一种羟基磷灰石纳米管的制备方法及在骨修复方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种具有载药能力的羟基磷灰石纳米管，它的孔径约为100-200nm。本发明利用廉价易得的纳米羟基磷灰石粉末(droxyapatite，HA)、聚乙烯醇粉(polyvinyl alcohol，PVA)、聚乙烯吡咯烷酮粉(Polyvinylpyrrolidone，PVP)，采用三维打印技术制备制备羟基磷灰石纳米管。利用三维打印技术并结合生物体骨骼的三维孔隙等特点设计具有仿生功能的羟基磷灰石纳米管，装载BMP-7或庆大霉素等抗生素的作用，提高对抗生素的吸附能力，并在大段桡骨缺损的动物模型中验证该羟基磷灰石纳米管的体内生物相容性及修复骨缺损的能力，为临床治疗大段骨缺损提供理想的治疗材料和治疗技术。本发明公开了其制备方法。
【专利说明】一种羟基磷灰石纳米管的制备方法及在骨修复方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纳米羟基磷灰石纳米管的制备方法和在生物医学方面的应用。
【背景技术】
[0002]大段骨缺损常见于车祸等高能损伤导致的粉碎性骨折及骨髓炎的清创手术等，随着社会交通的发展，车祸导致的大段骨缺损在临床上越来越常见，并且由于常伴有感染，其治疗非常困难，除了局部和全身应用敏感抗生素外，彻底清除病灶部位的坏死组织是有效控制骨感染的关键所在，而清除坏死的骨组织必然会导致或加重骨缺损，常需要植骨以促进骨愈合。自体骨移植供骨量有限并存在取骨区感染风险，而同种异体骨移植存在传染疾病的可能，使得骨移植的应用受到限制。
[0003]近代组织工程的快速发展，为其治疗提供了新方法，采用组织工程技术构建多孔支架，并复合种子细胞及生长因子，移植填充骨缺损部位可达到恢复、改善组织功能的目的。
[0004]羟基磷灰石(CalO (P04) 6 (OH) 2)，是动物的硬组织如骨骼、牙齿等的主要无机矿物成分，由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性，作为骨修复、骨接枝的主要原材料而被广泛的应用于生物医药领域。大量的生物相容性试验证明，人工合成的羟基磷灰石和天然的羟基磷灰石一样无毒、无刺激、不致过敏反应、不致突变、不致溶血，不破坏生物组织，并能与骨形成牢固的化学结合，是一种很有应用前景的人工骨。
[0005]研究发现人工合成的纳米羟基磷灰石粉体具有较高的比表面积和良好的吸附性能，作为一种新型的、环境友好和高效的吸附剂，被广泛地应用于生物蛋白质的吸附与分离、酚类化合物的吸附与分离，色谱柱、药物缓释载体、含重金属离子废水的吸附分离等领域。
[0006]基于近年来以三维打印技术为突出代表的快速成型技术的成熟和崛起，我们拟将三维打印技术应用于骨组织工程的研究中，参照目标部位人体骨骼MicroCT等数据，从而获得更接近人体骨组织结构的羟基磷灰石纳米管。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种具有载药能力的羟基磷灰石纳米管，能够装载BMP-7或庆大霉素等抗生素的作用，提高对抗生素的吸附能力，并且能稳定、持久地释放，从而增强抗菌能力，加快骨组织修复。
[0008]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]纳米轻基磷灰石粉末(droxyapatite,HA)干燥后过筛,选取粒径约150trm的粉粒备用。HA和聚乙烯醇粉(polyvinyl alcohol,PVA)配比成混合粉末,置于铺粉槽。聚乙烯批咯烧酮粉(Polyvinylpyrrolidone,PVP)溶于蒸懼水,配成浓度0.05%的溶液,注入干净的嗔墨盒。
[0010]本发明所采用三维打印机为MAM微喷射立体打印式快速成形机(上海富奇凡机电科技有限公司)。根据兔桡骨MicroCT扫描数据，在三维打印机控制软件上设置好打印参数，在计算机控制下，三维打印机主要完成逐层铺粉、黏结粉末、精确喷置BMP-7或庆大霉素于特定部位3个步骤，最终完成设计的载药羟基磷灰石纳米管，打印步骤如下:
