具有抗菌活性的多肽混合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物学领域，具体地涉及一种第一酶促活性结构域的源与第二酶促活性结构域的源的组合并且涉及包含所述组合的组合物。本发明进一步涉及一种用作药物的包含所述组合的组合物，涉及所述组合物作为抗微生物剂的用途并且涉及一种用于控制食品产品或饲料产品中、食品或饲料加工设备上和/或食品或饲料加工设备中、食品或饲料容器上和/或食品或饲料容器中的微生物污染的方法。
【专利说明】具有抗菌活性的多肽混合物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学领域，具体地涉及第一酶促活性结构域的源与第二酶促活性 结构域的源的组合、多肽、多核苷酸并且涉及包含所述组合、多肽和/或多核苷酸的组合 物。本发明进一步涉及一种用作药物的包含所述组合、多肽和/或多核苷酸的组合物，涉及 所述组合物、多肽和/或多核苷酸作为抗微生物剂的用途并且涉及一种用于控制食品产品 或饲料产品中、食品或饲料加工设备上和/或中、食品或饲料容器上和/或中的微生物污染 的方法。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一种经常造成严重传染性疾病和食 物中毒的主要的人类病原体。其治疗因为不断出现抗生素耐药菌株而变得越来越困难。来 自感染了金黄色葡萄球菌的噬菌体的内溶素（endolysin)已显示出潜在地将这些病原体 控制在一定程度上并且可以用于它们的特异性检测。在大多数情况下，靶向葡萄球菌物种 的内溶素的应用中的主要障碍是低酶活性、难以大批量生产和/或蛋白质稳定性。
[0003] 因此，仍然需要在例如抗微生物活性和/或稳定性上具有改善特性的新抗微生物 剂。
【发明内容】
[0004] 在第一方面，本发明提供了第一酶促活性结构域的源与第二酶促活性结构域的 源的组合（combination),其中所述第一和第二酶促活性结构域表现出不同的（独特的， distinct)革巴键（祀向键合，target bond)特异性并且被包含在不同的第一和第二多肽上， 艮P，所述第一酶促活性结构域被包含在第一多肽上并且所述第二酶促结构域被包含在第二 多肽上，其中所述第一和第二多肽各自具有不同的氨基酸序列。此外，本发明提供了第一酶 促活性结构域的源、第二酶促活性结构域的源与第三酶促活性结构域的源的组合，其中所 述第一、第二和第三酶促活性结构域表现出不同的靶键特异性并且被包含在不同的第一、 第二和第三多肽上，即，所述第一酶促活性结构域被包含在第一多肽上，所述第二酶促结构 域被包含在第二多肽上，并且所述第三酶促结构域被包含在第三多肽上，其中所述第一、第 二和第三多肽各自具有不同的氨基酸序列。此外，本发明提供了第一酶促活性结构域的源、 第二酶促活性结构域的源、第三酶促活性结构域的源与另外的酶促活性结构域的源的组 合，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域表现出不同的靶键特异性并且被包 含在不同的第一、第二、第三和另外的多肽上，即，所述第一酶促活性结构域被包含在第一 多肽上，所述第二酶促结构域被包含在第二多肽上，所述第三酶促结构域被包含在第三多 肽上，并且所述另外的酶促活性结构域被包含在另外的多肽上，其中所述第一、第二、第三 和另外的多肽各自具有不同的氨基酸序列。另外的酶促活性结构域在本文中指的是第四、 第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多的酶促活性结构域，优选第四酶促活性结构域。另 外的多肽在本文中指的是第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多的多肽，优选第四 多肽。
[0005] 表现出肽聚糖水解酶活性的大多数天然金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素由 C-末端细胞壁结合结构域（CBD)、中央的N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶结构域 (N-acetylmuramoyl-L-Alanine amidase domain)以及具有半胱氨酸、组氨酸依赖性酰 胺水解酶/肽酶（CHAP)同源性的N-末端丙氨酰-甘氨酰肽链内切酶结构域组成，或在 Ply2638的情况下由具有肽酶_M23同源性的N-末端甘氨酰-甘氨酸肽链内切酶结构域组 成，表现出肽聚糖水解酶活性的后三个结构域各自具有不同的靶键特异性并且在本文中一 般地被称为酶促活性结构域。在本发明的范围内，根据本发明的第一酶促结构域具有水解 特异靶键的催化活性，该特异靶键不同于被本发明的第二和可选的第三和/或另外的酶促 活性结构域水解的靶键。此外，在本发明的范围内，根据本发明的第二酶促结构域具有水解 特异靶键的催化活性，该特异靶键不同于被本发明所述的第一和可选的第三和/或另外的 酶促活性结构域水解的靶键。
[0006] 本发明人们惊奇地发现，同时应用两种以上具有不同的靶键特异性的酶促活性结 构域赋予了协同效应。出人意料的是，这不仅当具有不同特异性的酶促活性结构域如同在 天然葡萄球菌内溶素中一样位于同一分子上时有效，并且当所述具有不同特异性的酶促活 性结构域被分离在不同的多肽上时也有效。
[0007] 使不同的酶促活性结构域位于分离的个体多肽上的益处是：所产生的多肽更小， 可更容易地生产。此外，这些更小的多肽在特定的环境中具有更好的扩散性并且可以更耐 降解并具有更高的热稳定性。另一个优点是，可以以最适合于水解具体细菌靶细胞的比率， 将位于独立的不同的多肽分子上的独立的不同的酶促活性结构域混合并汇集在可变组合 物中。可以通过使用来自于许多不同来源（包括噬菌体细胞溶素、细菌素、自溶素或任何其 他细胞壁溶解酶）的具有几乎任何靶键特异性的几乎任何功能性酶促活性结构域来增补 (supplement)和/或补充（complement)根据本发明的组合。
[0008] 在本发明的上下文中，'组合'是指第一酶促活性结构域的源和第二酶促活性结构 域的源被考虑并包括在内。此外，在本发明的上下文中，'组合'是指第一酶促活性结构域的 源、第二酶促活性结构域的源和可选的第三和/或另外的酶促活性结构域的源被考虑并包 括在内。每个源可以是与其他源在一起或一起存在或组合在一起或物理上接触以形成一种 单一组合物。可替代地，每个源可以被包含在不同的组合物中。然而，本发明提供的认识是， 需要或使用第一和第二酶促活性结构域的源两者以获得本文所定义的本发明的效果。如果 每个源不存在于相同的单一组合物中，那么可以顺序地或同时地使用每个源和/或包含本 发明所述的组合的源的各个不同的组合物。
[0009] '第一酶促活性结构域的源'、'第二酶促活性结构域的源'、'第三酶促活性结 构域的源'和'另外的酶促活性结构域的源'优选地包含基于蛋白质的（蛋白质类， protein-based)来源（即，多肽、蛋白质、蛋白质的消化和/或蛋白质或消化的片段）或非 基于蛋白质的（非蛋白质类，non protein-based)来源（即，编码蛋白质或衍生的肽或蛋 白质片段的核酸）。以下，我们定义了包括于本发明中的优选的第一酶促活性结构域的源、 第二酶促活性结构域的源、第三酶促活性结构域的源和另外的酶促活性结构域的源。由于 本发明涉及第一酶促活性结构域的源、第二酶促活性结构域的源和可选的第三和/或另外 的酶促活性结构域的源的组合，所以本文中定义的第一酶促活性结构域的源的每一个均可 以与本文中定义的第二和可选的第三和/或另外的酶促活性结构域的源的每一个进行组 合。本发明还包括使用基于蛋白质的第一酶促活性结构域的源与非基于蛋白质的第二和可 选的第三和/或另外的酶促活性结构域的源的组合，反之亦然。
[0010] 本文中定义的"酶促活性结构域"是具有裂解活性（细胞溶解酶的活性，lytic activity)、优选表现出肽聚糖水解酶活性的结构域。包含在根据本发明的不同的第一、第 二、第三和/或另外的多肽上的根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性结构 域的裂解活性可以由本领域技术人员熟知的方法来评估。在一个实施方式中，以分光光度 法通过测量底物细胞悬浮液的池度（turbidity)下降来评估裂解活性。通过测量595nm波 长下的光密度来评估浊度，通常当在595nm波长下培养物表现出至少0. 30D的光密度时， 将该培养物称为是混浊的。优选地，以分光光度法通过测量金黄色葡萄球菌悬浮液的浊度 的下降下评估裂解活性，其中通过分光光度（Libra S22, Biochrom)测量OD595来量化池度。 更优选地，在37°C下，在PBS缓冲液pH 7. 4、120mM氯化钠中，将200nM本文中识别的第一、 第二和/或第三多肽与由分光光度评估（Libra S22, Biochrom)具有1±0. 05的初始OD595 的金黄色葡萄球菌悬浮液一起孵育30min。通过从孵育30min前的所述OD595中减去孵育 30min后的OD 595来计算浊度的下降。在本发明的上下文中，当使用这种测定法时，如果检测 到至少10、20、30、40、50或60%的浊度下降，那么第一、第二和/或第三多肽可以被认为具 有裂解活性。优选地，检测到至少70%的浊度下降。优选地，本发明涉及第一、第二、第三 和/或另外的多肽，其表现出至少为30、40、50、60、70、80、90、100、150或200%或更多的裂 解活性，该裂解活性为由SEQ ID NO: 1编码的金黄色葡萄球菌噬菌体Φ2638a内溶素（由 SEQ ID N0:2识别的Ply2638内溶素）的裂解活性。
[0011] '表现出不同的靶键特异性'在本文中是指由任何根据本发明的第一、第二、第三 或另外的酶促活性结构域针对靶键表现出酶促活性，该靶键不同于由任何其他的所述第 一、第二、第三或另外的酶促活性结构域表现出酶促活性时所针对的靶键。
[0012] '被包含在不同的多肽上'在本文中是指任何所述第一、第二和可选的第三和/或 另外的酶促活性结构域被包含在多肽上，该多肽不同于任何其他的所述第一、第二和可选 的第三和/或另外的酶促活性结构域被包含在之上的多肽。
[0013] 根据本发明的多肽优选是分离的多肽。根据本发明的核酸优选是分离的核酸。根 据本发明的核酸构建体优选是分离的核酸构建体。
[0014] 在一个优选的实施方式中，根据本发明的多肽包含编码为易于纯化的标签（tag) 的序列。所述标签选自但不限于由FLAG-标签、聚（His)-标签、HA-标签和Myc-标签所组 成的群组。更优选地，所述标签是6xHis-标签。甚至更优选地，所述标签是与SEQ ID N0:74 同一的并且由SEQ ID NO: 73编码的N-末端6xHis-标签（本文中表示为HXa)。
[0015] 优选地，根据本发明的不同的靶键是细菌细胞的肽聚糖层中必不可少的键，优选 所述细菌细胞是葡萄球菌。在本文中，将革兰氏阳性细菌细胞的肽聚糖层中的必不可少的 键定义为所述肽聚糖中的键合（linkage)，该键合对于所述肽聚糖为所述细菌细胞提供形 状和耐渗透压冲击的刚性结构是必不可少的。优选地，革兰氏阳性细菌细胞的肽聚糖层 中的所述必不可少的键是主干肽（stem peptide)的D-丙氨酸与横桥肽（cross-bridge P印tide)的甘氨酸之间的键（本文中也定义为N-末端丙氨酸与甘氨酸之间的键）、五甘氨 酸（pentaglycin)横桥中的键（本文中也定义为五甘氨酸桥甘氨酰-甘氨酰键）、N-乙酰 基胞壁酰基与L-丙氨酸之间的键或N-乙酰基胞壁胺（N-acetylmuramine)与N-乙酰葡糖 胺之间或N-乙酰葡糖胺与N-乙酰基胞壁胺之间的键（图1)。革兰氏阳性细菌细胞的肽 聚糖层中的其他优选的必不可少的键是Y -谷氨酰基主干肽中的键、主干肽中的L-丙氨酰 基-异-D-谷氨酸之间的键和主干肽中的异-D-谷氨酸-L-赖氨酸之间的键。
[0016] 优选地，根据本发明的第一、第二和可选的第三和/或另外的酶促活性结构域是 从由半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)结构域，肽链内切酶结构域和酰胺 酶结构域组成的群组中选择的结构域。此外，优选地，所述第一、第二、第三和/或另外的酶 促活性结构域是从由半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)结构域，肽链内切 酶结构域，酰胺酶结构域和糖基水解酶结构域组成的群组中选择的结构域。所述糖基水解 酶结构域可以是胞壁质酶（muramidase)结构域或氨基葡萄糖苷酶（glycosaminidase)结 构域。
[0017] 优选地，所述CHAP结构域切割肽聚糖层内的N-末端丙氨酰和甘氨酰之间的键。更 优选地，所述CHAP特异性地切割肽聚糖层内的N-末端丙氨酰和甘氨酰之间的键。优选地， 所述肽链内切酶结构域切割肽聚糖层内的五甘氨酸桥甘氨酰-甘氨酰键。更优选地，所述 肽链内切酶特异性地切割肽聚糖层内的五甘氨酸桥甘氨酰-甘氨酰键。优选地，所述酰胺 酶结构域切割肽聚糖层内的中央N-乙酰基胞壁酰基和L-丙氨酸之间的键。更优选地，所述 酰胺酶结构域特异性地切割肽聚糖层内的中央N-乙酰基胞壁酰基和L-丙氨酸之间的键。 优选地，所述胞壁质酶结构域裂解肽聚糖层内的N-乙酰基胞壁胺和N-乙酰葡糖胺之间的 键。更优选地，所述胞壁质酶结构域特异性地切割肽聚糖层内的N-乙酰基胞壁胺和N-乙 酰葡糖胺之间的键。优选地，所述氨基葡萄糖苷酶结构域切割肽聚糖层内的N-乙酰葡糖胺 和N-乙酰基胞壁胺之间的键。更优选地，所述氨基葡萄糖苷酶结构域特异性地切割肽聚糖 层内的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰基胞壁胺之间的键。优选地，所述肽聚糖层是革兰氏阳性 细菌细胞、优选葡萄球菌、更优选金黄色葡萄球菌的肽聚糖层。优选地，如果使用本文中定 义的酶促活性结构域对一种键的水解比使用所述酶促活性结构域对上文所定义的任何其 他键的水解至少2、10、50或100倍更加有效，那么由所述酶促活性结构域对该种键的切割 是特异性的。
[0018] 优选地，涵盖于本发明内的CHAP结构域来源于葡萄球菌噬菌体K和/或葡萄球 菌噬菌体Twort。优选地，涵盖于本发明内的CHAP结构域是与SEQ ID NO: 10或12具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 % 的同一 性的结构域。优选地，涵盖于本发明内的肽链内切酶结构域来源于金黄色葡萄球菌噬菌体 Φ2638&和/或模仿葡萄球菌（S. simulans)。优选地，涵盖于本发明内的肽链内切酶结构 域与 SEQ ID 吣：14或16具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100%的同一性。优选地，涵盖于本发明内的酰胺酶结构域来源于金黄色葡 萄球菌噬菌体〇2638a。优选地，本发明的酰胺酶结构域与SEQ ID NO: 18具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0019] 优选地，根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的多肽包含不同多重性的（a different multiplicity of)根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性结构 域。"多重性（multiplicity)"在本文中定义为拷贝的数目。"不同多重性"在本文中定义 为：包含于本发明的特异性多肽（即本文中识别的第一、第二、第三或另外的多肽）内的本 发明的特异性酶促活性结构域（即本文中确定的第一、第二、第三或另外的酶促活性结构 域）的多重性或拷贝的数目，不同于所述相同的酶促活性结构域在本发明的组合的另一种 多肽内的多重性或拷贝的数目。例如，本发明的组合包含第一多肽和第二多肽，所述第一多 肽包含具体数目的第一酶促活性结构域的拷贝，而所述第二多肽包含不同数目的所述第一 酶促活性结构域的拷贝。此外，所述本发明的示例性组合的所述第一多肽可以进一步包含 具体数目的第二酶促活性结构域的拷贝，该数目不同于包含于所述组合的所述第二多肽上 的所述第二酶促活性结构域的拷贝的数目。此外，所述本发明的示例性组合的任何另外的 多肽可以包含一定数目的另外的酶促活性结构域的拷贝，该数目不同于包含于所述组合的 所述第一和第二多肽上的所述另外的酶促活性结构域的拷贝的数目。虽然相比于每个单独 的多肽的裂解活性，各自包含单个不同的酶促活性结构域的不同的多肽的组合显示出了协 同裂解活性，但本发明人们惊奇地发现，与包含单个酶促活性结构域的多肽相比，包含多重 性的酶促活性结构域的多肽显示出更优异的裂解活性。
