本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术：
：慢性肾衰竭(CRF)是指各种原因造成慢性进行性肾实质损害，致使肾脏明显萎缩，不能维持基本功能，临床出现以代谢产物潴留，水、电解质、酸碱平衡失调，全身各系统受累为主要表现的临床综合征。主要病因有原发性肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、高血压肾小动脉硬化、糖尿病肾病、继发性肾小球肾炎、肾小管间质病变、遗传性肾脏疾病以及长期服用解热镇痛剂及接触重金属等。全球共有几亿患者，仅中国就有1亿多人。但这个疾病并未被广泛诊断，其危害也远不如糖尿病、高血脂被大众耳熟能详。但其最终结果是晚期肾衰竭。肾功能出现障碍后，体内会分泌甲状旁腺以维持血钙和血磷的浓度，但一旦透析开始甲状旁腺过高可能有危险的后果。甲状旁腺增加血钙但降低血磷，肾衰竭患者由于血钙降低、血磷上升，所以甲状旁腺分泌代偿性增加。Velcalcetide用于接受透析的慢性肾病患者的继发性甲状旁腺功能亢进。Velcalcetide结构如式Ⅰ所示：由于Velcalcetide属于肽类药物，极不稳定，通常只能在2-8℃下保存，不利于velcalcetide的推广和使用。且常规的冻干工艺方案不能完全解决velcalcetide冻干粉针冻干破瓶分层和萎缩现象。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种velcalcetide冻干粉针剂及其制备方法。该velcalcetide冻干粉针剂显著改善了velcalcetide注射液的稳定性，且该velcalcetide冻干粉针剂不需要在2-8℃下保存，可以在室温下长期放置，更有利于velcalcetide的推广和使用。此外，本发明的冻干工艺能有效的解决在冻干过程中的破瓶现象，本发明的冻干工艺制备的velcalcetide冻干粉针剂无破瓶。本发明提供的冻干粉针剂外观没有出现分层和萎缩现象，提高成品收率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种冻干粉针剂，由药物有效成分与药学上可接受的辅料冷冻干燥制成；所述冷冻干燥包括预冻、抽真空、干燥的步骤；所述预冻包括：第一预冻，所述第一预冻的温度为-36℃～-29℃，所述第一步预冻的保温时间为1h～3h；第二预冻，所述第二预冻的温度为-55℃～-42℃，所述第二步预冻的保温时间为1h～2h；第三预冻，所述第三预冻为1h-2h内升温至-10℃～-7℃，保温1h～2h；第四预冻，所述第四预冻为1h-2h降温至-36℃～-29℃，保温1h～3h；第五预冻，所述第五预冻的温度为-55℃～-42℃，所述第五步预冻的保温时间为1h～3h。在本发明的一些具体实施方案中，所述抽真空所得的真空度为5Pa～30Pa。在本发明的一些具体实施方案中，所述干燥包括：第一步干燥，所述第一步干燥的温度为-35℃～-25℃，所述第一步干燥的时间为15h～30h；第二步干燥，所述第二步干燥的温度为-20℃～-10℃，所述第二步干燥的时间为10h～20h；第三步干燥，所述第三步干燥的温度为-5℃～5℃，所述第三步干燥的时间为5h～10h；第四步干燥，所述第四步干燥的温度为至25℃～40℃，所述第四步干燥的时间为5h～10h。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物有效成分为velcalcetide。在本发明的一些具体实施方案中，所述药学上可接受的辅料包括赋形剂、稳定剂、pH调节剂或注射用水中的一种或两者以上的混合物。作为优选，pH值调节剂调节的pH值为3.0～5.0。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干粉针剂通过取velcalcetide、赋形剂、稳定剂与处方量质量百分比52.9％～99.0％的注射用水混合，加入pH值调节剂调节pH值为3.0～5.0后，加入余量的注射用水，混合后得velcalcetide水溶液，经冷冻干燥，即得。作为优选，本发明提供的冻干粉针剂中，赋形剂为甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、或山梨醇中的一种或两者以上混合物,优选甘露醇，乳糖，蔗糖。更为优选地，本发明提供的冻干粉针剂中的赋形剂为甘露醇，乳糖。优选地，本发明提供的冻干粉针剂中稳定剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸、硫代硫酸钠、L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、L-亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、L-谷氨酸中的一种或者两者以上混合物。优选地，本发明提供的冻干粉针剂中，pH值调节剂为醋酸、醋酸钠、盐酸、硫酸、乳酸、苹果酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠或枸橼酸钠中的一种或两者以上混合物。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的冻干粉针剂中velcalcetide、赋形剂、稳定剂和注射用水的质量比为(0.1～2)：(10～107)：(0.03～0.2)：(892.25～989.3)。