CD146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物靶点的应用的制作方法与工艺

本发明涉及CD146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物靶点的应用。

背景技术：
缺血可引起多种代谢物质的缺乏，但最为紧急、损害最重的病变是由缺氧所致。在绝大多数情况下，缺血性病变的核心为缺氧性损害。大量研究报道，视网膜和脉络膜缺血、缺氧是缺血性眼部疾病的重要驱动因素，是导致视力下降和丧失的重要原因(1,2)。常见的该类眼部疾病包括早产儿视网膜病变（retinopathyofprematurity,ROP）、年龄相关性黄斑病变（age-relatedmaculardegeneration,AMD）、糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）、新生血管性青光眼（neovascularglaucoma,NVG）等。上述疾病在全球发病率呈上升趋势，是儿童、成年人和老年人各年龄段致盲的首要原因(3-6)。氧诱导的视网膜病变小鼠和大鼠模型（OIR）是经典的缺血性眼部疾病的动物模型。OIR模型诱导过程中，鼠眼睛组织内的缺血缺氧导致眼底血管异常成簇状生长，血管迂曲、扩张和渗漏。这些缺血性眼部病变会导致眼底出血、视力模糊和视野缺失等临床症状。（2，7）CD146是一种细胞粘附分子，CD146是I型膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。1.DorrellM,Uusitalo-JarvinenH,AguilarE,FriedlanderM.2007.Ocularneovascularization:basicmechanismsandtherapeuticadvances.SurvOphthalmol52Suppl1:S3-19.2.SapiehaP,JoyalJS,RiveraJC,Kermorvant-DucheminE,SennlaubF,HardyP,LachapelleP,ChemtobS.2010.Retinopathyofprematurity:understandingischemicretinalvasculopathiesatanextremeoflife.JClinInvest120:3022-3032.3.GilbertC.2008.Retinopathyofprematurity:aglobalperspectiveoftheepidemics,populationofbabiesatriskandimplicationsforcontrol.EarlyHumDev84:77-82.4.XuJ,WeiWB,YuanMX,YuanSY,WanG,ZhengYY,LiYB,WangS,XuL,FuHJ,ZhuLX,PuXL,ZhangJD,DuXP,LiYL,JiY,GuXN,LiY,PanSF,CuiXL,BaiW,ChenYJ,WangZM,ZhuQS,GaoY,LiudeY,JiYT,YangZ,JonasJB.2012.Prevalenceandriskfactorsfordiabeticretinopathy:theBeijingCommunitiesDiabetesStudy6.Retina32:322-329.5.CheungCM,TaiES,KawasakiR,TayWT,LeeJL,HamzahH,WongTY.2012.Prevalenceofandriskfactorsforage-relatedmaculardegenerationinamultiethnicAsiancohort.ArchOphthalmol130:480-486.6.OlmosLC,LeeRK.2011.Medicalandsurgicaltreatmentofneovascularglaucoma.IntOphthalmolClin51:27-36.7.GrossniklausHE,KangSJ,BerglinL.2010.Animalmodelsofchoroidalandretinalneovascularization.ProgRetinEyeRes29:500-519.