[0020] 此外，相比于其中所有所述不同的多肽均只包含单个不同的酶促活性结构域的组 合，发现不同的酶促结构域在不同的多肽上（其中至少一个所述不同的多肽包含多重性的 酶促活性结构域）的组合更优异。另外发现，其中根据本发明的第一、第二、第三和/或另外 的多肽分别包含多重性的根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性结构域的 根据本发明的组合，相比于其中所述第一、第二、第三和/或另外的多肽分别包含单个拷贝 的所述第一、第二、第三和/或另外的酶促活性结构域的根据本发明的组合而言更加优异， 并且优选其中本文所定义的所述多重性为2,即两重。在优选的实施方式中，发现，根据本发 明的组合（其中根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的多肽分别包含多重性的根据本 发明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性结构域）的协同效应，相比于其中所述第一、 第二、第三和另外的多肽分别包含单个拷贝的所述第一、第二、第三和另外的酶促活性结构 域的本发明所述的组合而言更加优异，并且优选地其中本文所定义的所述多重性为2,即两 重。
[0021] 优选地，根据本发明的第一和/或第二多肽包含不同多重性的根据本发明的第一 和/或第二酶促活性结构域。如前文定义，所述第一和第二结构域的多重性为所述第一和 第二结构域的拷贝的数目，优选地由以下所示的k、1、η和p来表示 ：
[0022] k表示所述第一多肽上的所述第一酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0023] 1表示所述第一多肽上的所述第二酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0024] η表示所述第二多肽上的所述第一酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0025] ρ表示所述第二多肽上的所述第二酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0026] 并且其中 k和 ρ 独立地为来自 1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3 或优选 1-2 的整数，且1和η独立地为来自0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3或优选0-2的整数， 并且其中k为不同于η的整数和/或1是不同于ρ的整数，最优选k和ρ为2且1和η为 0〇
[0027] 优选地，本发明的第一、第二和第三多肽包含不同多重性的根据本发明的第一、第 二和第三酶促活性结构域。
[0028] 所述第一、第二和第三结构域的多重是如前文定义为所述第一、第二和第三结构 域的拷贝的数目，优选地由如下所示的k、1、m、n、p、q、r、s和t来表示 ：
[0029] k表示所述第一多肽上的所述第一酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0030] 1表示所述第一多肽上的所述第二酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0031] m表示所述第一多肽上的所述第三酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0032] η表示所述第二多肽上的所述第一酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0033] ρ表示所述第二多肽上的所述第二酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0034] q表示所述第二多肽上的所述第三酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0035] !表示所述第三多肽上的所述第一酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0036] s表示所述第三多肽上的所述第二酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0037] t表示所述第三多肽上的所述第三酶促活性结构域的拷贝的数目；
[0038] 并且其中 k、p 和 t 独立地为来自 1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3 或优选 1-2 的整数，并且1、m、n、q、r和s独立地为来自0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3或优选 0-2的整数，并且其中k是不同于η和/或r的整数，和/或1是不同于ρ和/或s的整数， 和/或t是不同于m或q的整数，最优选地k、ρ和t是2且l、m、n、q、r和s是0。
[0039] 优选地，本发明的第一、第二、第三和另外的多肽包含不同多重性的根据本发明的 第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域。鉴于所述第一、第二和第三酶促活性结构域，所 述另外的酶促活性结构域的多重性在本文中应以类似于上文为第一、第二和第三酶促活性 结构域定义的方式进行解释。
[0040] 优选地，根据本发明的第一、第二、第三或另外的多肽具有至少140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 个氨基酸的长 度和 / 或至多 850、800、750、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、 410、400、390、380或370个氨基酸的长度。更优选地，根据本发明的第一、第二或第三多肽 具有 140-850、140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、140-490、 140-480、140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、140-400、 140-390、140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、200-850、 210-850、220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、290-850、 300-850、310-850、320-850 或 330-850 个氨基酸的长度。
[0041] 优选地，根据本发明的第一和第二多肽各自具有至少140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 个氨基酸的长度和 / 或 至多 800、850、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、 380或370个氨基酸的长度。更优选地，根据本发明的第一和第二多肽各自具有140-850、 140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、140-490、140-480、 140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、140-400、140-390、 140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、200-850、210-850、 220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、290-850、300-850、 310-850、320-850或330-850个氨基酸的长度。
[0042] 优选地，根据本发明的第一、第二和第三多肽各自具有至少140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 个氨基酸的长 度和 / 或至多 800、850、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、 400、390、380或370个氨基酸的长度。更优选地，根据本发明的第一、第二和第三多肽各自 具有 140-850、140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、140-490、 140-480、140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、140-400、 140-390、140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、200-850、 210-850、220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、290-850、 300-850、310-850、320-850 或 330-850 个氨基酸的长度。
[0043] 优选地，根据本发明的第一、第二、第三和另外的多肽各自具有至少140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 个氨基酸 的长度和 / 或至多 800、850、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、 410、400、390、380或370个氨基酸的长度。更优选地，根据本发明的第一、第二、第三和另外 的多肽各自具有 140-850、140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、 140-490、140-480、140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、 140-400、140-390、140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、 200-850、210-850、220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、 290-850、300-850、310-850、320-850 或 330-850 个氨基酸的长度。
[0044] -个实施方式提供了根据本发明的第一和第二酶促活性结构域的源的组合，其中 所述第一和第二酶促活性结构域被包含在不同的本发明的第一和第二多肽上，其中所述第 一多肽不含所述第二酶促活性结构域并且所述第二多肽不含所述第一酶促活性结构域。此 夕卜，提供了根据本发明的组合，其中1和η均为0。
[0045] 另一个实施方式提供了根据本发明的第一、第二和第三酶促活性结构域的源的组 合，其中所述第一、第二和第三酶促活性结构域被包含在不同的第一、第二和第三多肽上， 其中所述第一多肽不含所述第二和第三酶促活性结构域，所述第二多肽不含所述第一和第 三酶促活性结构域，并且所述第三多肽不含所述第一和第二酶促活性结构域。此外，提供了 根据本发明的组合，其中l、m、n、q、r和s均为0。甚至更优选地，本发明提供了根据本发明 的组合，其中1、m、n、q、r和s均为0且k、p和t均为2。
[0046] 另一个实施方式提供了根据本发明的第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域 的源的组合，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域被分别包含在不同的第 一、第二、第三和另外的多肽上，其中：
[0047] 优选所述第一多肽不含所述第二、第三和另外的酶促活性结构域；
[0048] 优选所述第二多肽不含所述第一、第三和另外的酶促活性结构域；
[0049] 优选所述第三多肽不含所述第一、第二和另外的酶促活性结构域；并且，
[0050] 优选所述另外的多肽不含所述第一、第二和第三酶促活性结构域。
[0051] 优选地，所述第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域分别一式两份地包含在所 述第一、第二、第三和另外的多肽内，即，其中本文所确定的多重性为2。还涵盖的是根据本 发明的组合，其中根据本发明的第一、第二和/或第三多肽含有根据本发明的第一、第二和 /或第三酶促活性结构域，但是所述第一、第二和/或第三多肽在所述第一、第二和/或第三 酶促活性结构域的多重性上是不同的。此外，涵盖的是根据本发明的组合，其中k、l、m、n、 p、q、r、s或t中的至少一个是2并且其中任何其他的k、1、m、np、q、r、s和/或t是1或 0〇
[0052] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的多肽进一步包含细胞壁结合结构 域。此外，各自包含至少一种本文所定义的酶促活性结构域的根据本发明的第一、第二、第 三和/或另外的多肽，进一步包含细胞壁结合结构域。本发明的细胞壁结合结构域被定义 一种要素，优选处于所述不同的多肽内的多肽，其将所述不同的多肽引导至细菌的细胞壁。 优选地，本发明的细胞壁结合结构域是一个要素，优选处于所述不同的多肽内的多肽，其将 所述不同的多肽引导至革兰氏阳性细菌细胞的肽聚糖细胞壁（优选葡萄球菌属细菌细胞 的肽聚糖细胞壁）。
[0053] 可以使用本领域技术人员众所周知的检定法（assay)来评估结构域与葡萄球菌 属的肽聚糖细胞壁的结合。在一个优选的实施方式中，使用免疫组化技术或产生标记的 构建体的基因融合技术来评估肽、多肽或蛋白质与葡萄球菌属的肽聚糖细胞壁的特异性结 合。在上述免疫组化或融合技术中使用的信号的定量方法为本领域技术人员所熟知。
[0054] 在一个实施方式中，使用包含目标细胞壁结构域的荧光融合构建体来定量葡萄球 菌肤聚糖细胞壁结合。由 Loessner 等（Molecular Microbiology2002, 44 (2) : 335 - 349)对 此种细胞壁结合测定法进行了详细的描述。在这种测试法中，使包含所述荧光融合构建或 阴性对照（优选绿色荧光蛋白（GFP))的溶液经受（subjected to)葡萄球菌细胞（优选金 黄色葡萄球菌细胞，更优选金黄色葡萄球菌BB255)指定的一段时间，之后，通过离心将细 胞与结合的荧光融合构建体一起沉淀。将暴露于荧光融合构建体的葡萄球菌细胞的荧光信 号减去暴露于阴性对照（优选GFP)的葡萄球菌细胞的荧光信号即为本公开所指的细胞结 合的量度。优选地，在本发明的上下文中，当使用这种测定法检测到沉淀的细胞的荧光信号 提高至本文所定义的阴性对照之上时，则认为结构域结合葡萄球菌属的肽聚糖细胞壁。优 选地，本发明涉及细胞壁结合结构域，其表现出本发明定义的结合的至少50、60、70、80、90 或100、150或200%的由SEQ ID N0:1编码的金黄色葡萄球菌噬菌体〇2638a内溶素（由 SEQ ID NO:2定义的Ply2638内溶素）的肽聚糖细胞壁结合。
[0055] 涵盖于本发明内的细胞壁结合结构域可以是本领域技术人员已知的任何细胞壁 结合结构域。优选的本发明的细胞壁结合结构域是与本文中由SEQ ID N0:4定义且由SEQ ID NO:3编码的模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素的细胞壁结合结构域具有至少80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的细胞壁结合结构 域。还优选的是分离自天然葡萄球菌噬菌体内溶素的细胞壁结合结构域。优选地，本发明的 细胞壁结合结构域与本文中由SEQ ID NO: 6定义且由SEQ ID NO: 5编码的金黄色葡萄球菌 噬菌体〇2638a内溶素的细胞壁结合结构域具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。还优选的是分离自天然金黄色葡萄 球菌噬菌体phiNM3内溶素的细胞壁结合结构域。优选地，本发明的细胞壁结合结构域与本 文中由SEQ ID N0:8定义且由SEQ ID N0:7编码的金黄色葡萄球菌噬菌体phi匪3内溶素 的细胞壁结合结构域具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99 或 100%的同一性。