本发明还提供了一种冻干粉针剂的制备方法，取药物有效成分与药学上可接受的辅料经冷冻干燥，制得所述冻干粉针剂；所述冷冻干燥包括预冻、抽真空、干燥的步骤；所述预冻包括：第一步，所述第一步的温度为-36℃～-29℃，所述第一步的保温时间为1h～3h；第二步，所述第二步的温度为-55℃～-42℃，所述第二步的保温时间为1h～2h；第三步，所述第三步为1h-2h内升温至-10℃～-7℃，保温1h～2h；第四步，所述第四步为1h-2h降温至-36℃～-29℃，保温1h～3h；第五步，所述第五步的温度为-55℃～-42℃，所述第五步的保温时间为1h～3h。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干粉针剂的制备方法中所述抽真空所得的真空度为5Pa～30Pa。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干粉针剂的制备方法中所述干燥包括：第一步干燥，所述第一步干燥的温度为-35℃～-25℃，所述第一步干燥的时间为15h～30h；第二步干燥，所述第二步干燥的温度为-20℃～-10℃，所述第二步干燥的时间为10h～20h；第三步干燥，所述第三步干燥的温度为-5℃～5℃，所述第三步干燥的时间为5h～10h；第四步干燥，所述第四步干燥的温度为至25℃～40℃，所述第四步干燥的时间为5h～10h。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干粉针剂的制备方法中所述药物有效成分为velcalcetide。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干粉针剂的制备方法中所述药学上可接受的辅料包括赋形剂、稳定剂、pH调节剂或注射用水中的一种或两者以上的混合物。作为优选，pH值调节剂调节的pH值为3.0～5.0。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干粉针剂的制备方法为取velcalcetide、赋形剂、稳定剂与处方量质量百分比52.9％～99.0％的注射用水混合，加入pH值调节剂调节pH值为3.0～5.0后，加入余量的注射用水，混合后得velcalcetide水溶液，经冷冻干燥，即得。作为优选，本发明提供的冻干粉针剂的制备方法中，赋形剂为甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、或山梨醇中的一种或两者以上混合物,优选甘露醇，乳糖。更为优选地，本发明提供的冻干粉针剂的制备方法中的赋形剂为甘露醇，乳糖。优选地，本发明提供的冻干粉针剂的制备方法中稳定剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸、硫代硫酸钠、L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、L-亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、L-谷氨酸中的一种或者两者以上混合物。优选地，本发明提供的冻干粉针剂的制备方法中，pH值调节剂为醋酸、醋酸钠、盐酸、硫酸、乳酸、苹果酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠或枸橼酸钠中的一种或两者以上混合物。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的冻干粉针剂的制备方法中velcalcetide、赋形剂、稳定剂、pH调节剂或注射用水的质量比为(0.1～2)：(10～107)：(0.03～0.2)：(892.25～989.3)。本发明提供了一种velcalcetide冻干粉针剂及其制备方法。该velcalcetide冻干粉针剂由velcalcetide、赋形剂、稳定剂、pH值调节剂和注射用水冻干制成。本发明提供的制备方法在velcalcetide制剂预冻时使用多步法，将板层降温至-36℃～-29℃，保温1h～3h；再降温至-55℃～-42℃，保温1h～2h，再用1h～2h升温至-10℃～-7℃，保温1h～2h，再用1h～2h降温至-36℃～-29℃，保温1h～3h，再降温至-55℃～-42℃，保温1～3h。研究发现，冻干工艺的参数能影响冻干后破瓶收率和制品的外观。该velcalcetide冻干粉针剂显著改善了velcalcetide注射液的稳定性，且该velcalcetide冻干粉针剂不需要在2-8℃下保存，可以在室温下长期放置，更有利于velcalcetide的推广和使用。本发明提供的velcalcetide冻干粉针剂显著改善了velcalcetide的复容性，本发明提供的velcalcetide冻干粉针剂质量好、提高了velcalcetide的稳定性，使该药物制剂且该velcalcetide冻干粉针剂不需要在2-8℃下保存，可以在室温下长期放置。实验结果证实，该velcalcetide冻干粉针剂质量好、可以在室温下长期放置；在注射用水、0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液中能迅速溶 解，溶解后溶液无色澄清、无杂质沉淀、组织相容性良好，更有利于velcalcetide的推广和使用。此外，本发明的冻干工艺能有效的解决在冻干过程中的破瓶现象，冻干后无破瓶，而常规的解决方案是只能提高收率，不能完全解决冻干破瓶现象，依然有少量破瓶。