溶瘤病毒和免疫检查点调节因子组合的制作方法

本发明涉及溶瘤病毒疗法，更具体地涉及治疗、预防或抑制增生类疾病特别是癌症的组合物和方法。实施方案包含溶瘤病毒，其用于组合一或多种免疫检查点调节因子用于治疗癌症。实施方案还包含一种试剂盒，该试剂盒包含这样的组分以及利用所述溶瘤病毒和所述一或多种免疫检查点调节因子进行治疗的方法。

背景技术：

每年全球有1200百万的受试者被诊断患有癌症。在工业化的国家，大约五个人中有一个死于癌症。虽然存在大量的化学疗法，但通它们常并不有效，特别是针对疾病非常初期建立的恶性和转移性的肿瘤。此外，由于肿瘤细胞进化出逃避宿主防御的机制，抗肿瘤免疫通常没有效果。免疫抑制的主要机制中的一种是被称为“t细胞耗竭”的过程，其由抗原持续暴露造成并且以抑制性受体上调为特点。这些抑制性受体充当免疫检查点以防止不受控制的免疫反应。文献中已经描述各种免疫检查点在t细胞免疫的不同层面上起作用，包括程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)及其配体pd-l1和pd-l2、ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)、lag3(淋巴细胞激活基因3)、b和t淋巴细胞弱化因子、t细胞免疫球蛋白、粘蛋白3(tim-3)和t细胞活化的免疫球蛋白抑制v型结构域。

无论作用机理是什么，这些免疫检查点能够抑制有效抗肿瘤免疫反应的发展。对于阻断此类免疫检查点作为抑制免疫系统对肿瘤的耐受并因此挽救耗竭的抗肿瘤t细胞的手段所带来的可能的治疗益处越来越感兴趣(leachetal.,1996,science271:1734-6)。在过去的十年间，已经开发了大量的拮抗抗体(例如抗tim3、抗-pd-l1、抗-ctla-4、抗-pd1等等)，而更重要的是，其中的一些已经与在癌症患者中的客观临床反应关联。针对ctla-4的抗体已经投放市场(例如：易普利姆玛，yervoy，百时美施贵宝，bms)用于转移性黑色素瘤。bms的报告显示在1800个使用易普利姆玛治疗的黑色素瘤患者中，22％在三年后还活着。抗pd-l1(例如：mpdl3280a，roche)和抗pd-1(例如nivolumab，bms)的抗体疗法还在进行中。

另一种在癌症领域兴起的治疗方式为溶瘤病毒(hermiston,2006,curr.opin.mol.ther.8:322-30)。溶瘤病毒能够选择性地在分裂中的细胞(例如癌症细胞)中复制而不伤害非分裂中的细胞(例如正常细胞)。当受感染的分裂中的细胞被溶解破坏，它们会释放新的感染性病毒颗粒去感染周围的分裂中的细胞。癌症细胞是很多病毒的理想宿主，因为它们的抗病毒干扰素路径被关闭或肿瘤抑制基因发生突变致使病毒复制可以不受限制的进行(chernajovskyetal.,2006,britishmed.j.332:170-2)。许多病毒包括腺病毒(adenovirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、麻疹病毒(measles)、单纯疱疹病毒(herpessimplex)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)以及痘苗病毒(vaccinia)已经作为溶瘤剂进行了临床试验。

一些病毒天然溶瘤(例如呼肠孤病毒和塞内加谷小核糖核苷酸病毒(senecavalleypicornavirus))，另一些通过修饰病毒基因组而针对肿瘤选择性进行改造。这种修饰包括关键病毒基因中的功能性缺失，利用肿瘤或组织特异性启动子控制病毒基因的表达以及趋向性修饰以将病毒重定向至癌细胞表面。

第一种被管理机构批准的溶瘤病毒是遗传修饰的腺病毒，被命名为h101(上海三维生物技术)，其在2005年获得中国国家食品药品监督管理局的批准用于治疗头颈癌。另一种叫onyx-015的溶瘤腺病毒在进行治疗各种实体瘤的临床试验阶段(在治疗复发性头颈癌的三期临床试验中)(cohenetal.,2001,curr.opin.investig.drugs2:1770-5)。另一个示例是，溶瘤单纯疱疹1(t-vec)通过遗传工程改造减弱病毒毒力，并增加对癌症细胞的选择性以及增强抗肿瘤免疫反应(通过gm-csf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的表达)。在二期和三期临床试验中已经证明针对手术不能切除的黑色素瘤的临床疗效(senzeretal,2009,j.clin.oncol.27:5763-71)。

痘苗病毒(vv)具有许多溶瘤病毒疗法所必须的关键性质，例如对肿瘤的天然趋向性、溶解能力强、生命周期短且细胞-细胞间传播迅速、基因表达效率高以及克隆容量大。此外，它们在消灭天花的运动中还曾被递送给数百万个体而没有重大安全隐患。在这方面，tk(胸苷激酶)和vgf(痘苗病毒生长因子)双缺失且表达gm-csf的vv(被命名为jx-963)在荷瘤小鼠中表现出显著的癌症选择性(thorneetal.,2007,jclininvest.117:3350-8)。同样地，jx-594，具有gm-csf且胸苷激酶缺失的vv(wyeth株)，展现出有前景的临床数据，并且其在肝细胞癌中的随机三期临床实验预期即将开展。