[0056] 优选地，根据本发明的细胞壁结合结构域位于所述不同的第一、第二、第三和/或 另外的多肽中的酶促活性结构域的C-末端侧。但应当进一步理解的是，涵盖的是根据本发 明的组合，其中根据本发明的不同的第一、第二和可选的第三和/或另外的多肽的不同之 处不仅在于它们的特异性酶促活性结构域，还在于它们的特异性细胞壁结合结构域。即使 是这样的根据本发明的组合也处于本发明的范围内，其中根据本发明的不同的第一、第二 和可选的第三多肽不含根据本发明的细胞壁结合结构域。此外，这样的根据本发明的组合 也在本发明的范围内，其中一个或两个根据本发明的第一、第二和可选的第三和/或另外 的多肽不含细胞壁结合结构域。
[0057] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的多 肽是与从由 SEQ ID N0:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、 64、66、68、70或72组成的群组中选择的多肽具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的多肽。
[0058] 在一个优选的实施方式中，本发明提供了第一酶促活性结构域和第二酶促活性结 构域的源的组合，其中所述第一和第二酶促活性结构域被包含在不同的第一和第二多肽 上，并且其中所述第一酶促活性结构域是半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构 域并且所述第二酶促活性结构域是肽链内切酶结构域，或者其中所述第一酶促活性结构是 半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构域并且所述第二酶促活性结构域是酰胺酶 结构域，或者其中所述第一酶促活性结构域是肽链内切酶结构域并且所述第二酶促活性结 构域是酰胺酶结构域，其中所述不同的第一和第二多肽各自进一步包含细胞壁结合结构 域，并且其中所述不同的第一和第二多肽的每一个均包含多重性的所述第一或第二酶促活 性结构域，优选地所述多重性是2,即两重。此外，在一个优选的实施方式中，本发明提供了 第一和第二酶促活性结构域的源的组合，其中所述第一和第二酶促活性结构域被包含在不 同的第一和第二多肽上，并且其中所述第一酶促结构是组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结 构域并且所述第二酶促活性结构域是肽链内切酶结构域，或者所述第一酶促活性结构域是 半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构域并且所述第二酶促活性结构域是酰胺酶 结构域，或者所述第一酶促活性结构域是肽链内切酶结构域并且所述第二酶促活性结构域 是酰胺酶结构域，并且其中所述第一和第二多肽各自进一步包含细胞壁结合结构域。
[0059] 在一个优选的实施方式中，本发明提供了第一酶促活性结构域和第二酶促活性结 构域的源的组合，其中所述第一和第二酶促活性结构域被包含在不同的第一和第二多肽 上，并且其中所述第一酶促活性结构域是半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构 域并且所述第二酶促活性结构域是肽链内切酶结构域，并且其中所述组合进一步包含第三 酶促活性结构域的源，该第三酶促活性结构域被包含在不同的第三多肽上，其中所述第三 酶促活性结构域是酰胺酶结构域并且所述不同的第一、第二和第三多肽各自进一步包含细 胞壁结合域，并且其中所述第一、第二和第三酶促活性结构域的每一个均包含多重性的所 述第一、第二或第三酶促活性结构域，优选地所述多重性是2,即两重。此外，在一个优选的 实施方式中，本发明提供了第一、第二和第三酶促活性结构域的源的组合，其中所述第一、 第二和第三酶促活性结构域被包含在不同的第一、第二和第三多肽上，并且其中所述第一 酶促结构域是组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构域，所述第二酶促活性结构域是肽链内 切酶结构域并且所述第三酶促活性结构域是酰胺酶结构域，并且其中所述第一、第二和第 三多肽各自进一步包含细胞壁结合结构域。
[0060] 优选的是根据本发明的组合，其中，根据本发明的第一酶促活性结构域与SEQ ID NO: 10 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根据本发明的第二酶促活性结构域与SEQ ID NO: 16具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0061] 优选的是根据本发明的组合，其中，根据本发明的第一酶促活性结构域与SEQ ID NO: 10 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根据本发明的第二酶促活性结构域与SEQ ID NO: 18具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0062] 优选的是根据本发明的组合，其中，根据本发明的第一酶促活性结构域与SEQ ID NO: 16 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根据本发明的第二酶促活性结构域与SEQ ID NO: 18具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0063] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0064] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0065] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:46具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0066] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0067] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:52具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0068] 更优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:70具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:52具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0069] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0070] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0071] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:70具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:34具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0072] 更优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:70具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0073] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:52具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:34具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0074] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:52具有至 少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性 并且根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0075] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一酶促活性结构域与SEQ ID NO: 10 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根据本发明的第二酶促活性结构域与SEQ ID NO: 16具有至少80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本 发明的第三酶促活性结构域与SEQ ID N0:18具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0076] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0077] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:32具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0078] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0079] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:36具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:48具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:30 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0080] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:32具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0081] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0082] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:32具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0083] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:32具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0084] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0085] 优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID NO:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0086] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:50 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0087] 进一步优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:56 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的 同一性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与 SEQ ID 吣：50具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99或100%的同一性。
[0088] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:60具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:72具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:54 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0089] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:56具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:50 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0090] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:50 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0091] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:56具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0092] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:65具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0093] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0094] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0095] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0096] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0097] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0098] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:58具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID NO:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0099] 还优选的是根据本发明的组合，其中根据本发明的第一多肽与SEQ ID N0:34具有 至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一 性，根据本发明的第二多肽与SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根据本发明的第三多肽与SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。但应当理解的是，根据本发明的组合包含不同比例的根据本发明的第一酶 促活性结构域的源、第二酶促活性结构域的源和可选的第三和/或另外的酶促活性结构域 的源的混合物。优选地，根据本发明的组合包含根据本发明的第一酶促活性结构域的源和 第二酶促活性结构域的源，其中所述第一和第二酶促活性结构域以等摩尔量存在。还优选 的是根据本发明的组合，包含根据本发明的第一的源、第二的源和第三酶促活性结构域的 源，其中所述第一、第二和第三酶促活性结构域以等摩尔量存在。还优选的是根据本发明的 组合，包含第一酶促活性结构域的源、第二酶促活性结构域的源、第三酶促活性结构域的源 和另外的酶促活性结构域的源，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域以等摩 尔量存在。
