用于治疗创伤性脑损伤和用于调节神经原性细胞迁移的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本文公开了通过移植细胞来治疗创伤性脑损伤的方法，所述细胞源于表达外源Notch细胞内结构域的骨髓粘附干细胞。经移植的细胞形成通路，内源神经原性细胞沿所述通路进行增殖并且从脑室下区迁移至损伤位点。
【专利说明】用于治疗创伤性脑损伤和用于调节神经原性细胞迁移的方 法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月16日提交的美国临时专利申请号61/647, 893 (其说明书 和附图通过提及而以其整体合并入本文以用于所有目的）的权益。
[0003] 关于联邦政府资助的声明
[0004] 本文中所描述的研宄中的一些得到来自国家神经学病症和中风研宄所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke)的拨款的资助。美国政府可能享有 在本文所公开的发明中的某些权利。 发明领域
[0005] 本公开内容为用于神经学病症的细胞疗法的领域。
[0006] 发明背景
[0007] 最初用于深入检验细胞发育\干细胞已经成为再生医学（包括用于治疗神经学病 症的基于细胞的疗法）的基石 2'3。干细胞甚至存在于成年期中8,并且具有自我更新和分化 成多种谱系 9,促进正常的内环境稳定1(1，和内源地1H4或者在移植入受损伤的器官（即脑） 中之后 15_21发挥治疗益处的能力。侧脑室的脑室下区（SVZ)和海马齿状回的颗粒细胞下区 是成人脑中两个主要的干细胞小生境（niche) 22'23,尽管在其他脑区域中已经检测到静息神 经干细胞（NSCs)24。在损伤后诱导内源干细胞将会在再生医学中提供新的机会 2'3'&21。
[0008] 除了多能干细胞外的细胞也已经用于治疗中枢神经系统的病症。作为一个例子， 通过移植在缺血性损伤位点处或者在缺血性损伤位点附近，将SB623细胞（其为源自其中 已经表达了外源Notch细胞内结构域的骨髓粘附干细胞的细胞）用于治疗中风。参见例如， 美国专利号 8, 092, 792,和 Yasuhara 等人，（2009)Stem Cells Devel. 18:1501-1513。美国 专利号7, 682, 825描述了 SB623细胞在许多中枢和周围神经系统病症的治疗之中的另外用 途。
[0009] 尽管有这些科学进展和一些初步的临床研宄但是在我们对于细胞疗法的了 解中的根本缺口是关于经移植的细胞促进受损的神经组织修复的机制的知识。迄今为止， 在血液学和非血液学病症中提供治疗益处方面，增加的移植物存活和移植物持久存在已经 被认为是成功的细胞移植疗法的关键。因此，许多努力指向延长经移植的细胞的存活和持 久存在。因此，不要求持久存在大量经移植的细胞的用于有效细胞疗法的方法将会是有利 的。
[0010] 创伤性脑损伤（TBI)是指由于外部机械力而引起的对脑的损害。除了其他原因 夕卜，TBI尤其可以由于跌倒、火器伤、运动事故、建筑事故和交通事故而引起。TBI的受害者 可能会遭受到许多身体、认知、社交、情感和/或行为的紊乱。
[0011] 对于逆转TBI的初始物理损害，几乎没有什么可以做的。因此，治疗选项主要在于 用于在急性期中防止进一步损害的稳定化，和之后的康复。由于这些有限的选项，因而需要 另外的用于治疗TBI的方法和组合物。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明人已发现，SB623细胞（即源自其中已经表达了外源Notch细胞内结构域 的骨髓粘附干细胞的细胞）的移植可以用于治疗创伤性脑损伤（TBI)。相比于仅接受载料 注射的因创伤而受损伤的动物而言，在TBI后接受SB623移植体的动物展示出显著经改善 的运动和神经学功能，以及与之相关联的显著降低的对于皮层核心和损伤周围皮层区域的 损害。