文献中也已经记载了组合疗法。wo2010/014784描述了抗ctla4抗体和化疗药物例如格列卫、紫杉酚等组合使用以治疗癌症。wo2014/047350设想了在病毒基因组中插入了编码抗pd-1抗体的基因的重组溶瘤病毒。

技术问题

由于大量的致病因子可能相互作用或单独引发或促使癌症的发生，人们认为癌症会在很多年内继续是严重的全球健康威胁。此外，恶性的特别是转移性的肿瘤经常对常规治疗方法产生耐受性导致一些癌症的高发病率。

因此，迫切需要开发更有效的用于预防和治疗此类增生性疾病的方法，特别是组合方法。

溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子同时施用的组合疗法与单独使用其中一种方法相比提供协同免疫反应。出人意料地，如在合适的模型动物中已经证实的，在施用如抗pd-1或抗ctla-4的抗检查点抗体之前施用溶瘤痘苗病毒的组合疗法改善抗肿瘤应答，因此可能提供有效和强大的癌症疗法。因此，本文提供的实施方式在增生性疾病例如癌症的治疗和预防提供显著优势。

通过提供权利要求中限定的实施方式解决了该技术问题。

从本发明目前优选的实施方式的如下描述，本发明的其他和进一步的方面、特征以及优势将是显而易见的。出于公开的目的提供这些实施方式。

发明概述

本发明涉及溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子的协同组合，用于治疗增生性疾病例如癌症。所述溶瘤病毒优选选自呼肠孤病毒、新城疫病毒(ndv)、水疱性口炎病毒(vsv)、麻疹病毒、流感病毒、辛德比斯病毒(sinbisvirus)、腺病毒、痘病毒和疱疹病毒(hsv)等组成的组。在一实施方式中，所述溶瘤病毒为痘苗病毒。在一优选的实施方式中，所述痘苗病毒被工程改造为缺少胸苷激酶(tk)活性(例如，所述vv的基因组具有在j2r基因中的失活突变或基因缺失以产生tk缺陷表型)。可选地或者组合地，所述痘苗病毒被工程改造为缺少核糖核苷酸还原酶(rr)活性(例如，所述vv的基因组具有在i4l基因和/或f4l基因中的失活突变或者基因缺失以产生rr缺陷表型)。

在一实施方式中，所述痘苗病毒进一步表达至少一个治疗性基因，尤其是编码自杀基因产物和/或免疫刺激蛋白的基因。

在一实施方式中，所述一或多种免疫检查点调节因子为拮抗pd-1、pd-l1或ctla4的活性的拮抗分子，特别优选抗pd-1抗体和/或抗ctla4抗体。

在一实施方式中，所述溶瘤病毒优选被配制为用于静脉内或瘤内施用和/或所述一或多种免疫检查点调节因子优选被配制为用于静脉内或腹膜内或瘤内施用。

本发明进一步提供一种治疗增生性疾病包括癌症的方法，包含给需要治疗的哺乳动物施用协同有效量的如本文所述的溶瘤病毒以及一或多种如本文所述的免疫检查点调节因子。在一实施方式中，通过本发明的方法治疗的所述增生性疾病是癌症，且特别是黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌以及肝癌。在一实施方式中，所述方法包含额外步骤，其中给所述哺乳动物施用药学可接受的量的前药。优选地，所述前药的施用发生在所述溶瘤病毒或病毒组合物施用的至少三天之后。

本发明进一步提供一种试剂盒，其包含如本文所述的溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子，优选在不同容器内。

发明详述

本发明涉及一种包含至少一种溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子的组合物，其用于治疗增生性疾病例如癌症。

定义

在整个申请文件中，除非另有说明，否则术语“一个(种)(a)”和“一个(种)(an)”的意义为“至少一个(种)”，“至少第一”，“一或多个(种)”或者“多个(种)”所述指代的组分或步骤。例如，术语“一个细胞”包含多个细胞及其混合物。

术语“一或多个(种)”表示一个(种)或一以上的数目(例如2、3、4、5等)。

本文任何地方用到的术语“和/或”包含“和”、“或”以及“通过所述术语关联的元件的全部或任何其他组合”的意思。

本文使用的术语“约”或“大概”表示给定值或范围的20％以内，优选为10％以内，并且更优选为5％以内。

如本文所用，当用于定义产物、组合物和方法时，术语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，如“include”和“includes”)或“含有(containing)”(以及含有(comprising)的任何形式，如“contains”和“contain”)为开放式的且不排除额外的未记载的元件或方法步骤。因此，多肽“包含”氨基酸序列表示所述氨基酸序列可能是所述多肽的最终氨基酸序列的一部分。此多肽可以包含多达数百个额外氨基酸残基。“基本上由…….组成”表示将其他有重要意义的组分或步骤排除在外。所以，基本上由所记载的组分组成的组合物并不排除痕量的污染物和药学可接受的载体。多肽基本上由氨基酸序列组成表示这个氨基酸序列最终将存在少数几个额外氨基酸残基。“由……组成”表示不仅排除微量的其他成分或步骤。例如，多肽由氨基酸序列组成表示所述多肽不含有除了所述的氨基酸序列外的任何氨基酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指的是氨基酸残基聚合物，包含通过肽键相连的至少九个或以上的氨基酸。所述聚合物可以是线性的、分支的或环状的，并且可以包含天然氨基酸和/或氨基酸类似物，并且其可以被非氨基酸间断。一般来讲，如果所述氨基酸聚合物多于50个氨基酸残基，那么优选称其为多肽或蛋白质，而如有当其长50个氨基酸或更少，称其为“肽”。