[0100] 在第二方面，本发明提供了根据第一方面的组合，其中根据本发明的第一方面的 第一、第二和可选的第三和/或另外的酶促活性结构域包含多肽。所述多肽可以是蛋白质、 蛋白质的消化物（digest)和/或蛋白质或消化物的片段，其可以是纯化的形式或可以被包 含于粗制组合物，优选为生物来源，例如细菌裂解液、酵母裂解液、真菌裂解液、超声处理液 或固定液（sonicate or fixate)。可替代地，所述多肽可以是化学合成的多肽或在体外产生 的重组多肽。
[0101] 优选地，根据本发明的第一酶促活性结构域的源包含根据本发明的第一方面的第 一多肽，根据本发明的第二酶促活性结构域包含根据本发明的第一方面的第二多肽并且根 据本发明的可选的第三酶促活性结构域包含根据本发明的第一方面的第三多肽并且根据 本发明的可选的另外的酶促活性结构域包含根据本发明的第一方面的另外的多肽。更优选 地，所述第一酶促活性结构域的所述源由根据本发明的第一方面的第一多肽组成，所述第 二酶促活性结构域由根据本发明的第一方面的第二多肽组成，所述第三酶促活性结构域由 根据本发明的第一方面的第三多肽组成，并且所述另外的酶促活性结构域由根据本发明的 进一步方面的第三多肽组成。
[0102] 一个实施方式包括根据本发明的组合，其中本发明的第一、第二和/或可选的第 三和/或另外的多肽是变体第一、第二和/或第三和/或另外的多肽。变体多肽可以是多肽 的非天然存在的形式。多肽变体可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离出 的多肽。变体可以由编码本文中定义且由SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71 或 73 表示的多肽的核苷酸序列开始通过定位诱变来制得。优选地，根据本发明的多肽变体与任 何的 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72 或 74 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的同一性。优选地，在根据本发明的 组合中，多肽变体含有不会改变所编码的多肽的生物学功能的突变。
[0103] 根据本发明的多核苷酸与任何的SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71 或 73 可以具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 %的同一性，或者可替代地在严格条件下与这些给定的序列杂交。严格杂交条件是如本 领域中理解的那些，例如在56°C下在6x SSC(20xSSC每1000ml:175.3g NaCl，107. Ig柠檬 酸钠.5!120，口!17.0)、0.1%505、0.05%焦磷酸钠、5和6111^1肚氏溶液和2(^8/1111变性青 鱼精DNA中杂交18?24小时，随后在56°C下在5x SSC、0. 1 % SDS中洗涤两次，每次各30 分钟，并且在56°C下在2x SSC、0. 1% SSC中洗涤两次，每次各30分钟。
[0104] 根据一个优选的实施方式，如在本文先前所确定的测定法中测量的，多肽变体表 现出的溶解或细胞壁结合活性与SEQ ID N0:2的溶解和/或细胞壁结合活性相比是相同的 或增强。
[0105] 应当理解的是，根据本发明的组合包括不同比例的根据本发明的第一、第二和可 选的第三和/或另外的多肽的混合物。优选地，根据本发明的组合包含根据本发明的第一、 第二和可选的第三和/或另外的多肽，其中第一和第二酶促活性结构域以等摩尔量存在。 还优选的是根据本发明的组合包含等摩尔量的根据本发明的第一、第二和可选的第三和/ 或另外的多肽，其中第一、第二和第三和/或另外的酶促活性结构域以等摩尔量存在。
[0106] 在第三方面，本发明提供了根据本发明的第一方面的组合，其中根据本发明的第 一方面的第一酶促活性结构域的源包含编码所述第一酶促活性结构域的多核苷酸，根据本 发明的第一方面的第二酶促活性结构域的源包含编码所述第二酶促活性结构域的多核苷 酸，并且可选地根据本发明的第一方面的第三酶促活性结构域的源包含编码所述第三酶促 活性结构域的多核苷酸，并且可选地根据本发明的第一方面的进一步酶促活性结构域的源 包含编码所述另外的酶促活性结构域的多核苷酸。所述多核苷酸可以是RNA或DNA分子。
[0107] 优选地，本发明提供了根据本发明的组合，其中第一多核苷酸编码根据本发明的 第一酶促活性结构域并且第二多核苷酸编码根据本发明的第二酶促活性结构域。优选地， 在根据本发明的组合中，根据本发明的第一和/或第二多核苷酸进一步编码本文中定义的 细胞壁结合结构域。优选地，本发明提供了根据本发明的组合，其中第一多核苷酸编码根据 本发明的第一酶促活性结构域，第二多核苷酸编码根据本发明的第二酶促活性结构域，第 三多核苷酸编码根据本发明的第三酶促活性结构域并且另外的多核苷酸编码根据本发明 的另外的酶促活性结构域。优选地，在根据本发明的组合中，根据本发明的第一、第二、第三 和/或另外的多核苷酸进一步编码本文中定义的细胞壁结合结构域。
[0108] 本发明进一步提供了根据本发明的组合，其中本发明的第一、第二和/或可选的 第三和/或另外的多肽是由天然存在的或改造的（retrofit)多核苷酸构建体编码的嵌合的 第一、第二、第三和/或另外的多肽。改造的构建体在本文中被定义为包含异源核苷酸序列 的多核苷酸。本文所用的术语异源序列或异源多核苷酸是非天然发现的可操作地连接为邻 近序列的所述第一核苷酸序列。本文中使用的术语异源可以是指重组体。重组体是指一种 遗传实体，其不同于通常在自然界中发现的遗传实体。当适用于核苷酸序列或核酸分子时， 这意味着所述核苷酸序列或核酸分子是克隆、限制（restriction)和/或连接步骤以及导 致产生与在自然界中发现的序列或分子不同的构建体的其他工序的各种组合的产物。优选 地，在根据本发明的组合中，所述嵌合多肽包含至少一个如上文所定义的第一、第二或第三 多肽并且进一步包含至少一种如上文所定义的细胞结合结构域。
[0109] 一个可替代的实施方式提供了本发明的组合，其中嵌合多肽包含本文所定义 的内溶素，该内溶素共价地连接至其C-末端的疏水性五肽，优选所述疏水性五肽是 Phe-Phe-Val-Ala-Pro,这增加了所述内溶素的杀菌作用，特别是针对革兰氏阴性菌的杀菌 作用，如 Ibrahim 等，1994 (JBC 1994Vol. 269, P. 5053-5063)的报道。
[0110] 优选地，在根据本发明的组合中，根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的多 核苷酸具有至少 420、450、480、510、540、570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、 870、900、930、960 或 990 个核苷酸的长度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、 1650、1500、1470、1440、1410、1380、1350、1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040 或 1100 个核苷酸的长度。更优选地，根据本发明的第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸具 有 420-2550、420-2400、420-2250、420-2100、420-1950、420-1800、420-1650、420-1500、 420-1470、420-1440、420-1410、420-1380、420-1350、420-1320、420-1290、420-1260、 420-1230、420-1200、420-1070、420-1040 或 420-1100、450-2550、480-2550、510-2550、 540-2550,570-2550,600-2550,630-2550,660-2550,690-2550,720-2550,750-2550, 780-2550、810-2550、840-2550、870-2550、900-2550、930-2550、960-2550 或 990-2550 个核 苷酸的长度。
[0111] 优选地，根据本发明的第一和第二多核苷酸各自具有至少420、450、480、510、540、 570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、870、900、930、960 或 990 个核苷酸的长度 和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、1650、1500、1470、1440、1410、1380、1350、 1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040或1100个核苷酸的长度。更优选地，根据本发 明的第一和第二多核苷酸各自具有 420-2550、420-2400、420-2250、420-2100、420-1950、 420-1800、420-1650、420-1500、420-1470、420-1440、420-1410、420-1380、420-1350、 420-1320、420-1290、420-1260、420-1230、420-1200、420-1070、420-1040 或 420-1100、 450-2550、480-2550、510-2550、540-2550、570-2550、600-2550、630-2550、660-2550、 690-2550、720-2550、750-2550、780-2550、810-2550、840-2550、870-2550、900-2550、 930-2550、960-2550 或 990-2550 个核苷酸的长度。
[0112] 优选地，根据本发明的第一、第二和第三多核苷酸各自具有至少420、450、480、 510、540、570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、870、900、930、960 或 990 个核苷酸 的长度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、1650、1500、1470、1440、1410、1380、 1350、1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040 或 1100 个核苷酸的长度。更优选地，根据 本发明的第一、第二和第三多核苷酸各自具有420-2550、420-2400、420-2250、420-2100、 420-1950、420-1800、420-1650、420-1500、420-1470、420-1440、420-1410、420-1380、 420-1350、420-1320、420-1290、420-1260、420-1230、420-1200、420-1070、420-1040 或 420-1100,450-2550,480-2550,510-2550,540-2550,570-2550,600-2550,630-2550, 660-2550、690-2550、720-2550、750-2550、780-2550、810-2550、840-2550、870-2550、 900-2550、930-2550、960-2550 或 990-2550 个核苷酸的长度。
[0113] 优选地，根据本发明的第一、第二、第三和另外的多核苷酸各自具有至少420、450、 480、510、540、570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、870、900、930、960 或 990 个核 苷酸的长度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、1650、1500、1470、1440、1410、 1380、1350、1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040 或 1100 个核苷酸的长度。更优选地， 根据本发明的第一、第二、第三和另外的多核苷酸各自具有420-2550、420-2400、420-2250、 420-2100、420-1950、420-1800、420-1650、420-1500、420-1470、420-1440、420-1410、 420-1380、420-1350、420-1320、420-1290、420-1260、420-1230、420-1200、420-1070、 420-1040、或 420-1100、450-2550、480-2550、510-2550、540-2550、570-2550、600-2550、 630-2550、660-2550、690-2550、720-2550、750-2550、780-2550、810-2550、840-2550、 870-2550、900-2550、930-2550、960-2550 或 990-2550 个核苷酸的长度。
[0114] 在第四方面，本发明提供了上文所定义的多肽和/或多核苷酸。优选地，所述多肽 是任何本发明的第二方面中定义的第一、第二、第三和/或另外的多肽。优选地，所述多核 苷酸编码任何所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。优选地，所述多核苷酸是任何本发 明的第三方面中定义的第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸。优选地，所述多肽包含活 性结构域、细胞壁结合结构域和可选的本文中定义的为了便于纯化的标签和/或由酶促活 性结构域、细胞壁结合结构域和可选的本文中定义的为了便于纯化的标签组成，优选地所 述酶促活性结构域是半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构域、肽链内切酶结构 域或酰胺酶结构域，并且优选地所述多肽包含多重性的所述酶促活性结构域，优选地所述 多重性是2,即两重。优选地，所述多肽与任何的SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70 或 72 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100% 的同一性。所述多核苷酸与任何的 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 或 71 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 % 的同一性， 或者可替代地在严格条件下能够与这些给定的序列杂交。更优选地，所述多肽包含两重的 酰胺酶结构域和细胞壁结合结构域和可选的本文中定义的为便于纯化的标签和/或由两 重的酰胺酶结构域和细胞壁结合结构域和可选的本文中定义的为便于纯化的标签组成，优 选地所述酰胺酶结构域是金黄色葡萄球菌噬菌体〇2638a内溶素并且所述细胞壁结合结 构域是模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素（Iysostaphin)。最优选地，所述多肽包含两重的肽链内 切酶结构域和细胞壁结合结构域和可选的本文中定义的为便于纯化的标签和/或由两重 的肽链内切酶结构域和细胞壁结合结构域和可选的本文中定义的为便于纯化的标签组成， 优选地所述肽链内切酶结构域是模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素的肽酶_M23结构域并且所述 细胞壁结合结构域是模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素。
