TENM1基因及其表达产物在诊治乳头状腺癌的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体的本发明涉及TENM1基因及其表达产物在诊治乳头状腺癌的应用。
背景技术：
：甲状腺癌是内分泌系统最常见恶性肿瘤，发病率在头颈部恶性肿瘤中居首位。甲状腺癌的发病机制以及发病率急剧增加的原因尚不明确。甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)的发病率约占所有甲状腺癌发病类型的80％。PTC约占成人甲状腺癌的60％和儿童甲状腺癌的全部，恶性程度较低。PTC多发于青年女性，多见于30-45岁之间。约80％肿瘤为多中心性，约1/3累及双侧甲状腺。较早便出现颈淋巴结转移，但预后较好。PTC早期无明显症状，表现为甲状腺区的无疼痛性肿块或在体检时偶然查出，肿块可数月至数十年，质地软硬不一，半数以上的肿块较韧，不足1/3的患者表现为质硬肿块；发生颈淋巴结转移时有颈淋巴结肿大，侵犯喉返神经出现声音嘶哑。侵犯气管内可引起呼吸困难或咳血。甲状腺微小癌临床检查不易查出，往往以颈淋巴结肿大为首发症状，也可以压迫喉返神经首先表现为声音嘶哑。目前甲状腺乳头状癌的诊断方法主要包括患者的病史和症状、实验室检查、影像学检查以及细针穿刺抽吸细胞学检查等，但仍存在一些不足。因此，探讨甲状腺乳头状癌发生的危险因素，从分子水平上研究甲状腺乳头状癌的发病机制，发现特异性的分子标志物，对于早期预防、早期发现，早期治疗甲状腺乳头状癌具有重要的意义。发明人对6例甲状腺乳头状癌病例样本及3例正常对照进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因TENM1。进一步，本发明进行了分子细胞生物学方法证实了TENM1与甲状腺乳头状癌的关系：与甲状腺乳头状癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供TENM1基因和/或蛋白抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用。为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因TENM1，进而通过分子细胞生物学方法验证了TENM1与甲状腺乳头状癌的关系：TENM1与甲状腺乳头状癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。进一步，所述抗甲状腺乳头状癌制剂是指可以抑制甲状腺乳头状癌细胞中TENM1基因的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活TENM1基因的抑制基因、激活抑制TENM1基因表达的蛋白、导入抑制TENM1基因表达的siRNA、激活促进TENM1mRNA降解的microRNA、导入促进TENM1蛋白降解的分子、抑制促进TENM1基因表达的因子及蛋白的表达。RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。进一步，所述抑制TENM1基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。优选siRNA序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。本发明的目的在于提供一种抗甲状腺乳头状癌制剂，所述抗甲状腺乳头状癌制剂抑制甲状腺乳头状癌细胞中TENM1基因的表达。进一步，所述的抗甲状腺乳头状癌制剂中含有抑制TENM1基因表达的siRNA。本发明的目的在于提供TENM1基因在制备甲状腺乳头状癌诊疗制剂中的应用。进一步，所述的甲状腺乳头状癌的诊疗制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测甲状腺乳头状癌组织中TENM1基因的表达。荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。所述的用于荧光定量PCR方法检测甲状腺乳头状癌中TENM1基因的产品含有一对特异性扩增TENM1基因的引物；所述的基因芯片包括与TENM1基因的核酸序列杂交的探针。进一步，所述的甲状腺乳头状癌的诊疗制剂包括用免疫方法检测肺腺癌中TENM1蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测甲状腺乳头状癌中TENM1蛋白表达的为westernblot和/或ELISA和/胶体金检测方法。酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。进一步，所述检测TENM1蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的TENM1单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被TENM1单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。进一步，所述检测TENM1蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的TENM1单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗TENM1单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。优选的抗TENM1单克隆抗体选自下列抗体：NovusBiologicals公司提供的货号为H00010178-M01的Teneurin-1Antibody，Abcam公司提供的货号为ab56597的Anti-ODZ1antibody。本发明的目的在于提供一种检测甲状腺乳头状癌的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因TENM1，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQIDNO.11，下游引物序列为SEQIDNO.12。所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取。本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-102copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。本发明目的是提供了一种甲状腺乳头状癌蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测TENM1蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。本发明目的是提供了一种检测甲状腺乳头状癌的基因芯片，所述的基因芯片包括与TENM1基因的核酸序列杂交的探针。附图说明图1TENM1基因在癌组织及正常组织中相对表达量图图2RNA干扰后各组TENM1mRNA表达水平具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1病例的收集取2011年1月到2012年6月期间在北京友谊医院因甲状腺肿瘤住院手术，经术中冰冻快速病理以及术后石蜡慢病理确认为甲状腺乳头状癌的患者，选择经甲功八项和甲状腺彩超检查正常的健康人群作为对照组，选取6例甲状腺乳头状癌病例样本及3例正常对照组织。实施例2高通量测序及分析对组织进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOnlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因TENM1。实施例3甲状腺乳头状癌组织及正常组织TENM1基因表达情况一、材料和方法1、材料选取78例甲状腺乳头状癌组织及16例正常组织，对其进行分组及编号。2、方法2.1甲状腺乳头状癌组织及正常组织总RNA的提取采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入Trizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按Iml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。