[0011](1)设定三维打印机控制软件，确定各层截面的轮廓数据和打印参数。
[0012](2)在工作平台上铺一层羟基磷灰石粉末，滚筒碾平，去除多余粉末。
[0013](3)三维打印机上的打印头在计算机控制下，按照该层截面的轮廓数据在平面上运行，喷涂打印液(黏结剂)，将粉末混合物黏结起来形成二维片状实体，同时
[0014]在特定部位精确喷置BMP-7或庆大霉素。
[0015](4)工作平台下降一层厚度的距离，重复步骤2和3，逐层叠加，直至完成整个高度。
[0016](5)干燥。去掉多余的支撑粉末。
[0017](6)室温静置干燥12h。去除多余的支撑粉末，真空干燥7d去除有机溶剂。
[0018]外观及孔隙观察
[0019]正中水平剖开制备的羟基磷灰石纳米管，观察正中横截面结构，并置于铜台上喷金，扫描电子显微镜观察断层结构。
[0020]扫描电镜显示(图1，图2，图3，图4，图5，图7)，该载药羟基磷灰石纳米管呈多孔结构，粉粒粘结良好，微孔分布均匀，互相连通，大小相仿，孔径约为100-200nm，预实验显示，该羟基磷灰石纳米管可装载庆大霉素。
[0021]本发明的有益效果是:
[0022]1、利用廉价易得的纳米轻基磷灰石粉末(droxyapatite, HA)、聚乙烯醇粉(polyvinyl alcohol,PVA)、聚乙烯卩比咯烧酮粉(Polyvinylpyrrolidone,PVP),采用 3 维打印技术制备制备羟基磷灰石纳米管。
[0023]2、作为骨修复的药物载体无毒、无刺激、不致过敏反应、不致突变、不致溶血，不破坏生物组织，并能与骨形成牢固的化学结合，是一种很有应用前景的人工骨。
[0024]3、羟基磷灰石纳米管，利用三维打印技术的优点，模拟人体骨的三维特性，具有特定的三维孔隙结构，且能达到装载BMP-7或庆大霉素等抗生素的作用，提高对抗生素的吸附能力，并且能稳定、持久地释放，从而增强抗菌能力。
[0025]4、利用三维打印技术并结合生物体骨骼的三维孔隙等特点设计具有仿生功能的羟基磷灰石纳米管，并在大段桡骨缺损的动物模型中验证该羟基磷灰石纳米管的体内生物相容性及修复骨缺损的能力，为临床治疗大段骨缺损提供理想的治疗材料和治疗技术。
[0026]5、本项发明工艺简单、操作方便、且成本低、没有环境污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是本发明所制备的羟基磷灰石纳米管的透射电镜下图像。
[0028]图2是本发明所制备的羟基磷灰石纳米管的扫描电镜下图像。
[0029]图3是本发明所制备的羟基磷灰石纳米管高分辨率图像。
[0030]图4是本发明所制备的羟基磷灰石纳米管高分辨率图像。
[0031]图5是本发明所制备的羟基磷灰石纳米管高分辨率图像。
[0032]图6为本发明所制备的羟基磷灰石纳米管，结构图。
[0033]图7是本发明获得的羟基磷灰石纳米管微观结构。
[0034]图8是羟基磷灰石纳米管装载装载BMP-7后电镜下图像。
[0035]图9是羟基磷灰石纳米管装载装载BMP-7后电镜下图像。
[0036]图10是羟基磷灰石纳米管释放BMP-7后电镜下图像
[0037]图11是羟基磷灰石纳米管释放BMP-7后电镜下图像。
[0038]图12装载BMP-7的羟基磷灰石纳米管，体外药物试验显示，药物释放时间长趋势图。
【具体实施方式】
[0039]一、纳米轻基磷灰石粉末(droxyapatite, HA)干燥后过筛,选取粒径约150trm的粉粒备用。HA和聚乙烯醇粉(polyvinyl alcohol,PVA)配比成混合粉末,置于铺粉槽。聚乙烯卩比咯烧酮粉(Polyvinylpyrrolidone,PVP)溶于蒸懼水,配成浓度0.05%的溶液,注入干净的喷墨盒。根据兔桡骨MicroCT扫描数据，在三维打印机控制软件上设置好打印参数，在计算机控制下，三维打印机主要完成逐层铺粉、黏结粉末、精确喷置BMP-7或庆大霉素于特定部位3个步骤，最终完成设计的载药羟基磷灰石纳米管，打印步骤如下:
[0040](I)设定三维打印机控制软件，确定各层截面的轮廓数据和打印参数。
[0041](2)在工作平台上铺一层羟基磷灰石粉末，滚筒碾平，去除多余粉末。