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种CD146作为靶点在制备预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物中的应用。上述应用中，所述缺血性眼部疾病可为早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑病变或新生血管性青光眼。上述应用中，所述缺血性眼部疾病可为缺血性眼底病变。上述应用中，所述缺血性眼底病变可为视网膜病变或脉络膜病变。上述应用中，所述视网膜病变可为视网膜血管迂曲扩张或视网膜血管渗漏或视网膜出血。上述应用中，所述视网膜病变可为视网膜血管新生或视网膜血管从视网膜迁移到玻璃体腔。上述应用中，所述脉络膜病变可为脉络膜血管迂曲扩张或脉络膜血管渗漏或脉络膜出血。上述应用中，所述脉络膜病变可为脉络膜血管新生。本发明首次提出CD146是缺血性眼部疾病的药物靶点。实验证明，CD146在患有缺血性眼部疾病小鼠的视网膜中过度表达；而CD146被特异性敲除后能够显著抑制发病小鼠视网膜血管的迂曲、扩张和渗漏，进而减轻疾病的严重程度。抗CD146的抗体AA98及抑制其表达的microRNAmiR-329也能有效预防和治疗缺血性眼部疾病。AA98或miR-329能够减轻发病鼠的视网膜血管迂曲扩张、渗漏以及血管呈簇状异常生长的严重程度,使视网膜形态与结构正常化，从而缓解眼底出血、视力模糊和视野缺失等临床症状，并抑制疾病的发生发展。这些结果表明CD146是缺血性眼部疾病的重要治疗靶点，对今后的该类疾病的药物开发和预防治疗具有重要意义。附图说明图1为正常小鼠和OIR模型小鼠的视网膜表型，显示OIR小鼠模型构建成功。图2为在OIR小鼠的视网膜中，CD146的mRNA表达显著上调。图3为在OIR小鼠的视网膜中，CD146的蛋白表达显著上调。图4为CD146基因特异性敲除后能够明显减轻OIR小鼠的发病程度。图5为miR-329基因治疗显著抑制OIR小鼠视网膜血管的迂曲、扩张和出血。图6为miR-329基因治疗能够抑制OIR小鼠视网膜中CD146的过度表达。图7为抗CD146抗体AA98能够预防OIR小鼠疾病的发生发展。图8为抗CD146抗体AA98治疗能够显著减轻OIR小鼠的发病程度。图9为抗CD146抗体AA98能够特异性识别CD146。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中进行的视网膜荧光铺片实验均按照如下步骤进行：1、将小鼠麻醉，左心室心脏灌流600μl50mg/ml的FITC荧光标记的dextran，此时小鼠的全身血管都灌注有荧光分子。2、将小鼠的眼睛剥离，4%多聚甲醛固定1小时。3、剥离视网膜，并用剪刀剪成四叶草状。用体式荧光显微镜观察并拍照。实施例1、CD146在患有缺血性眼部疾病的小鼠视网膜上过度表达一、构建OIR小鼠模型我们以氧诱导的视网膜病变小鼠（OIR小鼠）为缺血性眼部疾病的动物模型。将出生后第7天的C57BL/6J乳鼠（P7）和母鼠放入含75%氧气的高氧培养箱中5天，在第12天（P12）将其从氧箱中取出，放在正常氧气（21%氧气）中饲养，造成相对低氧的环境。在第17天（P17）的乳鼠即为模型鼠。将正常鼠（未经任何诱导的C57BL/6J小鼠）和模型鼠进行视网膜荧光铺片实验。结果如图1所示。结果显示，与正常鼠相比，模型鼠（OIR）的视网膜血管呈现明显的迂曲、扩张和渗漏，并成血管簇状异常生长。视网膜血管的荧光渗漏点表示视网膜出血严重。以上视网膜形态结构的异常表示模型构建成功。二、CD146的实时荧光定量PCR将出生后第17天（P17）的模型鼠和正常鼠的视网膜剥离，利用实时荧光定量PCR对CD146进行定量分析。（一）取P17的模型鼠的两个视网膜为一个样品，每个样品加入1mlTrizol，用匀浆器将视网膜打碎，室温放置5分钟。