[0014] 发明人还已经发现，与预期相反，SB623细胞移植的治疗益处并不需要大量经移植 的细胞的存活和持久存在。令人惊异地，可以通过最小和短期的移植物存活（其足以引发 强大且稳定的功能恢复）来获得治疗益处。这解决了两个主要问题：对于充足供应可移植 的细胞的需要和对于长期移植物存活的需要。
[0015] 发明人还已经发现，SB623细胞移植在TBI治疗中的有益效应是由于在脑室下区 (SVZ)中的神经原性小生境和受损伤的脑位点之间形成生物学桥（"生物桥"(biobridge)) 而引起的。已经通过免疫组织化学方式可视化并经激光捕获的这种生物桥最初表达高水平 的细胞外基质金属蛋白酶，并且其特征在于经移植的细胞流。在移植后的时间里，经移植的 细胞被新形成的宿主细胞替代，并且几乎没有经移植的细胞保留在生物桥中。因此，经移植 的SB623细胞最初在神经原性SVZ和受损伤的皮层之间形成通路，所述通路促进宿主神经 原性细胞稍后从神经原性小生境向脑损伤位点迀移。
[0016] 该连续的事件揭示了用于治疗TBI的新方法，即移植SB623细胞，其形成用于引导 宿主神经原性细胞迀移的瞬时通路。也就是说，经移植的SB623细胞最初在神经原性小生 境和损伤位点之间形成生物桥；但一旦该生物桥形成，经移植的细胞被迀移至损伤位点的 宿主神经原性细胞所替代。这些发现揭示，宿主细胞从神经原性小生境向受损伤的脑位点 的长距离迀移可以通过经移植的SB623细胞来实现，所述经移植的SB623细胞用作用于引 发内源修复机制的生物桥。
[0017] 因此，本公开内容尤其提供了下列实施方案：
[0018] 1.用于在受试者中治疗创伤性脑损伤的方法，所述方法包括向所述受试者的脑施 用治疗有效量的SB623细胞，其中所述SB623细胞通过下述方式来获得：（a)提供骨髓粘附 干细胞（MSCs)的培养物；(b)将步骤（a)的细胞培养物与包含编码Notch细胞内结构域 (NICD)的序列的多核苷酸相接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；（c)选择包含 步骤（b)的多核苷酸的细胞；和（d)在不进行选择的情况下进一步培养步骤（c)的所选择 出的细胞。
[0019] 2.实施方案1的方法，其中所述受试者为人。
[0020] 3.实施方案1或2的方法，其中所述MSCs从人获得。
[0021] 4.用于移植到受试者中以治疗创伤性脑损伤的细胞，其中所述细胞通过包括下列 步骤的过程来获得：(a)提供MSCs的培养物；(b)将步骤（a)的细胞培养物与包含编码NICD 的序列的多核苷酸相接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；（c)选择包含步骤 (b)的多核苷酸的细胞；和（d)在不进行选择的情况下进一步培养步骤（c)的所选择出的 细胞。
[0022] 5.实施方案4的细胞，其中所述受试者为人。
[0023] 6.实施方案4或5的细胞，其中所述MSCs从人获得。
[0024] 7.用于诱导内源神经原性细胞从神经原性小生境向脑损伤位点迀移的方法，所述 方法包括向受试者的脑施用治疗有效量的SB623细胞，其中所述SB623细胞通过下述方式 来获得：(a)提供MSCs的培养物；(b)将步骤（a)的细胞培养物与包含编码Notch细胞内结 构域（NICD)的序列的多核苷酸相接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；（c)选 择包含步骤（b)的多核苷酸的细胞；和（d)在不进行选择的情况下进一步培养步骤（c)的 所选择出的细胞。
[0025] 8.实施方案7的方法，其中所述神经原性小生境为脑室下区。
[0026] 9.实施方案7或8的方法，其中所述脑损伤为创伤性脑损伤。
[0027] 10.实施方案7-9中任一项的方法，其中所述受试者为人。
[0028] 11.实施方案7-10中任一项的方法，其中所述MSCs从人获得。