[0042](3)三维打印机上的打印头在计算机控制下，按照该层截面的轮廓数据在平面上运行，喷涂打印液(黏结剂)，将粉末混合物黏结起来形成二维片状实体，同时在特定部位精确喷置BMP-7或庆大霉素。
[0043](4)工作平台下降一层厚度的距离，重复步骤2和3，逐层叠加，直至完成整个高度。
[0044](5)干燥。去掉多余的支撑粉末。
[0045](6)室温静置干燥12h。去除多余的支撑粉末，真空干燥7d去除有机溶剂。
[0046]二、以下结合实例进一步说明本发明。
[0047]实施例1:
[0048]取10mg复合材料试样浸入4mL磷酸盐缓冲液中(pH = 7.4)，然后置于37°C恒温箱中。于浸泡后24h取出样本，8000r/min离心15分钟，吸取浸出液，用PBS液冲洗管壁I次，更换PBS液，继续浸泡。用分光光度计法检测浸出液样本中的BMP-7浓度，全部实验均在无菌操作下进行。最终计算从复合物材料释放出来的BMP-7含量并且用药物释放模型进行拟合。羟基磷灰石纳米管装载庆大霉素释放前后电镜图。(图8、9、10、11)
[0049]实施例2:
[0050]选用雄性6月龄新西兰兔15只，采用氯胺酮50mg/kg肌肉注射，3%戊巴比妥钠20mg/kg耳缘静脉麻醉，麻醉成功后，双侧前臂备皮，取仰卧位固定于兔板，手术区消毒，铺无菌单。于前臂桡侧中上段切开皮肤、皮下组织及筋膜，分离肌肉以显露桡骨骨膜，以桡骨弧顶为中点，用手术刀片去除桡骨骨膜，后用装载直径Icm砂轮磨片的骨科电钻将去除骨膜的桡骨截除，并仔细分离已切除桡骨的尺侧骨膜，制作缺损长度为1.5cm的骨缺损。术中注意桡骨骨缺损两断面平行，并垂直于尺骨纵轴，桡骨截取后，用20ml生理盐水将缺损处骨碎屑、骨髓组织等冲洗彻底。随机选取一侧作为空白对照组，不予任何放置材料；另一侧作为治疗组，放置前述步骤中获取的羟基磷灰石纳米管材料3g，然后依次缝合肌膜及皮下组织、皮肤，碘伏消毒切口并仔细包扎，单笼饲养。术后连续3天肌肉注射青霉素80万单位。分别于术后每4周行CT摄片检查，术后12周时处死，取病灶部位组织进行病理组织学检查。收集植入部位骨组织、软组织和血液样品；采用高效液相色谱法检测各样品中BMP-7的药物浓度。(图12)
【权利要求】
1.一种具有载药能力的羟基磷灰石纳米管，其特征是:它是直径100-200=%长度依据具体需要待定的羟基磷灰石纳米管。
2.一种制备权要求1所述的羟基磷灰石纳米管的方法，其特征是包括以下步骤: 步骤1:设定三维打印机控制软件，根据目标部位骨骼'微结构特征，确定各层截面的轮廓数据和打印参数。 步骤2:在工作平台上铺一层羟基磷灰石粉末，滚筒碾平，去除多余粉末。 步骤3:三维打印机上的打印头在计算机控制下，按照该层截面的轮廓数据在平面上运行，喷涂打印液(黏结剂)，将粉末混合物黏结起来形成二维片状实体，同时在特定部位精确喷置81？-7或庆大霉素。 步骤4:工作平台下降一层厚度的距离，重复步骤2和3，逐层叠加，直至完成整个高度。 步骤5:干燥。去掉多余的支撑粉末。 步骤6:室温静置干燥121去除多余的支撑粉末，真空干燥7(1去除有机溶剂。
3.根据权利要求2所述上述的制法，其特征是:步骤1所述的3维打印机是，嫩1微喷射立体打印式快速成形机(上海富奇凡机电科技有限公司)，或具有相同功能的打印机。
4.根据权利要求2所述制法，其特征是，混合粉末为纳米羟基磷灰石粉末 叩社和聚乙烯醇粉&1001101, 的混合物。
5.根据权利要求2所述制法，其特征是，打印液(黏结剂)为聚乙烯吡咯烷酮粉(^017^111711)7^011(10116,户乂?)溶于蒸懼水，浓度 0.05% 的溶液。
6.根据权利要求2所述制法，其特征是，所承载喷置的抗生素为8腿^-7或庆大霉素等。
7.权利要求1所述的羟基磷灰石纳米管在骨修复或骨接枝中的应用。
【文档编号】A61L27/12GK104288832SQ201410336276
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】郑欣, 陈一心, 郭向可, 王晓波, 邱旭升, 王骏飞, 施鸿飞, 熊进 申请人:郑欣