本发明上下文中，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可相互替换使用并且定义任何长度的多脱氧核糖核苷酸(dna)(例如cdna、基因组dna、质粒、载体、病毒基因组、分离的dna、探针、引物以及其任何混合物)或多核糖核苷酸(rna)(例如mrna、反义rna、sirna)或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸的聚合物。它们涵盖单链或双链、线性或环状、天然或合成、修饰或未经修饰的多核苷酸。此外，多核苷酸可以包含非天然存在的核苷酸并且可以被非核苷酸组分间断。

如本文所用，术语“类似物”表示分子(多肽或核酸)相对于其天然对应物而言展现一个或多个修饰。可以设想任何修饰，包括一个或多个核苷酸或氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。优选的是保留与天然的对应物至少80％、优选至少85％、更优选至少90％和甚至更优选至少98％的序列相同性的类似物。

通常地，术语“相同性”表示在两个多肽或核苷酸序列中氨基酸与氨基酸或核苷酸与核苷酸的对应性。两个序列相同性百分比是所述序列共享的相同位置数目的函数，考虑需要导入以优化比对的缺口数目和每个缺口的长度。在本领域中有多种计算机程序和数学算法来确定氨基酸序列之间的相同性百分比，例如ncbi的blast程序或在atlasofproteinsequenceandstructure中的align(dayhoffed,1981,suppl.,3:482-9)。确定核苷酸序列之间相同性的程序也可以在专业数据库上获得(例如genbank、thewisconsinsequenceanalysispackage、bestfit、fasta和gap程序)。为说明目的，“至少80％的相同性”表示80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

本文中使用的术语“分离的”指蛋白质、多肽、肽、多核苷酸、载体等从其天然环境中移除(即与至少一种其天然伴随或在自然界中发现与其一起的其他组分分离)。例如，当核苷酸序列与在自然状态下通常与其相连的序列分离(例如从基因组解离)，所述核苷酸序列是分离的，但它可与异源序列相连。

术语“获得自”、“源自(originating)”或“源自(originate)”用于表示组分(例如多肽和核苷酸分子)的原始来源，但不意味着限制制备所述组分的方法，所述方法可以是例如化学合成或重组手段。

本文中所使用的术语“宿主细胞”应当被广义理解，不受任何关于组织、器官或分离的细胞的特定结构的限制。这样的细胞可能是独特类型的细胞或一组不同类型的细胞，例如培养的细胞系、原代细胞以及分裂中的细胞。在本发明上下文中，术语“宿主细胞”包括原核细胞、低等真核细胞例如酵母、其他真核细胞例如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人或非人)细胞以及能生产用于本发明的溶瘤病毒和/或免疫检查点调节因子的细胞。该术语还包括可以是或已经是本文中所描述的载体的受体的细胞以及这些细胞的后代。

本文中使用的术语“溶瘤病毒”表示这样的病毒，其在体外或在体内能选择性地在分裂中的细胞(例如增生细胞，例如癌症细胞)复制以减慢所述分裂中的细胞的生长和/或裂解所述分裂中的细胞，而在非分裂中的细胞显示不复制或最少的复制。一般地，溶瘤病毒包含包装进病毒颗粒(或病毒体)中的病毒基因组，并且是感染性的(即能够感染和进入宿主细胞或对象)。

术语“治疗”如本文所用涵盖预防(例如在具有患上待治疗的病理状态的风险的对象中的预防措施)和/或治疗(例如在已经诊断为患有所述病理状态的对象中)，最终与常规治疗模式相关。治疗的结果是减慢、治愈、改善或控制目标病理状态的进展。例如，如果在施用如本文所述的溶瘤病毒以及一或多种免疫检查点调节因子之后，对象表现出可以观察到的临床状态的改善，则成功治疗所述对象的癌症。

本文中的术语“施用”表示向对象递送治疗剂，例如文中所描述的溶瘤病毒和/或免疫检查点调节因子。

本文中的术语“增生性疾病”涵盖由不受控的细胞生长和扩散导致的任何疾病或状况包括癌症，以及与破骨细胞活性升高相关的疾病(例如类风湿性关节炎、骨质疏松症等)和心血管疾病(血管壁平滑肌细胞增生引起的再狭窄等)。术语“癌症”可与以下任何术语互换使用：“肿瘤”、“恶性肿瘤”、“新生物(neoplasm)”等。这些术语旨在包含任何类型的组织、器官或细胞以及恶性肿瘤的任意阶段(例如从癌前病变到iv期)。