2.2逆转录合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：5×逆转录缓冲液5μl，10mmol/ldNTP1.25μl，0.1mmol/lDTT2.5μl，30μmmol/lOligodT2μl,200U/μlMMLV1.25μl，模板RNA1μg，加入灭菌水至总体系25μl。42℃孵育1小时，72℃10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20℃冰箱备用。2.3Real-TimePCR2.3.1仪器及分析方法用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。2.3.2引物设计采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:XM_011531237.1，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：表1引物序列操作过程如下：(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，60℃45sec)×40个循环。表2RealTime反应体系组分加入量2×mix10μl上游引物(10uM)0.5μl下游引物(10uM)0.5μl模板2μl加入灭菌蒸馏水至25μl(二)引物筛选将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。(三)样品RealTimePCR检测将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。二、实验结果实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较TENM1基因在甲状腺乳头状癌组织和正常组织中的表达水平。结果显示(具体见图1)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中TENM1在癌组织中的表达水平高于正常组织近4倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析TENM1在甲状腺乳头状癌组织中高表达的结果。实施例4RNAi抑制TENM1基因表达及其对人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞的影响一、材料(一)标本来源人甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP购自上海慧颖生物细胞库。(二)主要试剂LipofectamineTM2000TransfectionReagent(Invitrogen)，MTT(Solarbio)，Transwell小室(Corning)，Matrigel胶(BD)。(三)siRNA构建与合成依据在线设计软件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根据TENM1基因在GenBank(NCBIReferenceSequence:XM_011531237.1)中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成。二、实验方法(一)RNA干扰技术特异性抑制人甲状腺乳头状癌细胞TENM1基因的表达1、人甲状腺乳头状癌细胞BCPAP的培养具体参照上海慧颖生物细胞库提供的方法。2、siRNA的设计与合成siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记，可以实时监测载体在细胞中的转染效率。根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列及阴性对照(表3)。对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA(shorthairpinRNA)。合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNAPoIyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点，可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间。siRNA空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3:1。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LBAmp培养基上涂板，37℃培养过夜。PCR鉴定；测序鉴定。柱抽提阳性克隆载体并定量。表3siRNA转录模板序列3、细胞分组及转染(1)细胞分组C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。(2)转染按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步骤进行。①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1×105/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。②配制转染液体：A液：250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；B液：250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO2培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。4、转染效率的验证(1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧光下观察转染情况。(2)应用Real-timePCR方法检测转染前后TENM1基因表达的变化①标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的甲状腺乳头状癌BCPAP细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入TENM1引物和内参照actin引物，配制25u1反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到TENM1和actin的标准曲线。②Real-timePCR方法检测转染前后TENM1基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行TENM1和actin的Real-timePCR反应，实验重复三次。③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。三、实验结果结果显示本发明构建的三个干扰载体都对甲状腺乳头状癌BCPAP细胞中TENM1基因表达起到一定抑制作用，其中TENM1-siRNA2抑制效果最明显，抑制率达50％，具体见图2。实施例5一种甲状腺乳头状癌基因检测试剂盒RNA提取试剂：超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)荧光定量试剂：UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)荧光定量PCR反应体系及方法：RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-FreeWater补平至25μl。反应调节：反转录：45℃10min；95℃5min预变性，接30-40个循环：95℃15s，60℃45s。本发明采用高通量测序筛选出甲状腺乳头状癌致病相关基因TENM1，结合分子细胞生物学实验验证，证实了TENM1是甲状腺乳头状癌密切的标志物。本发明为甲状腺乳头状癌临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。当前第1页1 2 3