用于连续病毒灭活的装置和方法与流程

生物制药生产方法需要各种正交步骤用于病毒减少。灭活(有包膜)病毒的常用方法是与酸性介质接触。

以成批模式在低pH值的病毒灭活是已知的，并且常用于活性物质(例如抗体)的生物制药生产(Sofer 2003, Virus Inactivation in the 1990s - and into the 21st Century. Part 4. BioPharm International)。此处，将待灭活的材料，即潜在含有活性病毒的液体，引入合适的容器，借助酸性溶液使之达到≤4的pH值，均质化(如果必要)，并且允许静置所需时间。通过使病毒与酸性溶液接触取决于具体产品和方法的时间而实现病毒的灭活。袋的整个内容物因此经历以几乎相同的停留时间的灭活，并且容器的每个流体元(Fluidelement)中实现的病毒减少因此也是几乎相同的。

如果以连续模式操作生物制药和生物产品、特别是药物抗体的生产方法，必须实现病毒灭活所需的保持时间。为了本专利申请的目的，连续病毒灭活意味着进料流引入病毒灭活模块和从病毒灭活模块排出产物流不停地发生。为了本专利申请的目的，包括至少一个生物反应器的生产设备的连续操作意味着，进料流引入生物反应器和从生产设备排出产物流不停地发生，其中一些方法步骤能够半连续操作。

可以在停留环中实现病毒灭活所需的保持时间(=停留时间)。此处，停留环中的层流可以是有问题的。在通过管的层流中，建立抛物线速度剖面，这导致宽停留时间分布(图1)。由于通过管的流的中心的最大速度是平均速度的两倍，但在管壁的速度为零(粘附条件)，所以在这些情况下发生非常宽的停留时间分布。以该方式获得的停留时间范围为平均停留时间的一半(由于管中间的快速流动的流体元)到无限长停留时间(由于在壁附近的粘附流体元)。由于，首先，最小停留时间对于病毒的有效灭活是必要的，但是，其次，在低pH值的长停留时间可能损伤产品(例如蛋白)，所以在连续操作中实现窄停留时间分布是不可缺少的。在该情况下，从层流情形到具有均匀停留时间的湍流栓塞流的改变不是可接受的替代方案。湍流需要高流速。如果然后实现通常用于在低pH值的病毒灭活的长停留时间(例如60-120分钟)，导致不期望的大设备。

实施连续病毒灭活的一种方式是用UV-C光照射：WO2002038191、EP1339643B1、EP1464342B1、EP1914202A1和EP1916224A1描述了使用螺旋停留环，其中用UV-C光照射待灭活的材料，并且因此灭活存在的病毒。当流体流过螺旋卷曲管时，离心力作用于流体。离心力诱导二次流(称为迪恩涡流(Dean-Wirbel))，其导致待灭活的材料的改进的径向混合和因此更均匀的照射。所提及源中使用的螺旋结构是螺旋的轴向不变化的直螺旋卷曲。为了用于在低pH值的连续病毒灭活中使用，使用如UV-C照射中使用的直螺旋结构是不可行的，因为停留时间分布尽管比层流通过其发生的直管的情况下更窄，但仍太宽。由于仍然比较宽的停留时间分布，该几何学仍然需要大设备用于pH-病毒灭活。

由于首先对于各流体元必须实现所需的最小停留时间且其次可能在低pH值损伤产品、特别是蛋白产品，所以对于基于pH的病毒灭活必需实现非常窄的停留时间分布。

Nigam等人 [US7337835B2, AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368, Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289]教导了在通过螺旋卷曲的流的情况下，螺旋卷曲的轴的弯曲带来了离心力的法线对流体的作用方向的变化。根据Nigam等人，可以在的迪恩数（Dean-Zahl）的值起获得最窄的停留时间分布，相反在，观察到停留时间分布的变宽。该技术被作者称为“卷曲的流逆变器”(CFI)。CFI的原理显示于图2中。由螺旋管几何学引起的离心力生成二次流，作为其结果，可以在热交换器中实现窄停留时间分布，甚至在层流的情况下。Nigam等人教导了90°弯头的实施产生比直螺旋或层流通过其发生的直管中相当更窄的停留时间分布。Nigam等人还教导了停留时间分布越窄，使用越多弯头。用越来越多数目的弯头，获得了湍流通过其发生且具有栓塞流概况的流管的停留时间分布的近似值。