本发明提供的冻干粉针剂外观没有出现分层和萎缩现象，提高成品收率。综合上述试验结果，处方加入稳定剂能提高改善其对温度的敏感性，不需要在2-8℃条件下保存，可以在25℃下保存。。冻干工艺提高成品收率，解决破瓶，分层，萎缩的现象，改善复溶，主要解决了普通的冻干工艺出现的问题。具体实施方式本发明公开了一种冻干粉针剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的冻干粉针剂及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、山梨醇、抗坏血酸，用100g的注射用水溶解velcalcetide、300g的注射用水溶解山梨醇、100g的注射用水溶解抗坏血酸， 将所得velcalcetide溶液、山梨醇溶液、抗坏血酸溶液混合均匀，用醋酸调节pH值至pH3.0之后，继续添加剩余的注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，将板层降温至-29℃，并保温3h；再降温至-50℃，保温1h，再用1h升温至-7℃，保温2h，再用1h降温至-29℃，并保温3h，再降温至-50℃，保温1h，再即完成了预冻。预冻结束后，抽真空(真空度：5pa)、启动升温，进行干燥，-35℃干燥30h，升温至-20℃，干燥10h；升温至-5℃，干燥10h；升温至25℃，干燥10h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例2velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇、L-甲硫氨酸，用100g的注射用水溶解velcalcetide、400g的注射用水溶解甘露醇、100g的注射用水溶解L-甲硫氨酸，将所得velcalcetide溶液、甘露醇溶液、L-甲硫氨酸溶液混合均匀，用盐酸调节pH值至pH4.0之后，继续添加剩余的注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，将板层降温至-31℃，保温2h；再降温至-55℃，保温1h，再用2h升温至-8℃，保温2h，再用2h降温至-31℃，保温1h，再降温至-55℃，保温1h。预冻结束后，抽真空(真空度：10pa)、启动升温，进行干燥，-30℃干燥20h，升温至-15℃，干燥15h；升温至0℃，干燥10h；升温至28℃，干燥10h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例3velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、乳糖、L-亮氨酸，用100g的注射用水溶解velcalcetide、500g的注射用水溶解乳糖、50g的注射用水溶解L-亮氨酸、将所得velcalcetide溶液、乳糖溶液、L-亮氨酸溶液、混合均匀，用盐酸调节pH值至pH3.5之后，继续添加剩余的注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，将板层降温至-32℃，保温1h；再降温至-48℃，保温2h，再用2h升温至-9℃，保温2h，再用2h降温至-32℃，保温1h，再降温至-48℃，保温2h。预冻结束后，抽真空(真空度：12pa)、启动升温，进行干燥，-25℃干燥20h，升温至-10℃，干燥15h；升温至5℃，干燥5h；升温至30℃，干燥8h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例4velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇、精氨酸，用100g的注射用水溶解velcalcetide、700g的注射用水溶解甘露醇、100g的注射用水溶解精氨酸，将所得velcalcetide溶液、甘露醇溶液、精氨酸溶液混合均匀，用醋酸调节pH值至pH3.0之后，继续添加剩余的注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，将板层降温至-33℃，保温1h；再降温至-45℃，保温1h，再用2h升温至-10℃，保温1h，再用1h降温至-33℃，保温1h，再降温至-45℃，保温3h。预冻结束后，抽真空(真空度：22pa)、启动升温，进行干燥，-27℃干燥15h，升温至-18℃，干燥15h；升温至0℃，干燥8h；升温至35℃，干燥6h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例5velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇、L-谷氨酸，用100g的注射用水溶解 velcalcetide、500g的注射用水溶解甘露醇、100g的注射用水溶解L-谷氨酸，将所得velcalcetide溶液、甘露醇溶液、L-谷氨酸溶液混合均匀，用醋酸调节pH值至pH3.3之后，继续添加剩余的注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，将板层降温至-34℃，保温1h；再降温至-48℃，保温2h，再用1h升温至-10℃，保温1h，再用2h降温至-34℃，保温1h，再降温至-48℃，保温3h。