术语“对象”通常表示需要本发明的任何产品和方法或可从本发明的任何产品和方法中获益的生物体。典型地，所述生物体是哺乳动物，特别是选自家畜、农场动物、运动动物和灵长类的哺乳动物。优选地，所述对象是已经被诊断为患有患有增生性疾病例如癌症或者处于患上增生性疾病例如癌症的风险中的人类。术语“对象”和“患者”当指代人类生物体时可以互换使用并且涵盖男性和女性。治疗的对象可以是新生儿、婴儿、年轻人或成年人。

本文中的术语“组合”表示多种组分(例如溶瘤病毒和免疫检查点调节因子)的任意可能的排列组合。这种排列组合包含至少一种溶瘤病毒和多肽形式的一或多种免疫检查点调节因子(例如重组抗体或混合的重组抗体)或核苷酸分子形式的一或多种免疫检查点调节因子(例如，由一个或多个被改造以表达所述一或多种免疫检查点调节因子的载体携带)的混合物，以及多肽和核苷酸分子(例如重组抗体和表达载体)的混合物。本发明涵盖包含等物质的量浓度的每种免疫检查点调节因子(当使用多于一种时)的组合或具有非常不同浓度的组合。理解本领域技术人员可以确定组合中的每种组分的最适浓度。优选地，所述组合是协同性的，提供高于各实体单独的效力。

术语“免疫检查点调节因子”指的是能够以正或负的方式调节免疫检查点蛋白的方能的分子(特别是，抗原递呈细胞(apc)例如癌症细胞和免疫t效应细胞间的相互作用)。术语“免疫检查点”表示直接或间接参与免疫路径的蛋白质，所述免疫路径为在正常生理条件下对于预防不受控的免疫反应至关重要，并因此对于维持自体耐受性和/或组织保护至关重要。本文所述一或多种免疫检查点调节因子可独立作用于t细胞介导的免疫的任何步骤，包括抗原特异性细胞的克隆选择、t细胞激活、增殖、运输到抗原和炎症部位、执行直接效应子功能和通过细胞因子和膜配体的信号传导。这些步骤的每个通过抗衡刺激性和抑制性信号而调节以对反应进行微调。在本发明上下文，此术语涵盖能够至少部分地下调抑制性免疫检查点功能的免疫检查点调节因子(拮抗剂)和/或能够至少部分地上调刺激性免疫检查点功能的免疫检查点调节因子(激动剂)。

溶瘤病毒

本发明使用的所述溶瘤病毒可获得自目前被鉴定的病毒的任何成员，只要其溶瘤，由于其与非分裂中细胞相比在分裂中的细胞中选择性复制并杀死分裂中的细胞的特性。其可以是天然溶瘤的天然病毒或可以通过修饰一个或多个病毒基因以增加肿瘤选择性和/或在分裂中的细胞的优先复制来改造，所述病毒基因例如那些涉及dna复制、核酸代谢、宿主趋向性、表面附着、毒力、细胞溶解和扩散的基因(见例如kirnetal.,2001,nat.med.7:781；wongetal.,2010,viruses2:78-106)。也可设想将一个或多个病毒基因置于事件或组织特异性调控元件(例如启动子)的控制之下。

典型的溶瘤病毒包含但不限于呼肠孤病毒(reovirus)、塞内加谷病毒(senecavalleyvirus)(svv)、水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)(vsv)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)(ndv)、单纯孢疹病毒(herpessimplexvirus)(hsv)、麻疹病毒属病毒(morbillivirusvirus)、逆转录病毒(retrovirus)、流感病毒(influenzavirus)、辛德比斯病毒(sinbisvirus)、痘病毒(poxvirus)、腺病毒(adenovirus)等。

在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自呼肠孤病毒(reovirus)。代表性的实例包括reolysin(oncolyticsbiotech正在研发中；nct01166542)。

在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自塞内加谷病毒(senecavalleyvirus)。代表性的实例包括ntx-010(rudinetal.,2011,clin.cancer.res.17(4):888-95)。

在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自水疱性口炎病毒(vsv)。用于本发明的代表性实例在文献中已有描述(例如stojdletal.,2000,nat.med.6(7):821-5；stojdletal.,2003,cancercell4(4):263-75)。

在一个实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自新城疫病毒。本发明的代表性的实例包含但不限于73-tpv701和hdv-huj株以及在文献中记载的那些(例如phuangsabetal.,2001,cancerlett.172(1):27-36；lorenceetal.,2007,curr.cancerdrugtargets7(2):157-67；freemanetal.,2006,mol.ther.13(1):221-8)。

在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自单纯孢疹病毒(hsv)。疱疹病毒科为dna病毒的大家族，其全部具有共同的结构并包含衣壳化于二十面体衣壳中的相对大的编码100-200个基因的双链线性dna基因组，该二十面体衣壳包裹在脂质双层膜中。虽然所述溶瘤疱疹病毒可衍生自不同类型的hsv，但特别优选的是hsv1和hsv2。所述疱疹病毒可被遗传改造以限制病毒在肿瘤内的复制或降低它在非分裂中细胞内的细胞毒性。例如，任何涉及核酸代谢的病毒基因可被失活，例如胸苷激酶(martuzaetal.,1991,science252:854-6)、核糖核苷酸还原酶(rr)(boviatsisetal.,1994,genether.1:323-31；minetaetal.,1994,cancerres.54:3363-66)或尿嘧啶-n-糖基化酶(pylesetal.,1994,j.virol.68:4963-72)。另一方面涉及病毒突变体，其具有编码毒力因子的基因功能的缺陷，所述基因例如icp34.5基因(chambersetal.,1995,proc.natl.acad.sci.usa92:1411-5)。溶瘤疱疹病毒的代表性实例包括nv1020(例如geevargheseetal.,2010,hum.genether.21(9):1119-28)和t-vec(andtbackaetal.,2013,j.clin.oncol.31,abstractnumberlba9008)。