没有检查或提及该管几何学对于同时需要长停留时间和窄停留时间分布的方法(例如，在低pH值的病毒灭活)的适用性。长停留时间与提供热交换器是无关的。

因此，本发明的一个目标是提供新颖、简单且廉价的技术方案，其使得在连续流通过其发生的停留环中实现所需停留时间，用于以窄停留时间分布在低pH值连续病毒灭活。

本发明通过提供用于连续灭活产物流中的病毒的装置而实现了该目标，其包括具有分别连接至用于输送所述产物流的产物流线8的入口4和出口5的管或软管1，

- 其中所述管或软管1是弯曲的和/或螺旋卷曲的，其在卷曲轴h周围具有数目n的绕管，并且在卷曲轴中具有一个或多个方向改变和/或弯头2，其具有45°至180°的角度α以改变离心力的法线的作用方向，

- 其中所述装置的特征在于≥ 0的迪恩数和≥ 0的扭转参数（Torsion Parameter）。

除了≥0的迪恩数以外，所述装置还可以具有≥1、优选≥2、优选≥3、更优选≥4的迪恩数。

除了≥0的扭转参数以外，所述装置还可以具有≥100、≥200、≥300、≥400、特别优选≥500的扭转参数。

在一个特别优选的实施方案中，所述装置具有≥3的迪恩数和≥500的扭转参数。

所述管或软管1优选在卷曲轴h周围螺旋卷曲。卷曲轴的横截面通常是圆的。

弯曲构型的一个实例从EP094443181B1、特别是图5至11(其在此与其描述一起通过引用并入)中是已知的。

本发明的装置可以包括保持支架6，其带有一个或多个框架3。作为替代方案，所述保持支架形成卷曲轴。所述框架和/或保持支架可以是中空或填充的。如果所述软管或管1具有高强度和刚度，则自支持结构也是可能的。

关于设备的尺寸，Nigam等人的教导通过引用并入：US7337835B2, AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368, Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289。具体而言，Nigam等人教导了增加径向的混合(其导致停留时间分布的变窄)发生，甚至在45°至180°、但优选40°至120°的范围、具体地90°的角度α。图2显示根据Nigam等人的CFI的原理及其用于α = 90°的特定情况的设计参数。可以看到流量剖面如何根据螺旋卷曲的方向而变化。

作为设计参数，可以提及：

· 软管内直径

· 间隔距离

· 卷曲管直径

· 卷曲直径

· 每个臂的绕管数n(臂是两个连续弯头之间的直螺旋卷曲的区域)

· 弯头的角度α

· 弯头数(在框架中显示每个框架4个弯头)

描述该系统的无量纲参数是雷诺数、迪恩数和扭转参数。

根据以下计算雷诺数：

使用流体的密度，平均流速和动态粘度。

根据以下计算迪恩数：

根据以下计算扭转参数：

Nigam等人教导了，当尽可能减小间隔距离、角度α = 90°、迪恩数为至少3且扭转参数为≥500时，可以实现最好的结果。为了能够在螺旋中形成稳定的二次流，每个臂还应当具有至少两个完整的绕管。[AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368]和[Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289]。

本发明的装置的维度化通常如下实施：

- 在第一个步骤中，确定期望的体积流速。

- 在该基础上，在迪恩数优选为≥3且扭转参数优选为≥500的条件下使用上述公式计算可能的尺寸。

- 对于3 ml/min的体积流速，产生的曲线通过实例的方式显示于图4中。根据Nigam等人，可以发现所述装置的合适的尺寸在扭转参数=500的有利曲线的左侧和迪恩数= 3的有利曲线的左侧。选择最适当的软管内直径和卷曲管直径，以便在具体空间需求的方面进行优化。此处，选择软管内直径，使得实现所需的最小停留时间。然后应当使卷曲管直径尽可能小。其原因在于，根据Nigam等人，停留时间分布变得越窄，停留部分中安装越多弯头。对于停留部分的确定软管长度和每个螺旋的绕管的固定数目，可能安装的弯头越多，卷曲管直径越小。作为近似值，可以计算具有长度的停留部分的弯头的数目，其中是每个框架的臂数，是每个臂的绕管数，是数pi且是卷曲直径，其中，此处，是该软管的外直径。

根据本发明，通过实例的方式针对测试设备如下选择上述参数，用于以约3 ml/min的体积流速连续病毒灭活。在对于具体应用情况所需的最小停留时间和所选的软管内直径的帮助下获得所需的软管长度。在下一步骤中，选择卷曲管直径，使得满足迪恩数≥0且扭转参数≥0、优选迪恩数≥2、优选≥3和扭转参数≥300、优选≥500的条件。在这方面，参见图4。