预冻结束后，抽真空(真空度：25pa)、启动升温，进行干燥-25℃干燥30h，升温至-20℃干燥18h；升温至0℃，干燥5h；升温至40℃，干燥5h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例6velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、乳糖、L-甘氨酸，用100g的注射用水溶解velcalcetide、400g的注射用水溶解乳糖、100g的注射用水溶解L-甘氨酸，将所得velcalcetide溶液、甘露醇溶液、L-甘氨酸溶液混合均匀，用醋酸、氢氧化钠调节pH值至pH3.5之后，继续添加剩余的注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中降温，预冻开始，将板层降温至-35℃，并保温1h；再将制品的温度至-43℃，保温1h；再用1h升温至-10℃，保温1h，再用2h降温至-35℃，保温1h，再降温至-43℃，保温3h。预冻结束后，抽真空(真空度：20pa)、启动升温，进行干燥-25℃干燥15h，升温至-20℃干燥17h；升温至0℃，干燥7h；升温至40℃，干燥6h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例7velcalcetide冻干粉针剂的制备处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇、L-甲硫氨酸，用100g的注射用水溶解velcalcetide、400g的注射用水溶解甘露醇、100g的注射用水溶解L-甲硫氨酸，将所得velcalcetide溶液、甘露醇溶液、L-甲硫氨酸溶液混合均匀，用磷酸二氢钠调节pH值至pH4.0之后，继续添加剩余注射用水，得1000gvelcalcetide水溶液，0.2μm过滤器过滤除菌，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，将板层降温至-36℃，并保温2h；再降温至-42℃，保温1h，再用1.5h升温至-9℃，保温2h，再用1.5h降温至-36℃，保温3h，再降温至-42℃，保温1h。预冻结束后，抽真空(真空度：30pa)、启动升温，先升温至-28℃，干燥20h；再升温至-18℃，干燥20h；再升温至3℃，干燥5h；再升温至38℃，干燥5h。压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例8velcalcetide制剂对照组的制备以对照组1至对照组3制备获得的velcalcetide制剂为对照。对照组1为velcalcetid注射液，对照组2和对照组3为采用常规的冷冻干燥工艺制备获得velcalcetide制剂，各个对照组的velcalcetide制剂的制备方法如下：对照组1：处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇，用注射用水分别溶解velcalcetide，甘露醇，并混匀。继续添加注射用水至总重，0.2μm过滤，以5.0mL/支分装于西林瓶中。对照组2：处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇，用注射用水分别溶解velcalcetide，甘露醇，并混匀，用磷酸氢二钠调pH值pH7.2。继续添加注射用水至总重，0.2μm过滤，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，经1h，将板层降温至-42℃，保温3h。预冻结束，开始抽真空，当真空达到24Pa时，开始升温，先升温至-35℃，干燥2h；再升温至-20℃，干燥2h；再升温至-5℃，干燥2h；再升温至10℃，干燥12小时，压塞，出箱，扎盖，即得。对照组3：处方：按处方量称取velcalcetide、甘露醇，用注射用水分别溶解velcalcetide，甘露醇，并混匀，用盐酸调pH值pH2.5。继续添加注射用水至总重，0.2μm过滤，以5.0mL/支分装于西林瓶中。将所得装有velcalcetide水溶液的西林瓶放入真空冷冻干燥机中，预冻开始，经1h，将板层降温至-45℃，保温3h。预冻结束，开始抽真空，当真空达到20Pa时，先升温至-28℃，干燥14h；再升温至-18℃，干燥8h；再升温至3℃，干燥4h；再升温至38℃，干燥5h，压塞，出箱，扎盖，即得velcalcetide冻干粉针剂。实施例9冻干后的破瓶率和成品收率冻干后的破瓶率和成品收率见表1。表1冻干后破瓶率和成品收率结果采用多步法预冻，完全解决了velcalcetide冻干制剂破瓶的问题。冻干后无破瓶，而常规的解决方案是不能完全解决冻干破瓶现象，依然有少量破瓶；且采用本发明的冻干工艺成品外观好，无萎缩和分层现象，明显提高成品收率。实施例10稳定性试验稳定性试验：分别取实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂、各个对照组提供的velcalcetide制剂，于温度25±2℃、相对湿度60±10％、光照强度：200±10LX的试验箱中，放置6个月，分别在第0、1、2、3、6个月的月末取样进行稳定性重点项目考察，结果见表2。