在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自麻疹病毒属，所述麻疹病毒属可以获得自副粘液病毒科，特别优选麻疹病毒。合适的溶瘤麻疹病毒的代表性实例包含但不限于mv-edm(mcdonaldetal.,2006；breastcancertreat.99(2):177-84)和hmwmaa(kaufmannetal.,2013,j.invest.dermatol.133(4):1034-42)。

在一实施方式中，本发明的所述溶瘤病毒获得自腺病毒。本领域已有改造溶瘤腺病毒的方法。有利的策略包括用肿瘤选择性启动子置换病毒启动子或修饰e1腺病毒基因产物以灭活其与在肿瘤细胞中被改变的p53或视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)(rb)蛋白的结合功能。在天然环境中，腺病毒e1b55kda基因与其他腺病毒产物协作使p53失活(在癌细胞中p53通常失调)，因此阻止细胞凋亡。溶瘤腺病毒的代表性实例包括onyx-015(例如khurietal.,2000,nat.med6(8):879-85)和也叫oncorine的h101(xiaetal.,2004,aizheng23(12):1666-70)。

在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒是痘病毒。本发明使用的术语“痘病毒”表示属于痘病毒科的病毒，特别优选属于脊椎动物痘病毒(chordopoxviridae)亚科的痘病毒，并且更优选属于正痘病毒(orthopoxvirus)属。多种痘病毒的基因组序列，例如痘苗病毒(vacciniavirus)、牛痘病毒(cowpoxvirus)、金丝雀痘病毒(canarypoxvirus)、鼠痘病毒(ectromeliavirus)和粘液瘤病毒(myxomavirus)的基因组在本领域以及专业数据库中可以获得，例如genbank(登录号分别为nc_006998、nc_003663、nc_005309、nc_004105、nc_001132)。

期望地，所述溶瘤痘病毒为溶瘤痘苗病毒。痘苗病毒是痘病毒科的成员，其特征为200kb双链dna基因组，所述基因组编码大量使病毒能够不依赖于宿主细胞结构进行复制的病毒酶和因子。大部分的痘苗病毒粒子是细胞内的(imv意为细胞内成熟病毒体)，具有单层脂质包膜并在被感染细胞的细胞质中存留直至溶解。另一种感染性的形式为双层包膜粒子(eev意为细胞外包被的病毒体)，其从被感染细胞出芽而不溶解该细胞。

虽然可以衍生自任何痘苗病毒株，但更优选埃尔斯特里(elstree)、惠氏(wyeth)、哥本哈根(copenhagen)和西储(westernreserve)株。本文使用的基因命名法为哥本哈根(copenhagen)痘苗病毒株的命名法。除非另有指示，此法还用于本文中的其他痘病毒科的同源基因。然而，基因命名法可能根据痘株而有所不同，但哥本哈根(copenhagen)和其他痘苗病毒株之间的对应关系通常可在文献中获得。

优选地，本发明的所述溶瘤痘苗病毒通过改变一个或多个病毒基因进行修饰。优选地，所述修饰导致合成(或不合成)有缺陷的蛋白，该蛋白不具备未经修饰的基因在正常条件下产生的蛋白的活性。修饰涵盖病毒基因或其调控元件内一个或多个核苷酸(连续或不连续)的缺失、突变和/或取代。修饰可通过本领域技术人员已知的许多方式使用常规重组技术进行。示例性的修饰在文献中公开，特别优选那些改变参与dna代谢、宿主毒力和ifn途径的病毒基因的修饰(见例如guseetal.,2011,expertopinionbiol.ther.11(5):595-608)。

更优选地，本发明中的所述溶瘤痘病毒通过改变编码胸苷激酶的基因(j2r基因座)进行修饰。所述胸苷激酶涉及脱氧核糖核苷酸的合成。胸腺激酶对于正常细胞中的病毒复制是必需的，因为这些细胞通常具有低浓度的核苷酸，而胸腺激酶在分裂中的细胞中是可有可无的，因为分裂中的细胞有高核苷酸浓度。

可选地或者组合地，本发明的所述溶瘤痘病毒通过改变至少编码核糖核苷酸还原酶(rr)的一个或者两个基因进行修饰。在自然环境中，该酶催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，其是dna生物合成的关键步骤。该病毒酶在亚基结构上与哺乳动物的酶相似，均包含两个异源亚基，称为r1和r2，分别由i4l和f4l基因座编码。不同痘病毒中的i4l和f4l基因的序列以及在基因组上的位置在公共数据库上可以获得，例如通过登录号dq437594、dq437593、dq377804、ah015635、ay313847、ay313848、nc_003391、nc_003389、nc_003310、m-35027、ay243312、dq011157、dq011156、dq011155、dq011154、dq011153、y16780、x71982、af438165、u60315、af410153、af380138、u86916、l22579、nc_006998、dq121394和nc_008291。在本发明中，i4l基因(编码r1大亚基)或f4l基因(编码r2小亚基)之一或两者可被失活。