[0029] 12.用于在受试者中刺激神经原性细胞增殖的方法，所述方法包括向受试者的脑 施用治疗有效量的SB623细胞，其中所述SB623细胞通过下述方式来获得：(a)提供MSCs的 培养物；(b)将步骤（a)的细胞培养物与包含编码Notch细胞内结构域（NICD)的序列的多 核苷酸相接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；（c)选择包含步骤（b)的多核苷 酸的细胞；和（d)在不进行选择的情况下进一步培养步骤（c)的所选择出的细胞。
[0030] 13.实施方案12的方法，其中所述脑损伤为创伤性脑损伤。
[0031] 14.实施方案12或13的方法，其中所述受试者为人。
[0032] 15.实施方案12-14中任一项的方法，其中所述MSCs从人获得。
[0033] 16.用于在受试者中诱导神经原性细胞进行增殖并向脑损伤位点迀移的方法，所 述方法包括向受试者的脑施用治疗有效量的SB623细胞，其中所述SB623细胞通过下述方 式来获得：(a)提供MSCs的培养物；(b)将步骤（a)的细胞培养物与包含编码Notch细胞 内结构域（NICD)的序列的多核苷酸相接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；（c) 选择包含步骤（b)的多核苷酸的细胞；和（d)在不进行选择的情况下进一步培养步骤（c) 的所选择出的细胞。
[0034] 17.实施方案16的方法，其中所述脑损伤为创伤性脑损伤。
[0035] 18.实施方案16或17的方法，其中所述受试者为人。
[0036] 19.实施方案16-18中任一项的方法，其中所述MSCs从人获得。
[0037] 附图简述
[0038] 图1显示了在大鼠中"抬高身体摆动测试"(elevated body swing test，EBST)的 结果。提供了基线（在TBI前）以及在TBI后7天、I个月、2个月和3个月的值。大鼠接 受SB623细胞移植体（"细胞"，每对中最右边的柱）或者载料输注（"载料"，每对中最左 边的柱表明了统计学显著性，P<〇.〇5。
[0039] 图2显示了在经历了 TBI并随后接受SB623细胞移植体（"细胞"）或者载料输注 ("载料"）的大鼠中的改进的Bederson神经学检查的平均得分。提供了基线（在TBI前） 以及在TBI后7天、1个月、2个月和3个月的值。每对中最左边的柱表示在输注了载料的 大鼠中的得分；每对中最右边的柱表示在接受了 SB623细胞移植体的大鼠中的得分。" " 表明了统计学显著性，P < 〇. 05。
[0040] 图3显示了大鼠能够保持在Rotorod装置上的秒数的平均值。大鼠经历了实验性 TBI，并随后接受SB623细胞移植体（"细胞"）或者载料输注（"载料"）。提供了基线（在 TBI前）以及在TBI后7天、1个月、2个月和3个月的值。每对中最左边的柱表示在输注 了载料的大鼠中的得分；每对中最右边的柱表示在接受了 SB623细胞移植体的大鼠中的得 分。表明了统计学显著性，ρ<〇·〇5。
[0041] 图4Α和4Β显示了在经历了 TBI的大鼠中对于皮层核心（"核心"）以及对于在冲 击位点中和周围的皮层区域（"损伤周围"）的损害的检验的结果。图4Α显示了来自接受 SB623细胞移植体的大鼠（图版a-d)的脑的Η&Ε切片，相比于接受载料输注的大鼠（图版 al-dl)而言。在图4B中，将结果表示为相对于经历了 TBI并接受载料输注的动物而言的损 伤区域的百分比（参见实施例8)。每对中最左边的柱显示了核心区域的值；每对中最右边 的柱显示了损伤周围区域的值。
[0042] 图5显示了在TBI后1个月和3个月时，相比于经历了 TBI并接受载料输注的动物 而言，在经历了 TBI并接受SB623细胞移植体的动物的脑室下区（"SVZ"）和皮层（"CTX"） 中经Ki67标记的细胞的水平。" "表明了每高倍视野中所观察到的经标记的细胞的数目 的在统计学上显著的增加 （P < 〇. 05)。
[0043] 图6显示了在TBI后1个月和3个月时，相比于经历了 TBI并接受载料输注的动物 而言，在经历了 TBI并接受SB623细胞移植体的动物的脑室下区（"SVZ"）和皮层（"CTX"） 中经巢蛋白标记的细胞的水平。" "表明了每高倍视野中所观察到的经标记的细胞的数目 的在统计学上显著的增加 （P < 〇. 05)。