表2稳定性试验检测结果从表2中试验结果可知，对照组1(velcalcetide注射液)随着时间的延长，杂质含量大幅增加，，澄清度不合格，复溶所得溶液变黄，不溶性微粒超标；对照组2和对照组3制备获得的velcalcetide冻干粉针剂在0月进行复溶时就出现复溶困难、分层、沉淀等现象，澄清度不合格；所以，对照组1、对照组2和对照组3制备获得的velcalcetide制剂质量差，不合格。本发明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂质量更稳定，放置6月后，复溶性良好，所得复溶后澄清度良好，而velcalcetide注射液溶液变黄、有不溶性微粒产生。实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂在放置6个月后，总杂质的质量百分含量不超过1.5％，最大单杂不超过0.5％，而对照组1.对照组2.对照组3制备的velcalcetide制剂的总杂质均超过了3％，单个杂质均超过了2％，差异显著(P＜0.05)，说明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂稳定性高于velcalcetide注射液，也优于常规方法制备的冻干制剂。综上所述，本发明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂的复溶性好、可以在室温下长期放置。实施例11velcalcetide冻干粉针剂动物安全性试验(1)血管刺激性试验受试对象：选取双耳无损伤的健康家兔(来源于第三军医大学实验动物中心)42只，随机分为7组，每组6只，标记为试验组1至试验组7。受试药物：实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂。试验方法：取实施例1至实施例7制备获得velcalcetide冻干粉针剂，每个西林瓶中分别加入1mL的5％的葡萄糖进行复溶，得velcalcetide注射液备用。所有受试对象的左侧耳缘静脉注射velcalcetide注射液1mL，右耳注射1mL的5％葡萄糖注射液，每天1次，连续注射7天，其中试验组1的受试对象注射实施例1制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试 验组2的受试对象注射实施例2制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组3的受试对象注射实施例3制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组4的受试对象注射实施例4制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组5的受试对象注射实施例5制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组6的受试对象注射实施例6制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组7的受试对象注射实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液。检测方法和试验结果：注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第8天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在距注射部位分别为110cm、215cm、315cm的近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。血管刺激性的观察指标、评分标准及判断标准见表3，各个组别受试对象的左耳血管刺激性检测结果表4，各个组别受试对象的右耳血管刺激性检测结果见表4。表3血管刺激性观察指标、评分标准及判断标准表4各个组别受试对象的血管刺激性检测结果从表4检测结果可知，所有组别的左耳和右耳的评价结果类似，肉眼观察，均未见血管充血，周围组织水肿等炎症反应；组织切片检查，也未见血管结构异常，内皮损伤，血栓形成及其他病理变化。即实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂配制成的注射液的刺激性与溶媒相比，差异不显著(P＞0.05)，均没有产生刺激性，说明本发明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂对血管无刺激性。(2)肌肉刺激性试验受试对象：取健康家兔(来源于第三军医大学实验动物中心)42只，随机分为7组，每组6只，标记为试验组1至试验组7。受试药物：实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂；试验方法：取实施例1至实施例7制备获得velcalcetide冻干粉针剂，每个西林瓶中分别加入1mL的生理盐水进行复溶，得velcalcetide注射液备用。