可选地或者组合地，也可使用其他策略来进一步地增加病毒肿瘤特异性。合适的修饰的代表性实例包括从病毒基因组中破坏vgf编码基因。vgf(痘苗病毒生长因子)是分泌蛋白，其在细胞感染后的早期表达并且其功能似乎对于病毒在正常细胞间传播十分重要。另一个实例是破坏编码血凝素(hemagglutinin)的a56r基因，最后与胸苷激酶缺失组合(zhangetal.,2007,癌症res.67:10038-46)。破坏干扰素调节基因(例如b8r或b18r基因)或者是胱天蛋白酶-1抑制因子b13r基因也是有利的。

优选实施方式中，本发明所使用的溶瘤病毒是由j2r基因中的失活突变导致tk缺陷的痘苗病毒。在另一个优选实施方式中，本发明所使用的溶瘤病毒是由病毒基因组携带的所述j2r基因和所述i4l和/或f4l基因两者中的失活突变导致tk和rr活性均缺陷的痘苗病毒(如wo2009/065546和foloppeetal.,2008,genether.,15:1361-71中所述)。

治疗性基因

在一实施方式中，本发明中使用的所述溶瘤病毒进一步地表达至少一个插入病毒基因组中的治疗性基因。当正确施用于对象时，“治疗性基因”编码能够提供生物活性的产物，预期该生物活性可以对待治疗的病理状态的进程和症状产生有益效果，其通过加强抗肿瘤功效或强化病毒的溶瘤性。在本发明中，所述治疗性基因可以是人来源或非人来源(例如细菌、酵母或病毒来源)。优选地，所述治疗性基因不是编码如本文所述的免疫检查点调节因子的基因或核苷酸序列。

在本发明上下文中，可以设想到大量的治疗性基因，例如那些编码能够补偿对象中的蛋白缺陷或不足的多肽的基因，或那些通过毒性效应从体内限制或除去有害细胞的基因，或那些编码免疫效应的多肽的基因。他们可以是天然基因或者通过之后一个或多个核苷酸的突变、缺失、取代和/或添加获得的基因。

有利地，本发明使用的溶瘤病毒携带治疗性基因，该治疗性基因选自编码自杀基因产物和免疫刺激蛋白的基因。

自杀基因

术语“自杀基因”表示编码可以将药物前体转换为细胞毒性化合物的蛋白的基因。自杀基因包含但不限于编码具有胞嘧啶脱氨酶活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性以及胸苷酸激酶活性的蛋白的基因。自杀基因以及相应的包含一个核碱基部分的药物前体的实例在下表列出。

表1

期望地，所述自杀基因编码至少具有胞嘧啶脱氨酶(cdase)活性的蛋白质。在原核生物和低等真核生物中(在哺乳动物中不存在)，cdase参与嘧啶代谢途径，经由该途径，外源胞嘧啶通过水解脱氨基作用被转变为尿嘧啶。cdase也能够脱去胞嘧啶类似物即5-氟胞嘧啶(5-fc)的氨基，从而形成5-氟二氧嘧啶(5-fu)，5-氟二氧嘧啶(5-fu)是一种当转变为5-氟-ump(5-fump)后具有强细胞毒性的化合物。cdase编码的核苷酸分子可以获得自任何原核和低等真核生物，例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(fcy1基因)、白色念珠菌(candidaalbicans)(fca1基因)和大肠杆菌(codagene)。基因序列和编码的cdase蛋白已经发表且可以在专门的数据库中获得(swissprotembl、genbank、medline等)。也可以使用这些基因的功能类似物。优选地，所述类似物具有与天然基因的核酸序列具有至少70％，有利地至少80％，优选至少90％，最优选95％相同性程度的核酸序列。

可选地或者组合地，本发明的所述溶瘤病毒在其病毒基因组中携带编码具有尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uprtase)活性的多肽的自杀基因。在原核生物和低等真核生物中，尿嘧啶通过uprtase的作用转化成ump。该酶将5-fu转化为5-fump。举例说明，从大肠杆菌(andersenetal.,1992,europeanj.biochem.204:51-56)、从乳酸乳球菌(lactococcuslactis)(martinussenetal.,1994,j.bacteriol.176:6457-63)、从牛结核分枝杆菌(mycobacteriumbovis)(kimetal.,1997,biochem.mol.biol.internat.41:1117-24)以及从枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)(martinussenetal.,1995,j.bacteriol.177:271-4)中获得的编码uprtase的核酸序列可用在本发明中。但是，最特别优选使用酵母uprtase，特别是酿酒酵母(s.cerevisiae)(fur1基因)编码的，其序列在kern等(1990,gene88:149-57)中公开。也可以使用功能性的uprtase类似物，例如在ep998568中记载的氮末端截短的fur1突变体(缺失前35个残基直至存在于天然蛋白第36位的第二个met残基)，所述突变体与天然酶相比展现出更高的uprtase活性。