所述管或软管1的内直径d_i通常为1至30 mm，优选3至6 mm的范围内。例如，在测试设备中使用具有3 mm的内直径的商业管/商业软管。随后选择用于该情况的最小可能卷曲管直径。选择的卷曲管直径越小，对于给定的软管长度可以实现越多弯头。由于越来越多数目的弯头使停留时间分布变窄，所以应当总是使该数目尽可能大。

所述管/软管1的总长度L和内直径如此匹配于总设备的尺寸/设备的流速，使得保持在具体应用情况下所需的停留时间。

在具有上述大小的设备的情况下，所述管或软管1通常具有1至200 m、优选50至100 m的总长度L。

两个方向变化和/或弯头2之间的绕管数n通常为至少2至20、优选5至15、特别优选10，其中选择绕管数，使得单元占据尽可能小的体积。

如果保持支架形成卷曲轴或软管或管1是自支持的，则卷曲轴通常具有2至n个方向变化和/或弯头2，其中n可以是任何期望的数目。选择数目n，使得所述管/软管1的总长度L被缠绕在单元周围，且占据尽可能小的体积。

如果框架被用作卷曲轴，则每个框架3通常具有2至6个方向变化和/或弯头2。优选如图2中所示的正方形框架(90°弯头)，但不限于此。一个或多个框架通常在支架6上被固定在彼此之上，直到所述管/软管1的总长度L被缠绕在单元周围，且占据尽可能小的体积。

以该方式实现的窄停留时间分布使得在取决于具体产物和方法的最小停留时间而没有达到导致产物损伤的同样取决于产物和方法的最大停留时间(通常为对于pH敏感的产物的30分钟至对于不太敏感的产物的120分钟)的情况下实现所需的病毒去除。所需停留时间和最大停留时间是取决于产物的，并且通常通过实验确定。优化最大停留时间，使得产物遭受最小损伤，以便使得下游纯化步骤的需要尽可能低。停留时间分布接近理想流管反应器中的平均停留时间。以该方式，可能确保在低pH值下的有效连续操作的病毒灭活，其在病毒去除和产品质量方面的结果将与批次方法中的病毒灭活是相当的。

尤其当利用支架上的框架时，所述装置的简单、可变型和廉价的制造(也用于单次使用)是可能的。在软管/管已经灭菌之后或之前，软管/管仅在框架周围以所需方式缠绕。在方法中使用单元之后，软管/管可以从框架拆卸且处置或清洁(如果需要多次使用)。弯头的角度应当具有确定值。应当同样确定软管/管的位置，例如通过在框架中铣削的导向缺口的简单和可重复的卷曲。对于设备中的操作，以该方式确保所述设备在每次生产运行中具有相同的有效性。

此外，所述装置可以是可灭菌的，优选可高压灭菌的或可γ-照射的。为了达到该特性，优选使用符合相关的质量要求、例如医疗质量(USP VI级)的软管。可以优选高压灭菌或γ-灭菌本发明的装置，其使得可以无菌操作。

此外，本发明提供了用于连续病毒灭活产物流的方法，其包括以下步骤：

a) 提供待灭活的产物流，

b) 将所述产物流引入具有入口4和出口5的管或软管1的入口 4，其中所述管或软管1是弯曲的和/或螺旋卷曲的，其在卷曲轴h周围具有数目n的绕管，并且在卷曲轴中具有一个或多个方向改变和/或弯头2，其具有45°至180°的角度α以改变离心力的法线的作用方向，其中所述装置的特征在于≥0的迪恩数和≥0的扭转参数，

c) 在病毒灭活条件下使所述产物流流过所述管或软管1，和

d) 通过出口5流出所述管或软管1。

在步骤a)中产生可以含有产物和待灭活的潜在病毒两者的液体的产物流。

除了≥0的迪恩数以外，本发明的方法的步骤b)中的装置还可以具有≥1、优选≥2、优选≥3、更优选≥4的迪恩数。

除了≥0的扭转参数以外，本发明的方法的步骤b)中的装置还可以具有≥100、≥200、≥300、≥400、特别优选≥500的扭转参数。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法的步骤b)中的装置具有≥3的迪恩数和≥500的扭转参数。

作为用于步骤c)的可能的病毒灭活条件，可以提及pH值≤4、UV处理或热处理。

在步骤a)中，如果待灭活的材料的pH值尚不具有所需值，则优选将产物流的pH值设定为≤4的值。在该情况下，通常在步骤d)之后借助碱将pH值设定为≥5以终止病毒灭活。