同样取正常鼠的两个视网膜为一个样品进行上述处理。（二）将两个样品分别移入EP管，每管加入200μl三氯甲烷，用手上下颠倒EP管使管中的液体乳化。（三）将EP管4℃，12000rpm离心15分钟。（四）分别将上层透明液体转移至新管，加入一倍体积的预冷异丙醇混匀，-20℃静置2小时。（五）4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。（六）将沉淀分别用70%乙醇洗一次并再次离心，得到两种沉淀，即P17的模型鼠和正常鼠的视网膜RNA。将两种沉淀晾干。（七）分别加入适量无RNA酶的水溶解RNA。（八）分别取2μgP17的模型鼠和正常鼠的RNA反转录为cDNA。（九）利用两种cDNA进行实时荧光定量PCR（方法按照SYBRgreenPCRmastermix试剂盒的说明书），GAPDH作为表达内参。PCR扩增条件：95℃，5分钟；95℃30s，55℃30s，72℃20s，40个循环。（十）用2-△△Ct方法进行定量分析。结果如图2所示。结果表明，与正常鼠相比，P17模型鼠的视网膜中CD146的mRNA的表达明显上调。三、Western-blot检测CD146蛋白表达量。结果如图3所示，显示p17模型鼠的视网膜中CD146的蛋白的表达明显上调。GADPH为表达内参。实施例2、CD146基因特异性敲除抑制缺血性眼部疾病的发生发展CD146内皮特异性敲除小鼠（CD146EC-KO）是将正常C57BL/6J小鼠中的CD146编码基因敲除得到的小鼠，该小鼠在“DuanH,XingS,LuoY,FengL,GramagliaI,ZhangY,LuD,ZengQ,FanK,FengJ,YangD,QinZ,CouraudPO,RomeroIA,WekslerB,YanX.2013.TargetingendothelialCD146attenuatesneuroinflammationbylimitinglymphocyteextravasationtotheCNS.SciRep3:1687.”中公开过。本实施例中的非敲除小鼠（WT）为野生型的C57BL/6J小鼠，记作正常鼠。一、将CD146特异性敲除小鼠（CD146EC-KO）和非敲除小鼠（WT）均构建OIR模型。方法如实施例1的步骤一。二、视网膜荧光铺片实验。图4所示为正常CD146EC-KO、正常WT，OIR-CD146EC-KO和OIR-WT的视网膜表型。结果表明，与WT小鼠相比，OIR-WT小鼠的视网膜血管呈现明显的迂曲、扩张和渗漏并成血管簇状异常生长，视网膜出血严重。与OIR-WT小鼠相比，OIR-CD146EC-KO小鼠视网膜血管迂曲、扩张、渗漏和异常成簇状生长的严重程度明显减轻，视网膜出血症状也减轻，呈现较好的视网膜形态。上述实验表明，CD146被敲除后能够有效减缓OIR小鼠疾病的严重程度，揭示CD146在缺血性眼部疾病视网膜中的过度表达能够促进疾病的发展。实施例3、miR-329能够有效治疗缺血性眼部疾病一、构建OIR小鼠疾病模型：与实施例1中步骤一相同。二、miR-329注射后显著减轻了OIR小鼠疾病的严重程度在乳鼠出生后第12天，将修饰过的鼠miR-329（5μg/ul，1μl）、对照miRNA（5μg/μl，1μl）或溶剂对照0.9%NaCl（1μl）的水溶液注射到乳鼠眼睛玻璃体腔内。在第17天，对乳鼠视网膜进行荧光铺片分析。小鼠miR-329序列：5’-AACACACCCAGCUAACCUUUUU-3’（SEQIDNo.1）；对照miRNA为线虫miR-239b，与人、小鼠、大鼠的miRNA具有最小同源性。对照miRNA序列：5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’（SEQIDNo.2）；以下实验均使用双链的小鼠miR-329和对照miRNA，并分别对其序列进行如下修饰：2’-甲氧基修饰，硫代硫酸骨架修饰和序列5’端连接胆固醇。