗。例如，本发明的实施方案可用于下列情况下，例如马感染性贫血、猫感染性贫血、化学及其它物理因素所致溶血性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾功能亢进和脾肿大、家禽出血综合症、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、自发性免疫溶血症、缺铁症、异体免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血、寄生物感染等。本发明特别适用于难以找到稀有动物和/或外来品种的供血者的领域。
实施例实施例1制各无某质血红蛋白步骤1-获得讨期红细朐从商业来源获得过期的压积红细胞,例如San Diego血库(the San Diego BloodBank)或美国红十字会(the American Red Cross)。优选收到过期材料至采集之日起不超过45天。压积RBC(pRBC)保存于4±2° C，直至进一步处理(1_7天)。在使用前筛查所有单位的病毒感染并进行核酸检测。步骤2 -混合讨期血液在清洁设施的无菌容器中混合压积红细胞。记录压积红细胞的体积，使用可商品化获得的联合血氧定量计或其它技术认可的方法测定血红蛋白浓度。步骤 3 -白细胞去除(Ieukodepletion)使用膜过滤进行白细胞去除(即去除白细胞)。进行开始及最后的白细胞计数，以监控该处理的效率。步骤4-细胞分离及细胞洗涤

利用6体积0.9%氯化钠洗涤红细胞。该过程在4±2° C进行。利用白蛋白的分光光度计测定分析细胞洗涤，验证去除血浆成分。步骤5-红细胞裂解并去除细胞碎片使用6体积水在4±2° C搅拌至少4小时或过夜，裂解洗涤的红细胞。在冷处加工裂解物，以纯化血红蛋白。这通过处理裂解物通过0.16-μπι膜而实现。将纯化的血红蛋白收集到无菌去热源的容器中。该过程的所有步骤在4±2° C进行。步骤6 -病毒去除通过4±2° C超滤进行病毒去除。步骤7 -浓缩及溶剂交换使用ΙΟ-kD膜将从裂解并超滤纯化的血红蛋白交换到林格氏乳酸盐(Ringer’slactate, RL)或磷酸缓冲盐(PBS，pH7.4)中。然后使用相同的膜浓缩血红蛋白到终浓度1.l-1.5mM(按四聚体)。10-12体积的RL或PBS用于溶剂交换。该过程在4±2° C进行。将在RL中制备的溶液的pH调整到7.0-7.6。步骤8 -无菌过滤处于PBS或林格氏乳酸盐(RL)中的血红蛋白通过0.45-或0.2_μ m —次性滤器无菌过滤，在进行化学修饰反应之前于4±2° C保存。纯化血红蛋白的其它方法为本领域公知。此外，通常不需要使用还原剂(例如谷胱甘肽或另一含巯基还原剂)来防止细胞裂解后自身氧化。实施例2修饰无某质血红蛋白
步骤 1-硫酉享化(thiolation)使用对血红蛋白10倍摩尔过量的iminothiolane于4±2° C连续搅拌4小时,进行硫醇化。反应条件: 位于RL(pH7.0-7.5)或PBS(pH7.4)中的ImM血红蛋白(四聚体) 位于 RL (ρΗ7.0-7.5)或 PBS(pH7.4)中的 IOmMiminothiolane优化1:1OSFH:1minothiolane的比值以及反应时间，使PEG化巯基数目最高、产物不均一性最低。步骤2 -硫醇化血红蛋白的PEG化根据起始四聚体血红蛋白浓度，使用20倍摩尔过量的Mal-PEG (带有烷基或苯基接头)对硫醇化血红蛋白进行PEG化。首先使血红蛋白与大气平衡，以氧化血红蛋白。于4±2° C连续搅拌2小时，进行反应。反应条件: 位于RL或PBS (pH7.4)中的ImM硫醇化血红蛋白 位于 RL 或 PBS (ρΗ7.4)中的 20mM Mal-PEG步骤3-去除未反应试剂PEG化Hb通过70 -kD膜处理，去除过量的未反应试剂或血红蛋白。进行20体积的过滤，以确保去除未反应试剂，通过大小排阻层析在540nm和280nm处进行监控。将蛋白质浓度稀释到4g/dl。使用IN NaOH调整pH至7.3 ±0.3。步骤3 -无菌过滤4±2° C使用0.2-μ m无菌一次性滤膜于无菌过滤MalPEG-Hb终产物并收集到无菌去热源的容器中。步骤4-配制 MalPEG-Hb将PEG 化 Hb 稀释到 4g/dl RL，pH 调整到 7.4±0.2。步骤5 -无菌填装在层流罩超净台中将最终的血液代用品组合物无菌过滤(0.2 μ m)，按重量分装到无菌玻璃瓶中，利用带有波纹密封圈的无菌胶塞密封，-80° C保存直至使用。