[0115] 优选地，所述多肽与 SEQ ID 勵:28、34、46、52、58或70具有至少80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，更优选地，所述多 肽与 SEQ ID 勵：28、46、52或70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99或100%的同一性，甚至更优选地，所述多肽与SEQ ID N0:46或70具 有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同 一性，最优选地所述多肽与 SEQ ID N0:70 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。优选地所述多核苷酸编码任何所示的优 选的多肽。
[0116] 优选地，所述多核苷酸与SEQ ID勵:27、33、45、51、57或69具有至少80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，或可替代地 能够在严格条件下与这些给定的序列杂交。优选地，所述多肽与SEQ ID N0:27、45、51或 69 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100% 的同一性，或可替代地能够在严格条件下与这些给定的序列杂交。甚至更优选地，所述多肽 与 SEQ ID N0:45 或 69 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100 %的同一性，或可替代地在严格条件下能够与这些给定的序列杂交。最 优选地,所述多肽与 SEQ ID N0:69 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，或者可替代地在严格条件下能够与这些给定的 序列杂交。
[0117] 在另一个实施方式中，所述多肽不是SEQ ID NO:70和/或所述多核苷酸不是SEQ ID N0:69。
[0118] 在第五方面，本发明涉及根据本发明的第三方面的组合和/或第四方面的多核苷 酸，其中根据本发明的第三方面和/或第四方面的多核苷酸存在于表达构建体中。此外，所 述第一、第二和/或第三和/或另外的多核苷酸可以存在于表达构建体中。所述表达构建 体可以是优选地包含于囊泡或脂质体中的'裸' DNA或RNA，或都可以是包含于表达载体中。 优选地所述表达构建体是表达载体，更优选地是质粒、粘粒、噬菌体或通过导入编码如上文 中定义的第一、第二或第三多肽的多核苷酸而转化的病毒，并且其中所述多核苷酸可操作 地连接至一个或多个控制子（control)，所述控制子引导该编码的多肽在细胞、受试者或非 细胞体系中的生产或表达。视待转化的宿主生物体而定的这样的转化载体为本领域技术 人员所熟知并且广泛地描述于文献中。所述表达构建体也可以是任何DNA或RNA病毒，例 如但不限于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、改良型牛痘Nakara病毒或禽痘病毒 或适用于赋予将多肽表达到选定的受试者中的任何其他病毒载体。DNA载体可以是非整合 的，例如另外的型（印isomally)复制载体，或者可以是通过随机整合或通过同源重组而整 合到宿主基因组中的载体。表达载体可以被视为一种重组表达载体。
[0119] 在本发明的范围内，根据本发明的第一、第二、第三和/或第四多核苷酸可以存在 于不同的表达构建体上或者可以组合地存在于单个表达构建体上。此外，在本发明的组合 中，所述第一多核苷酸可以存在于第一表达构建体上而第二多核苷酸可以存在于第二表达 构建体上。此外，在本发明的组合中，所述第一多核苷酸可以存在于第一表达构建体上，所 述第二多核苷酸存在于第二表达构建体上，所述第三多核苷酸存在于第三表达构建体上， 并且所述另外的多核苷酸存在于另外的表达构建体上。还包括在本发明的范围内的是，第 一、第二、第三和/或另外的多核苷酸被包含在单个表达构建体上。其中本发明的两个多肽 存在于单个表达构建体上，而它们中的一个存在于不同的表达构建体上组合也是可能的。
[0120] 在第六方面，提供了一种根据本发明的第三方面的组合和/或第四方面的多核苷 酸，其中根据本发明的第五方面所述的表达构建体存在于表达系统中。在本发明的范围内， 所述表达系统可以是细胞，优选地是微生物、原核或真核细胞，其适合于表达本发明的多 肽。在优选的实施方式中，所述细胞是大肠杆菌（E. coli)。在甚至更优选的实施方式中，所 述细胞是大肠杆菌XLlBlue MRF'。
[0121] 在第七方面，提供了一种用于转化宿主生物体或细胞的方法，其通过导入至少一 种根据本发明的多核苷酸，所述转化可以通过已经广泛地描述于专业文献且特别是本申请 引用的参考文献中的任何适合的已经方法来实施，更特别地是通过本发明所述的载体来实 施。在本发明的范围内，本文所定义的所述第一、第二、第三和/或另外的多肽可以存在于 单个转化的宿主生物体或细胞中或者存在于不同的转化的宿主生物体或细胞中。细胞可以 是适合于表达本发明的多肽的任何微生物、原核或真核细胞。在优选的实施方式中，所述细 胞是大肠杆菌。在甚至更优选的实施方式中，所述细胞是大肠杆菌XLlBlue MRF'。用于生 产、可选地纯化和可选的冷冻干燥如本文中定义的第一、第二、第三和/或另外的多肽的优 选方法包括下列步骤：
[0122] i)在包含如本文中定义的表达构建体的细胞中生产所述第一、第二、第三和/或 另外的多肽，可选地
[0123] ii)纯化所述第一、第二、第三和/或另外的多肽，并且可选地
[0124] iii)冷冻干燥所述经纯化的第一、第二、第三和/或另外的多肽。
[0125] 在一个优选的实施方式中，利用重组技术在步骤i)中使用大肠杆菌以生产所述 第一、第二、第三和/或另外的多肽。更优选地，利用重组技术在步骤i)中使用大肠杆菌 XLlBlueMRF以生产所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。优选地，在步聚ii)中，使用装 填有5mL低密度镍螯合琼脂糖珠（ABT珠）的IMAC和Econo-Pac色谱柱（Biorad)、结合重 力流以纯化所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。所述洗脱出的第一、第二、第三和/或 另外的多肽可以相对于3x 11冻干缓冲液进行透析2、4和12小时，所述缓冲液优选地包含 50mM磷酸盐、500mM蔗糖、200mM甘露糖醇、0. 005%聚山梨酯20, pH 7. 4。
[0126] 甚至更优选地的，用于生产、可选地纯化和冷冻干燥如本文中定义的第一、第二、 第三和/或另外的多肽的所述方法，进一步包括一种处理所述由上述的方法获得的第一、 第二、第三和/或另外的多肽的方法。所述处理包括取代二价金属离子用于增加相比于未 经处理的第一、第二、第三和/或另外的多肽的裂解活性，优选地所述方法包括步骤：
[0127] iv)相对于包含螯合化合物的缓冲液透析所述多肽；
[0128] V)相对于含有二价金属离子的缓冲液透析所述多肽，优选地所述二价金属离子是 从由Mn 2+、Co2+、Cu2+和Zn2+组成的群组中选择的。
[0129] "螯合化合物"在本文中被定义为结合金属离子的化合物。众所周知的螯合化合物 是乙二胺四乙酸（EDTA)和乙二醇四乙酸（EGTA)。优选地在本文所述的方法的步骤V)中使 用EDTA。优选地，所述方法的步骤V)的二价金属离子是从由Mn 2+、Co2+、Cu2+组成的群组中 选择的，更优选地，所述二价金属离子是从由Mn 2+和Co2+组成的群组中选择的，甚至更优选 地所述二价金属离子是Μη2+。
[0130] 在本发明的第八方面，根据本发明的第一方面的组合存在于至少两种不同的组合 物中。此外，本发明提供了一种本发明的组合，其中第一组合物包含根据本发明的第一酶促 活性结构域的源并且第二组合物包含根据本发明的第二酶促活性结构域的源，其中所述第 一和第二酶促活性结构域被包含在根据第一方面的不同的第一和第二多肽上，优选地其中 所述第一组合物不含所述第二酶促活性结构域的源并且所述第二组合物不含所述第一酶 促活性结构域的源。此外，本发明提供了根据本发明的组合，其中第一组合物包含根据本发 明的第一酶促活性结构域的源，第二组合物包含根据本发明的第二酶促活性结构域的源， 第三组合物包含根据本发明的第三酶促活性结构域的源，并且另外的组合物包含根据本发 明的另外的酶促活性结构域的源，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性结构域被包 含在根据本发明的第一方面的不同的第一、第二、第三和另外的多肽上，优选地其中所述第 一组合物不含所述第二、第三和另外的酶促结构域的所述源，所述第二组合物不含所述第 一、第三和另外的酶促活性结构域的所述源，所述第三组合物不含所述第一、第二和另外的 酶促活性结构域的所述源并且所述另外的组合物不含所述第一、第二和第三酶促活性结构 域的所述源。
[0131] 此外，本发明提供了根据本发明的组合，其中第一组合物包含根据本发明的第一 多肽的源，第二组合物包含根据本发明的第二多肽的源，并且可选地第三和/或另外的组 合物包含根据本发明的第三和/或另外的各自的多肽的源。优选地，所述第一组合物不含 所述第二多肽的源、不含所述第三多肽的源并且不含所述进一步各自多肽的源。优选地，所 述第二组合物不含所述第一多肽的源、不含所述第三多肽的源并且不含所述进一步各自的 多肽的源。优选地，所述第三组合物不含所述第一多肽的源、不含所述第二多肽的源并且不 含所述进一步各自的多肽的源。优选地，所述另外的组合物不含所述第一多肽的源、不含所 述第二多肽的源并且不含所述第三多肽的源。
[0132] 在第九方面，本发明提供了组合物，其包含任何本发明的第四方面的第一、第二、 第三和/或另外的多肽和/或核苷酸。优选地，本发明提供了组合物，其包含任何如本发明 的第二方面中所定义的第一、第二、第三和/或另外的多肽和/或如本发明的第三方面中所 定义的核苷酸。
[0133] 在第十方面，本发明提供了组合物，其包含根据本发明的第一方面的组合。此外， 本发明提供了单一组合物，其包含根据本发明的第一酶促活性结构域的源和根据本发明的 第二酶促活性结构域的源，其中所述第一和第二酶促活性结构域被包含在不同的第一和第 二多肽上。此外，本发明提供了根据本发明的组合物，其包含根据本发明的第一酶促活性结 构域的源和根据本发明的第二酶促活性结构域的源，其中所述第一酶促活性结构域被包含 在根据本发明的第一方面的第一多肽上并且所述第二酶促活性结构域被包含在根据本发 明的第一方面的第二多肽上，其中所述第一多肽不含所述第二酶促活性结构域并且所述第 二多肽不含所述第一酶促活性结构域。
[0134] 此外，本发明提供了一种单一组合物，其包含根据本发明的第一酶促活性结构域 的源、根据本发明的第二酶促活性结构域的源和根据本发明的第三和/或另外的酶促活性 结构域的源，其中所述第一、第二和第三和/或另外的酶促活性结构域被包含在根据本发 明的第一方面的不同的第一、第二和第三和/或另外的多肽上。此外，本发明提供了一种组 合物，其包含根据本发明的第一酶促活性结构域的源、根据本发明的第二酶促活性结构域 的源以及根据本发明的第三和/或另外的酶促活性结构域的源，其中所述第一酶促活性结 构域被包含在根据本发明的第一方面的第一多肽上，所述第二酶促活性结构域被包含在根 据本发明的第一方面的第二多肽上，并且所述第三和/或另外的酶促活性结构域被包含在 根据本发明的第一方面的第三和/或另外的多肽上，其中所述第一多肽不含所述第二酶促 活性结构域和第三和/或另外的酶促活性结构域，所述第二多肽不含所述第一和第三和/ 或另外的酶促活性结构域，并且所述第三和/或另外的多肽不含所述第一和第二酶促活性 结构域。
[0135] 根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或另外的组合物和/或根 据本发明的第九和/或第十方面的单一组合物可以是液体、固体或半液体或半固体形式。 优选地，根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或另外的组合物和/或根据 本发明的第九和/或第十方面的单一组合物为抗微生物剂，优选食品防腐剂或消毒剂。优 选地，所述抗微生物剂用于杀灭细菌，优选葡萄球菌属的细菌，更优选物种金黄色葡萄球菌 的细菌。优选地，根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或另外的组合物 和/或根据本发明的第九和/或第十方面的单一组合物进一步包含药学上可接受的载体和 /或从由噬菌体、抑菌剂、杀细菌剂、抗生素、表面活性剂和/或酶组成的群组中选择的另外 的活性成分。本发明的抗生素可以是本领域中已知的任何抗生素，包括抗生素和化疗剂，并 且包括但不限于万古霉素、尼生素（nisin)、达氟沙星（danofloxacin)和新霉素。有用于本 发明的组合物中的酶包括但不限于有助于破裂生物膜（例如在食品加工设备中发现的生 物膜）的酶，例如但不限于多糖解聚酶和蛋白酶。有用于本发明的组合物中的表面活性剂 协助润湿表面，以便本发明的活性成分（包括本发明的组合）被适当地分布在各种表面上， 并且协助溶解并且去除污垢，以便葡萄球菌可以接触到本发明的活性成分。适合的表面活 性剂包括但不限于聚山梨酯（吐温）80、20和81以及Dobanols(Shell Chemical Co. RTM)。
[0136] 本发明的抗微生物消毒剂组合物可以进一步包含本领域已知的表面消毒剂，例如 但不限于苯甲酸和PBT，优选可以与本发明的第一方面的组合、优选本发明的表达系统、甚 至更优选（重组）噬菌体相容的消毒剂。
[0137] 本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或另外的组合物和/或本发明 的第九和/或第十方面的单一组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。此类组合物优 选地作为药品或药物来使用。
[0138] 在第十一方面，本发明提供了一种根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的 第三和/或另外的组合物的组合和/或根据本发明的第九和/或第十方面的单一组合物作 为药物的用途。优选地，所述药物用于在受试者中预防或延迟葡萄球菌相关性病症，例如传 染性疾病。更优选地，本发明涉及一种用于治疗与葡萄球菌有关的病症的药学组合物或医 学组合物。优选地，本发明涉及一种用于治疗由细菌（优选葡萄球菌属的细菌，更优选物种 金黄色葡萄球菌的细菌）引起的传染性疾病的药学组合物或医学组合物。优选地，所述传 染性疾病是皮肤感染、乳腺炎、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、毒性休克综合征（TSS)、脓毒症、败 血症、菌血症或骨髓炎。优选地，所述皮肤传染是从由丘疹、脓疱病、疖子、疔疮（furuncle)、 蜂窝组织炎毛囊炎、痈肿、烫伤样皮肤综合征（scaled skin syndrome)和脓肿组成的群组 中选择的。
[0139] 根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或另外的组合物的组合和 /或根据本发明的第九和/或第十方面的单一组合物，当能够减少患者中或所述患者的细 胞中或细胞系中或游离在体外系统的细胞中存在的葡萄球菌属的量并且优选地是指仍然 能够检测到葡萄球菌属的起始量的99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%、5%或更少时，优选地其被视为是活性、功能性或治疗活性的或能够治疗、预防和/或 延迟传染性疾病。更优选地，不能检测到葡萄球菌属。在本段落中，表述"葡萄球菌属的量" 优选地是指存活的葡萄球菌。可以使用本领域技术人员已知的标准技术来检测所有属的葡 萄球菌，例如使用葡萄球菌特异性抗体的免疫组化技术、检测葡萄球菌凝固酶或"游离凝固 酶"的试管凝固酶试验、检测表面蛋白如凝集因子（滑动凝固酶试验）和/或蛋白A(商业 乳胶试验）。可以使用本领域技术人员已知的标准技术来检测存活的葡萄球菌，例如微生物 细菌培养技术和/或实时定量逆转录聚合酶链式反应以用于细菌mRNA的测定。