优选地，插入本发明所使用的溶瘤病毒的病毒基因组中的自杀基因编码具有cdase和uprtase活性的多肽。此多肽可通过融合两个酶促结构域而改造，其中一个结构域具有cdase活性而另一个具有uprtase活性。示例性的多肽包含但不限于在wo96/16183、ep998568和wo2005/07857记载的融合多肽coda::upp、fcy1::fur1和fcy1::fur1[delta]105(fcu1)以及fcu1-8。特别感兴趣的是fcu1自杀基因(或fcy1::fur1[delta]105融合)，其编码包含在wo2009/065546中序列编号seqidno:1所示的氨基酸序列的多肽。本发明涵盖所述多肽的类似物，只要其保留cdase和/或uprtase活性。本领域技术人员有能力从已发布的数据中分离编码cdase和/或uprtase的核苷酸分子，最终改造其类似物并且在无细胞或者细胞系统中利用常规技术检验酶促活性(见例如ep998568)。

免疫刺激治疗性基因

在本文中，术语“免疫刺激蛋白”表示具有以特异性或非特异性方式刺激免疫系统的能力的蛋白质。大量蛋白质由于它们实现免疫刺激效果的能力而被本领域所知晓。在本发明中，合适的免疫刺激的蛋白的实例包含但不限于细胞因子，特别是白细胞介素(例如il-2、il-6、il-12、il-15以及il-24)、趋化因子(例如cxcl10、cxcl9以及cxcl11)、干扰素(例如ifng以及ifnalpha)、肿瘤坏死因子(tnf)、集落刺激因子(例如gm-csf、c-csf以及m-csf……)、apc(抗原呈递细胞)-外露蛋白(例如b7.1、b7.2等)、生长因子(转化生长因子tgf、纤维母细胞生长因子fgf、血管内皮细胞生长因子vegf等)、i型或ii型主要组织相容性复合物(mhc)抗原、细胞凋亡诱导剂或抑制剂(例如bax、bcl2、bcix……)、细胞静止素(p21、p16、rb等)、免疫毒素(immunotoxin)、抗原(抗原性多肽、表位等)以及标记物(β-半乳糖苷酶、荧光素酶……)。优选地，所述免疫刺激蛋白是白细胞介素或集落刺激因子，特别优选gm-csf。

治疗性基因的表达

所述治疗性基因可以根据常规技术通过克隆、通过pcr或通过化学合成容易地获得。另外，所述治疗性基因可以被优化以在特定宿主细胞或对象中提供高表达水平。已经的确观察到，生物体中的密码子使用模式是高度不随机的，并且不同宿主之间的密码子使用可以显著不同。因为所述治疗性基因可以来源于细菌或者低等真核生物(例如自杀基因)，其可能具有对于在高等真核细胞中(例如人类)的有效表达不合适的密码子使用模式。一般而言，密码子优化是通过更换一个或多个对应于目标宿主生物体中不常使用的密码子的“天然”密码子(例如细菌或酵母)替换为一个或多个编码相同氨基酸的常使用的密码子。不需要替换所有的相应于不经常使用的密码子的天然密码子，因为即使部分替换也可以达到增强表达。

除了优化密码子使用，可以通过额外修饰基因序列进一步增强在宿主细胞或对象中的表达。例如，所述治疗性基因序列可以被修饰以防止成簇的稀有的、非优化的密码子存在于集中区域，和/或抑制或修饰预计会负影响表达效果的“负”序列元件。这些负序列元件包括但不限于gc含量非常高(>80％)或非常低(<30％)的区域；at-富集或gc-富集序列延伸；不稳定的正向或反向重复序列；rna二级结构；和/或内部隐藏调控元件，例如内部tata框，chi-位点，核糖体进入位点，和/或剪接供体/受体位点。

依照本发明，插入用于本发明的溶瘤病毒基因组中的所述治疗性基因可操作地连接到适当的调控元件上以在宿主细胞或对象中表达。如本文中所使用的，术语“调控元件”或“调控序列”表示任何元件，其允许、有助于或调节所述治疗性基因在给定宿主细胞或对象中的表达，包括复制、扩增、转录、剪接、翻译、稳定和/或核苷酸或其衍生物(即mrna)的运输。如本文中所使用的，“可操作地连接”是指被连接的所述元件被设置使得它们能够依照其预期目标而发挥作用。例如，启动子可操作地连接到核苷酸分子上，如果所述启动子在允许的宿主细胞内实现从所述核苷酸分子的转录起始密码子到转录终止子的转录。

本领域技术人员会理解调控序列的选择可能取决于如下因素：基因本身、其所插入的病毒、宿主细胞或对象、期望的表达水平等。启动子特别重要。在本发明的情况下，其可以组成型地指导所述治疗性基因在多种类型宿主细胞的表达或对某些宿主细胞特异(例如，肝脏-特异性调控序列)，或响应于特定事件或外源因素(例如通过温度、营养添加物、激素等)或根据病毒周期的阶段(例如晚期或早期)而被调控。为了优化病毒的生产和避免所表达多肽的潜在毒性，也可以使用在生产步骤期间响应于特定事件或外源因素而被抑制的启动子。