实施例3MalPEG-Hb的牛理化学分析生理化学分析方法MalPEG-Hb血液代用品的均一性和分子大小由液相层析(LiquidChromatography, LC)表征。使用分析型LC评价PEG化血红蛋白的均一性以及未反应Mal-PEG的去除程度。使用540nm吸光度评价血红蛋白，通过峰位置分辩PEG化血红蛋白和未反应血红蛋白。使用280nm吸光度分辩PEG化血红蛋白和游离Mal-PEG，因MalPEG中的环结构而在紫外(ultraviolet, UV)光谱有吸收。使用快速扫描二极管阵列分光光度计(Milton Roy2000或Hewlett PackardModel8453)收集Soret和可见区光谱，利用多成分分析进行血红蛋白浓度和高铁血红蛋白百分t匕分析(Vandegriff, K.D.和 R.E.，Shrager.Evaluation of oxygen equilibriumbinding to hemoglobin by rapid-scanning spcetrophotometry and singular valuedecomposition.Meth.Enzymo1.232:460-485(1994)。 使用联合血氧定量计测定MalPEG-Hb浓度和高铁血红蛋白百分比。使用流变仪测定粘度。使用胶体渗透压计测定胶体渗透压。根据氧平衡曲线测定氧结合参数。优选的血液代用品组合物规范(specification)列于下表1:表I
权利要求
1.包含修饰的血红蛋白和含水稀释剂的药学组合物，其中该修饰的血红蛋白是已经通过对于血红蛋白分子上的暴露的氨基酸侧链的巯基基团的巯基反应性部分共价连接聚环氧烷的血红蛋白，而同时该血红蛋白处于氧合状态；聚环氧烷通过选自亚烃基或亚胺基的接头连接至巯基反应性部分；以及其中在37° (:，？!17.4测量时，该修饰的血红蛋白的？50低于 15torr。
2.权利要求1的组合物，其中聚环氧烷是聚环氧乙烷、聚环氧丙烷或聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物。
3.权利要求1的组合物，其中聚环氧烷是聚乙二醇。
4.权利要求1的组合物，其中聚环氧烷是依据通式H(OCH2CH2)nOH的聚乙二醇，其中η大于或等于4。
5.权利要求1的组合物，其中巯基反应性部分是马来酰亚胺。
6.权利要求1或5的组合物，其中该修饰的血红蛋白具有通式:Hb- (S-Y-R-CH2-CH2- [O-CH2-CH2] n-0-CH3) m 其中: Hb是血红蛋白； S是血红蛋白的疏基； Y是琥珀酰亚胺基； R是烷基或亚苯基； η定义聚合物长度并且大于或等于4 ；以及 m是连接至四聚体血红蛋白的聚乙二醇聚合物的数量。
7.权利要求6的组合物，其中m为4-5。
8.权利要求1一 7中任一项的组合物，其中在修饰前，所述血红蛋白已经被巯基化。
9.权利要求1一 8中任一项的组合物，其高铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10。
10.权利要求1一 9中任一项的组合物，其中所述修饰的氧合血红蛋白的P50小于IOtorr (1333Pa)。
11.权利要求1一 9中任一项的组合物，其中所述修饰的氧合血红蛋白的P50小于7torr (933Pa)。
12.权利要求1一 11中任一项的组合物，其在24°C具有高铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10，并且所述修饰的血红蛋白的P50小于lOtorr。
13.权利要求1一 12中任一项的组合物，其中所述血红蛋白来自人、牛、猪或马，或者是重组血红蛋白。
14.权利要求1一 12中任一项的组合物，其中各巯基反应性部分连接至红蛋白表面上的其它巯基或连接至红蛋白中天然P93Cys巯基。
15.权利要求1的组合物，其中血红蛋白的浓度是0.1 - 4.0g/dl。
16.权利要求1一 15中任一项的血液代用品产品，其在人或动物体的处理或治疗方法中的用途。
全文摘要
本发明涉及血液制品，更特别涉及包含具有高氧亲和力的修饰氧合血红蛋白的组合物以及制备该组合物的方法。本发明的组合物具有较好的自身氧化稳定性以及优良的携氧特征。
文档编号A61P7/08GK103203013SQ20131009102
公开日2013年7月17日 申请日期2003年1月10日 优先权日2002年1月11日
发明者R·M·温斯洛, K·D·万得格里夫 申请人:桑格特公司