[0140] 根据本发明的减少优选地是通过在个体或患者的组织或细胞中、通过与在使用本 发明的所述组合物或多肽进行治疗前的所述个体或患者中的存在量进行比较来评估的。可 替代地，在局部治疗的情况下，可以用尚未用所述组合物或多肽治疗的所述个体或患者的 组织或细胞来进行比较。
[0141] 包括在本发明的范围内的是一种用于在个体中治疗、预防或延迟微生物相关性病 症的方法，包括向所述个体给予根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或 另外的组合物的组合。此外，本发明提供了根据本发明的第八方面的组合用于制造药物、优 选地为用于治疗、预防或延迟微生物相关性病症的药物的用途，其中所述第一、第二和可选 的第三和/或另外的酶促活性结构域被包含在不同的第一、第二和可选的第三和/或另外 的多肽上，其中所述第一、第二和可选的第三和/或另外的多肽被包含在单独的组合物中。
[0142] 根据本发明的第八方面的第一、第二和可选的第三和/或另外的组合物的组合和 /或根据本发明的第九和/或第十方面的单一组合物可以用来治疗感染有金黄色葡萄球菌 的动物，包含人类。任何合适的给予途径均可用于给予所述组合物的组合或所述单一组合 物，包括但不限于：口服、气雾剂或用于递送到肺的其他设备、鼻部喷雾、静脉内、肌肉内、腹 膜内、鞘内、阴道、直肠、局部、腰椎穿刺、鞘内以及直接应用至脑和/或脑膜。至少一周、一 个月、六个月、一年或更长时间向患者或所述患者的细胞、组织或器官给予本发明的组合物 的组合或单一组合物。在一个实施方式中，分别地给予根据本发明的第七方面所述的组合 物的组合。在一个可替代的实施方式中，所述组合被分开存储并且在立即给予之前时混合。 优选地，混合所述组合以包含等摩尔量的所述第一、第二和可选的第三和/或另外的多肽。 甚至更优选地，混合所述组合以包含等摩尔量的所述第一、第二和可选的第三和/或另外 的酶促活性结构域。
[0143] 在第十二方面，本发明提供了一种根据本发明的第八方面的组合物的组合或根据 本发明的第九和/或第十方面的单一组合物作为抗微生物剂（优选食品防腐剂或消毒剂） 的用途。抗微生物剂用于控制细菌，优选所述细菌是葡萄球菌，更优选地所述细菌是金黄色 葡萄球菌。优选地，抗微生物剂用于杀灭细菌，优选所述细菌是葡萄球菌，更优选地所述细 菌是金黄色葡萄球菌。消毒剂是一种专用于在无生命的物体上使用的抗微生物剂。
[0144] 在第十三方面，本发明提供了一种用于控制食品产品或饲料产品中、在食品或饲 料加工设备或医疗器械上和/或在食品或饲料加工设备或医疗器械中、在食品或饲料容器 上和/或食品或饲料容器中的微生物污染的方法，包括使根据本发明的第八方面的组合物 的组合或根据本发明的第九和/或第十方面的组合物接触所述食品或饲料产品、所述食品 或饲料加工设备或医疗器械和/或所述食品或饲料容器。
[0145] 优选地，根据本发明的方法被用于控制葡萄球菌属的细菌，更优选地是物种葡萄 球菌的细菌。优选地，所述控制的方法包括降低金黄色葡萄球菌细菌的计数和/或首先防 止它们在食品产品（包括但不限于乳品行业）以及食品加工装置（plant)(其中加工所述 食品产品）中的生长，例如它们在加工设备和食品工业设施中的其他位置上（例如食品储 藏容器）的生长。此外，所述控制方法包括降低葡萄球菌细菌的计数和/或首先防止它们 在医疗器械中的生长。优选地，所述控制的方法是用于清洗和消毒医疗器械（例如纤维内 窥镜如胃内照相机、腹腔镜、胸腔镜和关节镜）和医疗用品（如具有很长的管道或空心部分 且趋向于通过导入到人体中而重复利用的导管和管）。
[0146] 本发明的方法包括，通过包括但不限于混合、喷雾或直接施用根据本发明的第八 方面的组合物的组合和/或根据本发明的第九和/或第十方面的组合物的若干方式，将根 据本发明的第八方面的组合物的组合和/或根据本发明的第九和/或第十方面的组合物施 用到食品产品上或食品产品中、和/或食品加工装置内的各物理位置中、食品加工设备上 或中。
[0147] 在另外的实施方式中，本发明的所述第一方面的源的组合可以从所述源中分离出 来，其中所述源是一种表达系统，例如重组细胞或重组噬菌体可以直接施用或给予而不分 离出所述多肽。例如，生产本发明的第一和第二和可选的第三和/或另外的多肽的细胞可 以给予到受试者（人类或动物）或者施用到表面上，在该表面上，本发明的所述第一和第二 和可选的第三和/或另外的多肽会被分泌到食品中、到表面上或进入受试者的内脏（gut) 中。然后，本发明的组合可以结合并且可选地溶解存在于这样的环境中的细菌细胞，优选葡 萄球菌属的细菌，更优选物种金黄色葡萄球菌的细菌。本文中定义的应用显著地降低了本 来会存在的葡萄球菌细菌的数量，
[0148] 可选地，本发明的方法可以与本领域中已知的任何灭菌法或消毒剂例如超声波清 洗、照射或加热灭菌组合使用，通过将设备浸入到消毒液（如乙醇、铵、碘和/或醛消毒剂） 中，或者通过将器件保留在密闭的气氛（如福尔马林气体或环氧乙烷气体）中通过使用气 体灭菌。
[0149] 定义
[0150] 在氨基酸序列或核酸序列的上下文中的"序列同一性"或"同一性"在本文中定义 为通过比较序列确定的两个或更多个氨基酸（肽、多肽或蛋白质）序列或者两个或更多个 核酸（核苷酸、多核苷酸）序列之间的关系。在本领域中，视情况而定，"同一性"也指通过 这些序列的字符串之间的匹配来确定的氨基酸或核苷酸序列之间的序列相关性程度。在本 发明的范围内，与特定序列的序列同一性优选地是指在所述特定多肽或多核苷酸序列的整 个长度上的序列同一性。本文中所提供的序列信息不应被狭隘地解释为需要包括被错误鉴 定的碱基。本领域技术人员能够识别此类被错误鉴定的碱基并且知道如何纠正这类错误。
[0151] 两个氨基酸序列之间的"相似性"是通过将一个肽或多肽的氨基酸序列及其保 守氨基酸替代与第二肽或多肽的序列进行比较来确定的。在一个优选的实施方式中， 同一性或相似性是在本文中所确定的整个SEQ ID NO上来计算的。"同一性"和"相似 性"可容易地通过已知方法来计算，包括但不限于在以下中描述的那些：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.编,Oxford University Press, New York, 1988 ； Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.编，Academic Press, New York, 1993 !Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.编，Humana Press, New Jersey, 1994 !Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine,G. , Academic Press, 1987 ；以及 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux，J.编，M Stockton Press，New York，1991 ;以及 Carillo，H.和 Lipman，D·，SIAM J. Applied Math. , 48:1073(1988) 〇
[0152] 设计用于确定同一性的优选的方法以给出待测试序列之间的最大匹配。用于确定 同一性和相似性的方法被编入到公众可获得的计算机程序中。优选的用于确定两个序列之 间的同一'丨生和相似性的计算机程序方法包括，例如GCG程序包（Devereux, J.等，Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul，S. F.等，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))。BLAST X 程序可以公开地从 NCBI 及其他来源 (BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894 ;Altschul，S.等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990))获得。众所周知的Smith Waterman算法也可以用来确定同 一性。
[0153] 优选的用于多肽序列比较的参数包括如下：算法：Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);比较矩阵：BL0SSUM62,来自 Hentikoff 和 Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992);空位罚分：12 ;以及空位长度罚分：4。有用的使用 这些参数的程序可公开地从位于Madison, WI的Genetics Computer Group作为"Ogap"程 序而获得。上述的参数是用于氨基酸比较的默认参数（且对于末端空位没有罚分）。
[0154] 用于核酸比较的优选的参数包括如下：算法：Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);比较矩阵：匹配=+10,错配=0 ;空位罚分：50 ;空位长度罚分： 3。可以从位于Madison, Wis的Genetics Computer Group作为Gap程序而获得。以上给 出的是用于核酸比较的默认参数。
[0155] 可选地，在确定氨基酸相似性的程度时，本领域技术人员还可以考虑所谓的"保 守"氨基酸替代，这对本领域技术人员而言是清楚的。保守氨基酸替代是指具有相似侧链的 残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和 异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺的侧链的 一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和 色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一 组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨 酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所 公开的氨基酸序列的替代变体是，其中所公开的序列中的至少一个残基被除去且在其位置 中插入了不同的残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。每一个天然存在的氨基酸的 优选的保持替代如下：Ala替代为ser ;Arg替代为Iys ;Asn替代为gin或his ;Asp替代为 glu ;Cys替代为ser或ala ;Gln替代为asn ;Glu替代为asp ;Gly替代为pro ;His替代为 asn 或 gin ;Ile 替代为 leu 或 val ;Leu 替代为 ile 或 val ;Lys 替代为 arg ;gln 或 glu ;Met 替代为leu或ile ;Phe替代为met, leu或tyr ;Ser替代为thr ;Thr替代为ser ;Trp替代 为tyr ;Tyr替代为trp或phe ;以及，Val替代为ile或leu。
[0156] 多核苷酸由核苷酸序列表示。多肽由氨基酸序列表示。核酸构建体被定义为一种 从天然存在的基因中分离出的多核苷酸、或者经修饰而含有以本来不会在自然界中存在的 方式组合或并置的多核苷酸的区段的多核苷酸。可选地，存在于核酸构建体中的多核苷酸 被操作地连接至一个或多个控制序列，该控制序列引导所述肽或多肽在细胞或受试者中的 生产或表达。
[0157] 本文中使用的术语"异源序列"或"异源核酸"是指非天然发现的可操作地连接为 所述第一核苷酸序列的邻近序列的序列或核酸。本文中使用的术语"异源"可以是指"重组 体"。"重组体"是指一种遗传实体，其不同于通常在自然界中发现的遗传实体。当适用于核 苷酸序列或核酸分子时，这意味着所述核苷酸序列或核酸分子是克隆、限制和/或连接步 骤以及导致产生与在自然界中发现的序列或分子不同的构建体的其他工序的各种组合的 产物。
[0158] "可操作地连接"在本文中被定义为一种结构（configuration)，其中控制序列被适 当地放置在相对于编码本发明的多肽的核苷酸序列的位置上，使得所述控制序列引导本发 明的肽或多肽在细胞中和/或在受试者中的生产/表达。
[0159] "可操作地连接"也可以用来定义一种结构，其中将一个序列适当地放置在相对于 另一个编码功能性结构域的序列的位置上，从而在细胞中和/或在受试者中编码出嵌合多 肽。
[0160] "表达"应当理解为包括涉及生产肽或多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录 后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0161] 可选地，由存在于核酸构建体中的核苷酸序列表示的启动子被可操作地连接至另 一种编码本文中确定的肽或多肽的核苷酸序列。
[0162] 术语"转化（transformation) "是指在并入新DNA(即，对细胞为外源性的DNA) 后，在所述细胞中诱导的永久性或暂时性的遗传变化。当所述细胞是细菌细胞时，如本发明 所意指的，该术语是指染色体外的、自我复制的载体，其携带有（harbor)可选择的抗生素 抗性。
[0163] 表达载体可以是能够方便地进行重组DNA工序并且能够在细胞中和/或在受试者 中引起编码本发明的多肽的核苷酸序列的表达的任何载体。本文中使用的术语"启动子"是 指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个基因或核酸的转录，其位于该基因的转录起始 位点的转录方向的上游。其涉及由用于DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点 和任何其他DNA序列（包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点）、 以及本领域技术人员已知直接或间接地调控由所述启动子开始的转录的量的任何其他的 核苷酸序列的存在所确定的结合位点。在本发明的上下文中，启动子优选地终止于转录起 始位点（TSS)的核苷酸-1上。
[0164] 本文中使用的"多肽"是指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白质。多 肽是由连续氨基酸构成。术语"多肽"包括天然存在的或合成的分子。
[0165] 术语"控制序列"在本文中被定义为包括对于多肽的表达是必要的或有利的 任何组件。每个控制序列对于编码所述多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。这 样的控制序列包括但不限于前导序列、最佳翻译起始序列（如Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266:19867-19870中所描述的）、聚腺苷酸化序列、前肽序列、前原肽序列、启动子、信 号序列和转录终止子。在最低限度下，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。
[0166] 控制序列可以提供有接头，目的是用于引入特异性限制位点以便于该控制序列与 编码多肽的核酸序列的编码区进行连接。
[0167] 控制序列可以是适当的启动子序列，其为一种核酸序列，由宿主细胞识别用于表 达该核酸序列。启动子序列含有转录控制序列，该转录控制序列调节多肽的表达。启动子 可以是在细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括但不限于突变的、截短的和杂种的 (hybrid)启动子，并且可以获自编码相对于细胞为同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
[0168] 控制序列也可以是合适的转录终止子序列，其为一种由宿主细胞识别以终止转录 的序列。终止子序列可操作地连接到编码多肽的核酸序列的3'末端。在细胞中发挥功能 的任何终止子均可以在本发明中使用。