上述修饰过的小鼠miR-329序列和修饰过的对照miRNA序列均购自广州锐博生物公司。视网膜荧光铺片结果如图5所示，结果显示，与对照miRNA或溶剂对照0.9%NaCl相比，miR-329注射组小鼠的视网膜呈现较好的结构，表现为显著减少的视网膜血管的迂曲、扩张及视网膜出血点的面积。这种视网膜形态的正常化，可以缓解眼底出血、视力模糊和视野缺失等临床症状，减轻疾病的发病程度。三、miR-329注射后抑制体内CD146的过度表达检测视网膜组织中CD146蛋白的相对表达量。结果如图6所示，表明miR-329可以显著抑制OIR小鼠视网膜中CD146的过度表达。综合以上结果，抑制CD146表达的miR-329基因治疗可以显著减轻缺血性眼部疾病的严重程度，揭示CD146是该疾病的重要靶点。实施例4、抗CD146抗体预防和治疗缺血性眼部疾病本实施例中使用的抗体AA98见专利“CN1124284C”。抗体重链和轻链可变区的序列分别见专利第2页和第3页。一、抗CD146抗体AA98预防OIR大鼠疾病的发生发展（一）构建OIR大鼠疾病模型将出生后第7天的SD大鼠乳鼠（P7）和母鼠放入含75%氧气的高氧培养箱中5天，在第12天（P12）将其从氧箱中取出，放在正常氧气（21%）中饲养，造成相对低氧的环境，继续饲养。在第18天（P18）的乳鼠即为模型鼠。（二）玻璃体腔注射在乳鼠出生后第7天，将AA98（1μg/μl，1μl），对照mIgG（1μg/μl，1μl）分别注射到乳鼠的左、右眼睛的玻璃体腔内，再按照构建OIR大鼠模型的构建方法进行饲养，即为AA98组实验鼠和mIgG组实验鼠。不注射的乳鼠按照OIR大鼠模型的构建方法进行饲养，即为模型鼠。在第18天将AA98组、mIgG组、模型鼠和正常鼠，分别剥离眼球进行实验。（三）视网膜荧光铺片实验实验结果如图7所示。结果表明，与正常鼠相比，模型鼠（OIR）的视网膜血管呈现明显的迂曲、扩张和渗漏。视网膜血管的荧光渗漏点表示视网膜出血严重。以上视网膜形态结构的异常表示模型构建成功。与mIgG组和模型组相比，AA98注射组显著减轻了视网膜血管的迂曲、扩张和渗漏，显著减轻了视网膜出血，使其形态结构正常化。图7中ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ展示了不同拍照视野下小鼠视网膜的表型。这些结果表明AA98可以有效预防缺血性眼部疾病的发生发展。二、抗CD146抗体AA98治疗能够有效减轻OIR大鼠疾病的严重程度。（一）构建OIR大鼠模型：与实验一中相同。（二）玻璃体腔注射在乳鼠出生后第15天，将1μl1μg/μl的AA98，对照mIgG（1μg/μl，1μl）分别注射到乳鼠的左、右眼睛的玻璃体腔内，再将注射后的鼠按照OIR大鼠模型的构建方法进行饲养即为AA98组实验鼠和mIgG组实验鼠。不注射的乳鼠按照OIR大鼠模型的构建方法进行饲养即为模型鼠。在第20天将AA98组、mIgG组、模型鼠和正常鼠，分别剥离眼球进行实验。（三）视网膜荧光铺片实验方法如实施例2的步骤三。实验结果如图8所示。结果表明，与模型组和mIgG组相比，AA98注射后显著减轻了视网膜血管的迂曲和扩张，并且减轻了视网膜出血。这种视网膜形态结构的正常化，可以缓解眼底出血、视力模糊和视野缺失等临床症状，减轻疾病的严重程度。图8中ⅰ、ⅱ展示了不同拍照视野下小鼠视网膜的表型。这些结果表明AA98可以有效治疗缺血性眼部疾病。三、抗CD146抗体AA98特异性识别CD146用免疫印迹方法检测抗体AA98对鼠内皮瘤细胞系SEND中CD146的识别。结果如图9所示，显示抗体AA98仅能识别CD146，说明抗体AA98是特异作用于CD146的。图中，抗CD146的抗体AA7为正对照；二抗交叉为不加一抗，只加二抗的负对照，排除了AA98对CD146识别的非特异性。综合以上结果，进一步确定了以CD146作为靶点可以有效预防和治疗缺血性眼部疾病，CD146是缺血性眼部疾病的一个重要靶点。