将待灭活的溶液的pH值设定为≤4例如可以通过添加HCl溶液来实现。所述添加通常在本发明的装置的上游实施。

借助传感器pH0501测量在进入用于病毒灭活的装置之前的产物流的pH值(图8)。该pH-传感器通常不具有调节任务。pH-信号的记录仅仅用于监测过程。

如果生产过程需要一次或多次调节pH值，则将用于病毒灭活的装置连接至用于设定pH值的单元。通常使用两个用于设定pH值的单元，一个在灭活之前，以使产物流变为pH值≤4(步骤b)，另一个在灭活之后，以中和产物流(步骤d)。

在步骤c)中，实现酸性溶液和可能存在的病毒之间的期望接触时间(=停留时间)。

作为步骤d)中的碱，可以使用例如氢氧化钠溶液(NaOH)。

所述方法可以作为批次操作和作为连续生产方法实施，并且因此整合成批次方法和连续方法。

如果用于病毒灭活的装置被整合成连续生产方法，优选一个或多个用于设定pH值的单元，其中产物流流过再循环环。图8通过实例的方式显示病毒灭活和随后中和，但不限于此。M0503将产物流输送入袋B0502，其中在离开病毒灭活之后的pH值被设定为≥5的值。通过再循环泵M0504将袋B0502的内容物通过再循环环输送入pH-传感器pH0502，其测量产物流的pH值。在传感器的下游，供入用于匹配pH值的调节剂。用于调节剂的泵是M0505，并且经由相关的传感器pH0502进行调节。

在本发明的方法中，待灭活的产物流通常是来自生物反应器的溶液，特别是蛋白溶液或肽溶液，非常特别优选抗体溶液。

根据本发明的连续病毒灭活相对于现有技术中常用的批次模式的病毒灭活的技术优点是能够整合成连续处理方法(也被称为“下游处理”)，而不必改变所述方法的操作模式。此处，不从批次方法操作改变为连续方法操作且再次变回，而是可以连续操作整个“下游处理”或整个生产方法(上游和下游)。

本专利申请进一步提供了生产设备，其包括一个或多个根据本发明的用于连续灭活产物流中的病毒的装置，和优选至少一个用于设定pH值的单元。

本发明，包括优选的实施方案，结合以下附图和实施例进行说明，但不限于此。所述实施方案可以以任何期望的方式进行组合，除非上下文另有明确指明。

使用的附图标记是：

1 = 弯曲的和/或螺旋卷曲的管或软管

2 = 在卷曲轴h中的方向改变和/或弯头2，其具有45°至180°的角度α

3 = 框架

4 = 入口

5 = 出口

6 = 保持支架

7 = 底座

8 = 产物流线。

图1显示层流通过其发生的管的抛物线流量剖面(上图：该管的纵切面)。层流通过其发生的管中的流动方向的相同速度的线(下图：该管的横截面)。

a = 管壁

b = 该管在流动方向上的轴向轴

c = 径向轴

d = 在流动方向上的相同流速的线。

图2显示描绘流量剖面的CFI的原理和设计参数。

显示流动方向的相同流速的线。流量剖面取自：Ind. Eng. Chem. Res. (2008), 47, 10, pp. 3630-3638

· 软管内直径

· 软管外直径

· 间隔距离

· 卷曲管直径

· 卷曲直径

· 弯头的角度α

e = 离心力的作用方向

f = 通过螺旋卷曲的流动方向

g = 螺旋卷曲中的流体的流动方向

h = 卷曲轴/螺旋轴。

图3显示与层流通过其发生的直管和理想的流管相比具有各种数目的3 ml/min的体积流速的弯头的用于连续灭活病毒的装置的停留时间行为的研究结果。(弯头 = 90°-弯曲以改变离心力对流动的作用方向的法线。1的无量纲浓度对应于0.25 g/l的维生素B12的浓度)。

图4显示在3 ml/min的体积流速下用于说明CFI的图。

图5显示如用于停留时间测量(4个框架)的实验中使用的装置的照片。

图6显示实施例1中在入口处引入用于病毒灭活的装置的示踪剂溶液的阶梯函数。

i = 时间轴

j = UV信号的轴

k = 在CFI的入口处引进示踪剂物质的时间点。

图7显示用于根据CFI的实例连续病毒灭活的装置的图。左边：安装框架的保持支架。右边：没有安装框架的保持框架。

图8 病毒灭活、随后调节pH值的流程图，其中纯粹图示显示螺旋卷曲管1及其方向改变和/或弯头2。

图9 来自实验研究的框架的构建图。

实施例1：

如图4中所示实施框架的设计。该图针对3 ml/min的流速构建，并且显示这样的范围，其中可以改变构造参数软管内直径和卷曲管直径，以符合框架的构建中的≥3的迪恩数和≥500的扭转参数的所需条件。