[0169] 控制序列也可以是合适的前导序列，其为一种对于由宿主细胞翻译是重要的mRNA 的非翻译区。前导序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的5'末端。在细胞中发挥 功能的任何前导序列均可以在本发明中使用。
[0170] 控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其为一种可操作地连接至核酸序列的3 '末端 的序列并且当转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。在细胞中 发挥功能的任何聚腺苷酸化序列均可以在本发明中使用。
[0171] 在本文件及其权利要求中，动词"包含（to comprise)"及其词形变化是在其非限 制性意义上来使用的，是指跟随在该词语后的项目被包括在内，但不排除没有具体提及的 项目。此夕卜，动词"由…组成（to consist) "可以替换为"基本上由......组成（to consist essentially of) "，是指本文中定义的产品或组合物或核酸分子或肽或多肽或核酸构建体 或载体或细胞除了所具体指明的组分之外还可以包含一种或多种另外的组分；所述一种或 多种另外的组分不改变本发明的独特特性。此外，由不定冠词"一个（a)"或"一种（an)" 提到的要素不排除存在多于一个所述要素的可能性，除非上下文清楚地要求有且仅有一个 要素。因此，不定冠词一个（a)"或"一种（an)"通常是指"至少一个/至少一种（at least one)"。
[0172] 本说明书中引用的所有专利和参考文献均在此通过参考而以它们的整体并入本 文。
[0173] 下列提供的实施例仅用于说明性目的并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0174] 图1 :半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)结构域、肽链内切酶结构 域（肽酶_M23)、酰胺酶结构域（Ami2638)、胞壁质酶结构域和氨基葡萄糖苷酶结构域的靶 键位点。
[0175]图 2:部分纯化的蛋白质的 SDS PAGE。I :HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)， 2:HXaM23-LST_CWT-匪3(SEQ ID N0:48)，3:HXaM23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:44)， 4:HXaCHAPTw_CWT-匪3(SEQ ID N0:42)，5:HXaCHAPTw_CWT-LST(SEQ ID N0:40)，6: HXaCHAPTw_CBD2638(SEQ ID NO:38), 7 ：HXaCHAPK_CWT-NM3(SEQ ID NO:36), 8 ：HXaCHAPK_ CWT-LST(SEQ ID NO:34),9 ：HXaCHAPK_CBD2638 (SEQ ID NO:32),10 ：HXaAmi2638_ CWT-匪3(SEQ ID N0:30),ll:HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28),12:HXaAmi2638_ CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0176] 图 3 :部分纯化的蛋白质的 SDS PAGE。I :HXaCHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:32)，2 : HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), 3 ：HXaCHAPK_CWT-NM3(SEQ ID NO:36), 4 ：HXaCHAPK_ CHAPK_CBD2638(SEQ ID NO:56),5 ：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST (SEQ ID NO :58),6： HXaCHAPK_CHAPK_CWT-NM3(SEQ ID N0:60)〇
[0177] 图 4 :部分纯化的蛋白 SDS PAGE。I :HXaAmi23638_Ami2638_CBD2638(SEQ ID N0:50),2 ：HXaAmi23638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52),3 ：HXaAmi23638_ Ami2638_CWT-NM3(SEQ ID N0:54)，4:HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:68)，5: HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0178] 图5 :含有CHAPK的溶素（Iysin)在50nM和200nM蛋白质测定浓度下针对金黄色 葡萄球菌BB270细胞的效果。所测试的构建体：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58) 和 HXaCHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:56)。
[0179] 图6 :含有M23-LST的溶素在50nM和200nM蛋白质测定浓度下针对金黄色葡萄球 菌 BB270 细胞的效果。所测试的构建体：HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)、 HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:68)和 HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)。
[0180] 图7 :含有Ami2638的溶素在50nM和200nM蛋白质测定浓度下针对金黄色葡萄球 菌 BB270 细胞的效果。所测试的构建体：HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)、 HXaAmi2638_Ami2638_CBD2638(SEQ ID N0:50)、HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28)、 HXaAmi2638_CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0181] 图8 :50nM具有相等CBD的蛋白质混合物（16. 67nM每种蛋白质）的比较。所测试的 构建体：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)、HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:70) ,HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52), HXaCHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQ ID NO:56)、HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID NO:68)、HXaAmi2638_Ami2638_CBD2638(SEQ IDN0:50)、HXaCHAPK_CBD2638(SEQIDN0:32)、HXaM23-LST_CBD2638(SEQIDN0:44)和 HXaAmi2638_CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0182] 图9 :200nM具有相等CBD的蛋白质混合物（66. 67nM每种蛋白质）的比较。所测试 的构建体：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)、HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:70) ,HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52),HXaCHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:56)、HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:68)、HXaAmi2638_Ami2638_ CBD2638(SEQ ID N0:50)、HXaCHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:32)、HXaM23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:44)和 HXaAmi2638_CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0183]图 10 :HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)、HXaM23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID N0:70)和HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)在（16.67nM 以及 66. 67nM的每种蛋白质）下的蛋白质混合物与50nM和200nM参考蛋白质M23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID NO:70)的比较。
[0184] 图11 :含有CHAPK、M23和Ami的溶素在30nM蛋白质测定浓度下针对金黄色葡萄球 菌 BB270 细胞的效果。所测试的构建体：HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28)、HXaCHAPK_ CffT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46), HXaAmi2638_Ami2638_ CWT-LST(SEQ ID N0:52)、HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_ M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0185] 图12:30nM蛋白质混合物（15nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaAmi2638_CffT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO: 34), HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)和 HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)。
[0186] 图13:30nM蛋白质混合物（15nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28),HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46),HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0187] 图14 :30nM蛋白质混合物（15nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:34)、HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)、HXaCHAPK_ CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0188] 图15:30nM蛋白质混合物（IOnM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_ CWT-LST (SEQ ID NO:46)、HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52)、HXaCHAPK_CHAPK_ CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70).
[0189] 图16 :含有CHAPK、M23和Ami的溶素在50nM蛋白质测定浓度下针对金黄色葡萄球 菌 BB270 细胞的效果。所测试的构建体：HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28)、HXaCHAPK_ CffT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46), HXaAmi2638_Ami2638_ CWT-LST(SEQ ID N0:52)、HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_ M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0190] 图17 :50nM蛋白质混合物（25nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)和 HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)。
[0191] 图18 :50nM蛋白质混合物（25nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46), HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0192] 图19 :50nM蛋白质混合物（25nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:34)、HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)、HXaCHAPK_ CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0193] 图20 :50nM蛋白质混合物（16. 67nM每种蛋白质）的效果。所测试的构建体： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_ CffT-LST(SEQ ID NO:46),HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52),HXaCHAPK_CHAPK_ CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。 实施例
[0194] 实施例I
[0195] 材料和方法
[0196] 细菌、噬菌体和质粒
[0197] 在本研究中使用的用于克隆和蛋白质生产的细菌菌株、噬菌体以及质粒列 于表 1 中。大肠杆菌 XLl-Blue MRF (Stratagene, La Jolla, CA, U. S.)和大肠杆菌 Sure(Stratagene)用于克隆和过表达N-末端6xHis_标记的重组融合蛋白质。在大肠杆 菌Sure菌株中处理含有重复序列的构建体。在37°C下在补充有100 μ g/ml氨苄青霉素 和30 μ g/ml四环素的Luria-Bertani(LB)培养基中培养大肠杆菌用于克隆，并且在30°C 下在补充有100 μ g/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中培养大肠杆菌以便 在蛋白质表达期间进行质粒选择。金黄色葡萄球菌BB270NCTC8325mec用作溶解测定中 的底物，其在37°C下生长在半浓缩的脑心浸液培养基（Brain Heart Infusion medium) (BHI，Biolife，Milano, Italy)中。从两升培养物中收获对数期细胞，用PBST (50mM NaH2PO4, 120mM NaCl，0. 1%吐温20, pH 7. 4)洗涤，浓缩100倍并且将其等分试样存贮在-80°C下。