所有受试对象的左侧股四头肌注射velcalcetide注射液1mL，右侧股四头肌注射1mL的生理盐水，其中试验组1的受试对象注射实施例1制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组2的受试对象注射实施例2制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验 组3的受试对象注射实施例3制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组4的受试对象注射实施例4制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组5的受试对象注射实施例5制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组6的受试对象注射实施例6制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组7的受试对象注射实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液。检测方法和试验结果：注射后，观察注射部位肌肉有无充血，水肿等反应，半数动物48h后(第3天)放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血，水肿等反应，并取其组织做病理检查。余下动物继续观察14天，于第18天放血处死后重复上述操作。velcalcetide注射液对肌肉刺激性反应评价标准见表5，第3天检测结果见表6，第18天的检测结果见表7。表5肌肉刺激性反应评价标准级别刺激反应现象0级给药部位无明显反应。1级给药部位轻度充血，直径小于0.15cm。2级给药部位中度充血，直径0.15～1.0cm。3级给药部位重度充血，红肿，肌肉有变性。4级出现肌肉褐色变性，坏死。5级肌肉严重变性，出现大面积坏死。表6第3天各个组别受试对象肌肉刺激性反应检测结果表7第18天各个组别受试对象肌肉刺激性反应检测结果从表6、表7中检测结果可知，家兔左侧股四头肌内注射本发明实施例1至7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的注射液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血，水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺 激反应，与生理盐水相比无显著性差异(P＞0.05)。说明本发明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂对肌肉没有刺激性，使用安全。(3)对豚鼠的致敏试验受试对象：选取健康豚鼠(来源于广东省实验动物中心)54只，随机分为9组，每组6只，分别标记为阴性对照组、阳性对照组、试验组1至试验组7。受试药物：试验组为实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂；阴性对照组为溶媒；阳性对照组给予牛血清白蛋白(已知致敏阳性物质)。试验方法和检测方法：取实施例1至实施例7制备获得velcalcetide冻干粉针剂，每个西林瓶中分别加入1mL的5％的葡萄糖注射液进行复溶，得velcalcetide注射液备用。各个组别受试对象在腹腔注射受试药物，隔日注射1次，共注射3次，然后随机分为2组，分别再在第1次给药后14天，静脉注射受试药物，观察豚鼠有无竖毛，喷嚏，干呕，咳嗽，呼吸困难等过敏症状，如出现两种或两种以上症状，或有抽搐，虚脱，死亡现象之一者，判为阳性。检测结果见表8。其中试验组1的受试对象注射实施例1制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组2的受试对象注射实施例2制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组3的受试对象注射实施例3制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组4的受试对象注射实施例4制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组5的受试对象注射实施例5制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组6的受试对象注射实施例6制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组7的受试对象注射实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、阴性对照组注射5％的葡萄糖注射液、阳性对照组注射牛血清白蛋白。表8致敏试验检测结果组别检测结果试验组1受试对象均为阴性试验组2受试对象均为阴性试验组3受试对象均为阴性试验组4受试对象均为阴性试验组5受试对象均为阴性试验组6受试对象均为阴性试验组7受试对象均为阴性阴性对照组受试对象均为阴性阳性对照组受试对象均为阳性结果表明，阳性试验组豚鼠均产生了过敏反应、而阴性对照组和试验组1至试验组7受试对象均活动正常，未见呼吸异常等反应，即未有过敏反应。说明本发明实施例1至实施例7制备获得velcalcetide冻干粉针剂对豚鼠没有致敏反应，使用安全。(4)体外溶血实验受试材料：取家兔血液，制备红细胞压积百分比为2％的红细胞混悬液：制备方法为：取新鲜兔血15mL，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。加入生理盐水100mL，摇匀，1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液(红细胞2mL，加生理盐水至100mL)，供试验用。