[0044] 图7显示了在TBI后1个月和3个月时，相比于经历了 TBI并接受载料输注的动 物而言，在经历了 TBI并接受SB623细胞移植体的动物的胼胝体（"CC"）和皮层（"CTX"） 中经双皮质素标记的细胞的水平。表明了每高倍视野中所观察到的经标记的细胞的数 目的在统计学上显著的增加 （P < 〇. 05)。
[0045] 图8显示了在TBI后1个月和3个月时，在来自经历了实验性TBI的大鼠脑的经 激光捕获的生物桥的匀浆物中的分解活性。将活性表示为相对于〇. 5ng重组MMP-9而言的 光密度单位，其通过扫描酶谱法凝胶来获得。在所述2组的各具有3条柱的每一组中，最左 边的柱表示在来自在TBI后输注载料的大鼠的生物桥中的相对活性，中间的柱表示在来自 在TBI后移植SB623细胞的大鼠的生物桥中的相对活性，和最右边的柱表示在来自对照即 进行假手术的大鼠的生物桥中的相对活性。
[0046] 发明详述
[0047] 本文公开了用于治疗创伤性脑损伤（TBI)的方法和组合物。本文还公开了用于调 节在脑中干细胞（例如，神经干细胞，神经元干细胞）的迀移的方法和组合物。
[0048] 发明人已经得到了令人惊讶的发现：在TBI后由于细胞移植而引起的行为和组织 学改善不要求大规模的移植物存活或长期的移植物持久存在。实际上，对于产生这些治疗 益处来说仅需要适度的、短期的移植物存活。因此，发明人揭示了需要阈值剂量的经移植的 细胞的用于神经修复的新方法，所述经移植的细胞不需要在脑中持久存在，并且能够诱导 SVZ产生新细胞和将新细胞推动至受冲击的皮层区域。因此，移植最小有效剂量和经移植的 细胞的短期存活足以引发用于消除大量脑损伤的错综复杂的内源修复机制。
[0049] 除非另有指明，本公开内容的实践使用了在细胞生物学、毒理学、分子生物学、生 物化学、细胞培养、免疫学、神经学、手术和重组DNA的领域以及相关领域中的标准方法和 常规技术，其在本领域的技能之内。这样的技术描述在文献中，并由此对于本领域技术人员 来说是可获得的。参见例如Alberts，B.等人，"Molecular Biology of the Cell"，第5版， Garland Science，New York，NY，2008 ;Voet，D.等人，"Fundamentals of Biochemistry : Life at the Molecular Level"，第 3 版，John Wiley & Sons，Hoboken，NJ，2008 ; Sambrook，J.等人，"Molecular Cloning :A Laboratory Manual"，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 ；Ausubel, F.等人，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley & Sons，New York，1987,及定期更新；Freshney，R. I. ,"Culture of Animal Cells ：A Manual of Basic Technique''，第 4 版，John Wiley & Sons，Somerset， NJ，2000;和 "Methods in Enzymology" 丛书，Academic Press，San Diego, CA0
[0050] 骨髓粘附干细胞（MSCs)
[0051] 本公开内容提供了用于在受试者中通过向脑损伤位点移植SB623细胞来治疗TBI 和调节干细胞迀移的方法。通过在MSCs中表达Notch蛋白的细胞内结构域而从骨髓粘附 干细胞（MSCs)(也称为骨髓粘附基质细胞和间充质干细胞）获得SB623细胞。通过从骨髓 中选择粘附细胞（即，粘附至组织培养塑料制品的细胞）而获得MSCs。
[0052] MSCs的示例性公开内容提供在美国专利申请
【发明者】C·V·博兰干, C·C·凯斯 申请人:桑比欧公司, 南佛罗里达大学