[0198] DNA技术和克隆程序
[0199] 使用标准技术（Loessner 等· Mol Microbiol 2002,44:335-349 ; Sambrook 等.1989Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)来进行融合蛋白质的克隆和构建。酶购自 New England Biolabs (Ipswitch, MA, U. S. ) > Fermentas (Burlington, Canada, Roche Basel, Switzerland)和 Qiagen。来自噬菌体 Φ 2638a、Φ 187、ΦΚ 和 C1Twort 的内溶素和分 离的酶促活性域（EAD)编码区由纯化的噬菌体DNA或噬菌体溶解物进行框架扩增得到。以 质粒DNA作为模板使用高保真PCR酶混合物（High Fidelity PCR Enzyme Mix) (Fermentas) 扩增溶葡萄球菌素的EAD编码基因片段。通过引物导入用于将连接物（ligation)插入到 pQE-30蛋白质表达质粒（Qiagen)及其衍生物中的限制性酶切位点。在本研究中构建或使 用的质粒列于表1中。将蛋白质表达质粒转化到电转感受态（electro-competent)大肠杆 菌XLlBlueMRF'中并且将含有重复序列的质粒转化到电转感受态大肠杆菌Sure中。使用 分光光度计（NanoDrop ND-1000 分光光度计，Thermo scientific, Waltham, MA, U. S.)来确 定DNA浓度。通过核苷酸测序（GATC, Konstanz, Germany)来确认序列完整度。
[0200] 分别带有单个N-末端酶促活性结构域（EAD)和C-末端细胞壁结合结构域（CBD) 或细胞壁靶向结构域（CWT)的构建体是用剪接重叠延伸PCR(SOE)生成各个编码区的框内 融合体来构建的。将这些片段插入到pQE_30Xa载体DNA的SacI - Sail限制性酶切位点中。 在这些载体的基础上，通过将各个EAD编码序列导致到StuI - SacI位点中而获得具有重复 两重EAD的构建体。对于完整的构建原理，请参见表1。
[0201] 重组融合蛋白质的表达及纯化
[0202] 如先前其他人所描述的（Loessneret al. · Appl Environ Microbiol 1996, 62:3057-3060 ；Schmelcher et al. Appl Environ Microbiol 2010,76:5745-5756； Eichenseher et al·, unpublished),采用较小的改动以进行蛋白质的过表达和N-末端 6xHis标记的蛋白质的固定化金属亲和色谱法（IMAC)纯化。简略地，通过向在30°C于LB 培养基中生长的对数期大肠杆菌培养物中加入〇. 2-0. 5mM IPTG以诱导异源蛋白质表达。 在通过离心收获前，在相同的温度下进一步培养细胞。通过穿过在1200psi下操作的弗氏 细胞压碎器（French Pressure Cell Press) (1200psi, SLM Aminco, Urbana, IL, U. S.)的双 通道将大肠杆菌裂解在固定缓冲液（50禮似托?04,500!111恥(：1，51111咪唑，0.1%吐温20，？!1 7.4)中。通过离心和过滤灭菌（0.2μπι PES薄膜，Millipore)去除不溶性细胞碎片，然后 在装填有低密度 Ni-NTA 超流树脂（Chemie Brunschwig AG, Basel, Switzerland)的 Micro Biospin (Bio-Rad，Hercules，CA, U. S.)柱中进行重力流IMAC纯化。洗涤柱后，使用洗脱缓 冲液（50禮恥4?04,5001111似(：1，1251111咪唑，0.1%吐温20，？!17.4)洗脱出61把8标记的 蛋白质，并且相对于透析缓冲液（50mM NaH2PO4, IOOmM NaCl，0. 1 %吐温20, pH 7. 4)进行透 析。使用 EconoPak IODG 柱（Biorad)，使用 CHAP 缓冲液（50mM Tris，5mM CaCl2,10%甘油， pH 7. 4)，使含有CHAP同源结构域的蛋白质经受缓冲液更换。通过SDS-PAGE来估计蛋白质 纯度并且通过分光光度法（NanoDrop ND-1000分光光度计）或使用Pierce BCA蛋白质测 定试剂盒（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, U.S.)根据制造商的手册来确定蛋白 质浓度。将蛋白质存贮在_20°C下的50%甘油中。
[0203] 裂解动力学的光度测定
[0204] 使用 Wallac VICT0R3TM14200 (Perkin Elmer, Waltham, MA, U. S.)多标记计数 器装置以浊度降低测定法来测量裂解活性。用缓冲液洗涤来自冷冻储备的底物细胞并 且使用大比色杯（Macro Cuvette) (Greiner Bio-one, Kremsmiinster, Austria)和分光 光度计（BioChrom, Cambridge, UK)将 595nm 下的光密度（OD595nm)调节为 1+/-0. 05。用 缓冲液将葡萄球菌裂解酶稀释至等摩尔量，并且如果需要，随后合并以得到的酶的混合 物。使用多道移液管，将ι〇μ1蛋白质溶液分配至水晶级多孔聚苯乙烯组织培养试验 板（SPLLifesciences, Poncheon-Si, Korea)中并且与190μ1底物细胞悬浮液混合。在 读数之间中剧烈摇晃板，在OD595nm下监测浊度随时间的降低。作为用于监测在给定条件 下的自裂解活性（autolytic activity)的对照，采用10μ1缓冲液或水。测定进行一 式三份。如别处所描述的（Korndorfer 等.J Mol Biol2006, 364:678-689 ;Schmelcher 等，Microb Biotechnol. 2011，4(5) :651-662)来得相对活性值的计算值。将反曲的（S形 的，Sigmoidal)裂解和对照曲线归一化为共同初始值1。
[0205] 结果
[0206] 细胞内表达的葡萄球菌裂解蛋白的下游加工产生可溶性蛋白质，其纯度取决于所 述蛋白质的结构和来源。大多数构建体具有通过SDS-PAGE估计的最高达>90%的纯度（图 2-4)。
[0207] 我们在浊度降低测定法（裂解测定法）中测试了部分纯化的蛋白质的选择性。在 pH 7. 4的PBST缓冲液中并且在不同的蛋白质浓度下针对来自冷冻储备的金黄色葡萄球菌 BB270细胞测试了个体溶素及它们的组合。CHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58,由SEQ IDN0:47编码）和CHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQIDN0:56，由SEQIDN0:55编码）蛋白质 在50nM测定浓度下针对设定至为?1的595nm处的光密度（0D595nm)的细胞悬浮液几乎 不具有活性，但是在200nM测定浓度下显示出显著的活性（图5)。
[0208] 在相同的测定设置中使用含有M23-LST(SEQIDN0:16，由SEQIDN0 :15编码） 的蛋白质，在 200nM 测定浓度下使用 M23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70,由 SEQ ID NO:69编码）达到了最好的结果。CWT-LST(SEQ ID NO:4,由SEQ ID NO:3编码）似乎优于 CBD2638(SEQIDN0:6，由SEQIDN0:5编码）。此外，发现重复的双M23-LST变体（SEQID NO: 68 和 70,分别由 SEQ ID NO: 67 和 69 编码）优于单一的 M23-LST(SEQ ID NO: 44 和 46， 分别由SEQ ID N0:43和45编码）。发现在50nM蛋白质浓度下这种效果更加明显。对于全 部结果，请参见图6。
[0209] 与CHAPK(SEQIDN0:10，由SEQIDN0:9编码）和M23-LST(SEQIDN0:16，由 SEQ ID NO: 15 编码）蛋白质相比，用 Ami2638(SEQ ID NO: 18,由 SEQ ID NO: 17 编码）构 建的所有溶素均显著地活性更低。此处，CBD2638(SEQ ID N0:6,由SEQ ID N0:5编码）优 于CWT-LST(SEQIDN0:4，由SEQIDN0:3编码）。当与CBD2638(SEQIDN0:6，由SEQID N0:5编码）组合时，重复的催化结构域的效果甚微，但是当与CWT-LST(SEQ ID N0:4,由SEQ ID NO:3编码）组合时，重复对裂解动力学带来积极的效果（图7)。
[0210]我们还比较了用 CWT-LST(SEQ ID N0:4,由 SEQ ID N0:3 编码）或 CBD2638(SEQ ID N0:6,由SEQ ID N0:5编码）构建的蛋白质的混合物的活性。发现在低蛋白质浓度（分别 为16·67ηΜ每种蛋白质浓度或50nM总蛋白质浓度）下，CWT-LST(SEQ ID N0:58、70和52) 蛋白质的混合物比CBD2638(SEQ ID N0:56、68和50)蛋白质的混合物显著地更具活性。此 夕卜，重复的EAD在CBD2638构建体混合物（SEQ ID NO:56、68和50相比于SEQ ID NO:32、 44和26)中对裂解动力学的影响不大（图8)。将蛋白质的测定浓度增加至200ηΜ(66. 67nM 每种）导致具有重复的双EAD的CWT-LST和CBD2638构建体的活性几乎相等。尽管看起来 CBD2638构建体的裂解曲线（图9)在CWT-LST构建体的曲线"之上"运行，但是我们估计裂 解动力学是相等的。这仅仅是因为测定是在96孔板中实施的，而OD595nm测量不是在赖氨 酸（lysine)添加后的同一时间点开始的。曲线的第一次测量已经是在裂解已经开始的阶 段，因此将曲线归一化为1的初始〇D595nm将曲线移到到了更高的值。与在50nM的蛋白质 浓度不同，未发现仅具有单个EAD的CBD2638构建体混合物与重复两倍的EAD-CBD2638构 建体具有相等的活性，而是显示出更低的裂解动力学。
[0211] 最后，我们将由 Ami2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52,由 SEQ ID N0:51 编 码）、CHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58,由 SEQ ID N0:57 编码）和 M23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID N0:70,由SEQ ID N0:69编码）组成的最有效的混合物与最有效的参比蛋 白质M23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70,由 SEQ ID N0:69编码）进行了 比较。在两个 测试的浓度（50nM和200nM总蛋白质浓度）下，均发现该混合物略优于M23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID NO:7〇,由 SEQ ID NO:69 编码）（图 10)。
[0212] 实施例2
[0213] 材料与方法
[0214] 使用如在实施例1的材料和方法章节中所述的浊度降低测定法，测试了根据实施 例1生产的单一蛋白质构建体以及蛋白质构建体的组合/混合物的裂解动力学。
[0215] 结果
[0216] 图11至图20中示出了蛋白质及混合物的裂解曲线。由这些曲线，使用SigmaPlot 软件用5-参数反曲拟合模型计算了每种蛋白质或混合物的最大测量活性。斜率的一阶导 数是光密度（〇D595nm)的最大下降并且被定义为最大测量活性。表3为每种蛋白质或混合 物的最大测量活性的汇总表。
[0217] 表1 :细菌菌株、噬菌体和质粒
[0218]
【权利要求】
1. 一种第一酶促活性结构域的源与第二酶促活性结构域的源的组合，其中所述第一酶 促活性结构域和第二酶促活性结构域各自表现出不同的靶键特异性并且被包含在不同的 第一多肽和第二多肽上。
2. 根据权利要求1所述的组合，其中所述不同的靶键是细菌细胞的肽聚糖层中必不可 少的键，优选地其中所述细菌细胞是葡萄球菌。
3. 根据权利要求2所述的组合，其中所述第一酶促活性结构域和/或所述第二酶促活 性结构域是从由半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构域，肽链内切酶结构域，酰 胺酶结构域和糖基水解酶组成的群组中选择的结构域。
4. 根据权利要求1-3所述的组合，其中所述第一多肽和所述第二多肽包含不同多重性 的所述第一酶促活性结构域和/或所述第二酶促活性结构域。
5. 根据权利要求1-4所述的组合，其中所述不同的第一多肽和第二多肽中的每一个进 一步包含细胞壁结合结构域。
6. 根据权利要求5所述的组合，其中： -所述第一酶促活性结构域是半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶结构域并且 所述第二酶促活性结构域是肽链内切酶结构域， _所述组合进一步包含第三酶促活性结构域的源，所述第三酶促活性结构域被包含在 不同的第三多肽上， -所述第三酶促活性结构域是酰胺酶结构域， -所述不同的第三多肽进一步包含细胞壁结合结构域，并且 -所述不同的第一多肽、第二多肽和第三多肽中的每一个包含多重性的所述第一酶促 活性结构域、第二酶促活性结构域和第三酶促活性结构域。
7. 根据权利要求6所述的组合，其中所述第一多肽包含与SEQ ID N0:58具有至少80% 序列同一性的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID N0:70具有至少80%序列同一性的序列并 且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少80%序列同一性的序列。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的组合，其中所述第一酶促活性结构域的源包含多 肽和/或所述第二酶促活性结构域的源包含多肽。
9. 根据权利要求1-7中任一项所述的组合，其中所述第一酶促活性结构域的源包含编 码所述第一酶促活性结构域的多核苷酸和/或所述第二酶促活性结构域的源包含编码所 述第二酶促活性结构域的多核苷酸。
10. 根据权利要求9所述的组合，其中编码所述第一酶促活性结构域的所述多核苷酸 存在于表达构建体中和/或编码所述第二酶促活性结构域的所述多核苷酸存在于表达构 建体中，优选地其中所述表达构建体存在于表达系统中。
11. 一种包含根据权利要求1-10中任一项所述的组合的组合物。
12. 根据权利要求11所述的组合物，进一步包含药物上可接受的载体和/或从由噬菌 体、抑菌剂、杀菌剂、抗生素、表面活性剂和/或酶组成的群组中选择的另外的活性成分。
13. 根据权利要求11或12所述的组合物，用于作为药物使用，优选地用于在受试者中 治疗、预防或延迟葡萄球菌相关的病症。
14. 根据权利要求11或12所述的组合物作为抗微生物剂的用途，优选地作为食品防腐 剂或消毒剂。
15. -种用于控制食品产品或饲料产品中、食品或饲料加工设备或医疗器械上和/或 食品或饲料加工设备或医疗器械中、食品或饲料容器上和/或食品或饲料容器中的微生物 污染的方法，包括使根据权利要求11或12所述的组合物接触所述食品产品或饲料产品、所 述食品或饲料加工设备或医疗器械和/或所述食品或饲料容器。
【文档编号】A61K38/52GK104428413SQ201380036354
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2012年5月7日
【发明者】马丁·约翰内斯·勒斯纳, 弗里茨·艾兴泽埃尔 申请人:迈克瑞欧斯人体健康有限公司