受试药物：实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂，每个西林瓶中分别加入1mL的0.9％氯化钠注射液进行复溶，得velcalcetide注射液。试验方法：试验共分为7组，试验组1至试验组7，分别进行各个组别的velcalcetide注射液的溶血实验，其中试验组1使用实施例1制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组2使用实施例2制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组3使用实 施例3制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组4使用实施例4制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组5使用实施例5制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组6使用实施例6制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组7使用实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液。试验操作具体为：各个组别分别取试管7支，进行编号，然后按表9加入各种液体，将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中孵育，观察0.5、1、2、3小时的结果，记录各个时间点的检测结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表10，各个组别的检测结果见表11。表9注射液体外溶血试验加样表表10红细胞体外凝集与溶血的判断标准表11各个组别的检测结果注：“--”代表该待测样品在3h之内没有出现溶血现象从表11中的实验结果可知，所有组别蒸馏水对照管，即7号试管，在0.5小时完全溶血和发生了细胞凝集反应；而其他试管在3小时内均没有发生溶血现象、也没有发生细胞凝集反应。说明本发明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂没有产生溶血现象，使用安全。(5)急性全身毒性试验受试对象：取健康小鼠(来源于广东省实验动物中心)40只，将小鼠随机分为8组，每组5只，标记为对照组、试验组1至试验组7，分别放入固定器内。受试药物：实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂。试验方法：取实施例1实施例7制备获得velcalcetide冻干粉针剂，每个西林瓶中分别加入1mL的注射用水进行复溶，得velcalcetide注射液备用。试验组1至试验组7分别注射入本发明实施例1至实施例7制备的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液，对照组注入注射用水，注射速度均为0.1mL/s，注射剂量为50mL/kg。其中试验组1的受试对象注射实施例1制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组2的受试对象注射实施例2制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组3的受试对象注射实施例3制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组4的受试对象注射实施例4制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组5的受试对象注射实施例5制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组6的受试对象注射实施例6制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液、试验组7的受试对象注射实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液。检测方法和试验结果：注射完毕后，观察小鼠即时反应，并于4h、24h、48h和72h时，分别观察和记录试验组1至试验组7、对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数，最后统计各个组别的受试对象的中毒反应情况。判断动物是否发生中毒反应的观察指标见表12。各个组别的受试对象受试72h之后的检测结果见表13。表12注射受试药物后判断动物中毒反应的观察指标表13各个组别的受试对象的急性全身毒性试验检测结果从表13中数据可知，在72小时观察期内，与对照组相比、试验组1至实验组7的受试动物均没有发生中毒反应，无动物死亡，体质量无明显变化。说明实施例1实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂对小鼠没有产生中毒反应，使用安全。综上所述，注射本发明实施例1至实施例7制备获得的velcalcetide冻干粉针剂制成的velcalcetide注射液具有良好的组织相容性，表明本发明制备的velcalcetide冻干粉针剂质量稳定、组织相容性好、安全性好，可供临床注射使用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3