选择3 mm的软管内直径用于实验研究。卷曲管直径然后被选择为63 mm，使得尽可能缩短每个框架上卷绕的软管长度。

实验研究中使用的结构的尺寸，其结果显示于图3，为：

框架直径(卷曲管直径) 63 mm；框架的外缘长度195 mm。软管内直径3 mm；软管外直径5 mm。如图9中所示构建框架。

每个臂总是具有11个绕管，其具有最小间隔距离，使得框架上卷绕9.5 m软管。最小间隔距离意味着该软管在螺旋中接触。对于“3个弯头”的情况，使用一个框架。因此，对于本实验，卷绕9.5 m软管。对于“15个弯头”的情况，使用四个框架。将总共38 m软管卷绕在四个框架上。对于“27个弯头”的情况，使用七个框架。将总共66.5 m软管卷绕在七个框架上。在假设每个臂的绕管数恒定的情况下，每个框架使用的软管长度与卷曲管直径成正比。在所使用的软管的情况下，软管外直径为5 mm。

图5显示如用于停留时间测量的实验中设置的框架和软管卷曲的排列。然而，为了清楚的原因，对于该图使用较大软管直径(软管内直径6 mm)。因此，在实验中使用每个臂11个绕管是不可能的。

在实验结构中，首先在每个框架上分开卷绕如图2和图5中所示的各实验中使用的软管。随后将具有软管的框架在保持支架上排列在彼此之上。此处，将上框架的出口连接至下方框架的入口，使得软管卷曲将从顶部向下穿过框架。作为替代方案，也可以从底部向上或水平流动。

在系统的出口处的UV测量的帮助下实施用于在用于连续病毒灭活(CFI)的装置中测量停留时间的实验。流速总是为3 ml/min，所使用的聚硅氧烷软管的内直径为3 mm，软管的外直径为5 mm。其周围卷曲软管的框架的外直径为63 mm(卷曲管直径)。具有0.25 g/l的浓度的维生素B12溶液用作示踪剂物质，因为维生素B12在280 nm的波长吸收UV光，因此适合作为指标剂。

首先，用蒸馏水冲洗CFI。在时间点k，在病毒灭活的入口处转接示踪剂溶液，并且开始记录UV传感器的测量信号(参见图6)。然后将示踪剂溶液的阶梯函数应用于该系统。当该系统的出口处的UV信号对应于示踪剂溶液的UV信号时，可以停止实验，因为该系统从该时间点被示踪剂溶液完全填充，并且因此已经完全记录该系统对阶梯函数的响应。

为了相互比较所记录的各种停留时间曲线，将其标准化为无量纲数值。针对平均停留时间标准化时间；

其中是停留时间段的滞留体积，且是体积流速。

通过针对记录的最大UV信号 (在0.25 mg/l的维生素B12浓度) 标准化测量的UV信号而获得无量纲的浓度。0.25 mg/l的维生素B12浓度因此得到1的无量纲浓度。蒸馏水的UV信号导致0的无量纲浓度。

测量的结果显示于图3。根据以下方程分析确定层流通过其发生的直管的停留时间分布。是无量纲浓度，并且是无量纲时间。

层流通过其发生的直管，由于其抛物线流量剖面，具有比较宽的停留时间分布。流体元在管的中心比靠近壁的区域显著流动更快(参见图1)。

如果，在另一方面，软管是螺旋卷曲的，则离心力带来系统在径向的混合。作为其结果，相对接近螺旋轴的缓慢流动的流体元向外移动，且驱使位于那里的流体元向内。作为实施弯头的结果，重新建立由离心力引起的二次流，其导致改进的径向混合。图2显示流动剖面在每个90°弯头之后如何转过90°。如从图3可见，可以通过使用弯头实现停留时间分布的显著变窄。

当使用具有27个弯头的CFI时，发生实验中实现的最好结果(未研究更大数目的弯头)。获得理想流管中的停留时间分布的近似值。额外弯头会使停留时间分布进一步变窄是可能的。所述技术因此适合作为用于连续病毒灭活的方法。

按照欧洲区域发展基金(European Fund for Regional Development, EFRE)的框架内的金融援助协议“Bio.NRW:MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich”资助了本专利申请的工作。