适合在哺乳动物细胞中组成型表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(cytomegalovirus(cmv))立即早期启动子(us5,168,062)、rsv启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(adraetal.,1987,gene60:65-74)、单纯性疱疹病毒(hsv)-1的胸苷激酶(tk)启动子以及t7聚合酶启动子(wo98/10088)。痘苗病毒启动子特别适于在溶瘤痘病毒中表达。典型实例包括但不限于牛痘7.5k、h5r、11k7.5(erbsetal.,2008,cancergenether.15(1):18-28)、tk、p28、p11和k1l启动子，以及合成启动子，例如在chakrabarti等中描述的(1997,biotechniques23:1094-7；hammondetal,1997,j.virolmethods66:135-8；andkumarandboyle,1990,virology179:151-8)，以及早期/晚期嵌合启动子。适合溶瘤麻疹病毒的启动子包含但不限于指导麻疹转录单元的表达的任何启动子(brandlerandtangy,2008,cimid31:271)。

本领域技术人员会领会控制所述治疗性基因表达的所述调控元件可以进一步包括额外的元件，其用于转录的恰当启动、调控和/或终止(例如polya转录终止序列)、mrna转运(例如核定位信号序列)、加工(例如剪切信号)、稳定(例如内含子和非编码的5'和3'端序列)和翻译(例如起始met、三联体前导序列、ires核糖体结合位点、信号肽等)。

所述治疗性基因可以被插入至病毒基因组的任何位置，特别优选非必需基因座。例如，tk基因特别适合插入溶瘤痘苗病毒。

在一个优选的实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒是tk和rr活性均缺失(例如病毒j2r和i4l基因两者中的失活突变造成)的痘苗病毒(优选来自哥本哈根株)。更优选地，所述痘苗病毒装备有自杀基因，特别优选本文中所述的fcu1自杀基因。更加优选地，所述自杀基因(例如fcu1)受p11k7.5痘苗病毒启动子的转录控制。仍更优选地，被置于痘苗病毒启动子控制下的所述fcu1被插入到病毒基因组的tk基因座内。

在一个可选的且也是优选的实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒是缺失tk活性(病毒j2r基因失活突变造成)的痘苗病毒(优选来自惠氏株)。更优选地，所述痘苗病毒装备有免疫刺激治疗性基因，特别优选本文所述的人类gm-csf基因。更优选地，所述治疗性基因(例如gm-csf)受合成早-晚启动子痘苗病毒启动子的转录控制，并且优选插入tk基因座内。

通常，根据本发明使用的所述溶瘤病毒在合适的宿主细胞系中使用常规技术产生，所述常规技术包括在合适条件下培养转染的或感染的宿主细胞以允许感染性病毒颗粒的产生以及从所述细胞的培养物中回收所产生的感染性病毒颗粒，以及任选地纯化所述回收的感染性病毒颗粒。合适的用于产生所述溶瘤病毒的宿主细胞包括但不限于人类细胞系，例如hela(atcc)、293细胞(grahametal.,1997,j.gen.virol.36:59-72)、her96、per-c6(fallauxetal.,1998,humangenether.9:1909-17)、禽类细胞(比如在wo2005/042728,wo2006/108846,wo2008/129058,wo2010/130756,wo2012/001075等中描述的那些)、仓鼠细胞系例如bhk-21(atccccl-10)以及从获得自受精鸡蛋的鸡胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(cef)。在用于本发明之前，所述溶瘤病毒可以进行至少部分分离。可以设想多种纯化步骤，包括澄清、酶促处理(例如benzonase、蛋白酶)、层析步骤和过滤步骤。本领域已经描述了合适的方法(例如wo2007/147528、wo2008/138533、wo2009/100521、wo2010/130753、wo2013/022764)。

免疫检查点调节因子

免疫检查点和其调节因子以及使用此类化合物的方法在文献中描述。根据本发明，一或多种免疫检查点调节因子可能独立地是多肽或编码多肽的核酸分子；所述多肽包含能够结合靶免疫检查点和/或抑制配体结合所述靶免疫检查点以发挥拮抗功能(即能够拮抗免疫检查点介导的抑制信号)或激动剂功能(即能够加强免疫检查点介导的刺激信号)的结构域。这样的一或多种免疫检查点调节因子能独立地选自肽(例如肽配体)、天然受体的可溶结构域、rnai、反义分子、抗体和蛋白质支架。

在一个优选的实施方式中，所述免疫检查点调节因子是抗体。在本发明的情况下，“抗体”(“ab”)具有最广的含义并且包含自然出现的和人工制备的以及全长抗体或其能够结合到靶免疫检查点或表位(因此保留靶结合部分)的功能性片段或类似物。本发明使用的所述抗体可能是任何来源，例如人抗体、人源化抗体、动物抗体(例如啮齿动物或骆驼科的抗体)或者嵌合抗体。可能是任何同种型，特别优选igg1或igg4的同种型。此外，可能是糖基化的或者非糖基化的。术语抗体还包含双特异性或多特异性抗体，只要他们显示出上述的结合特异性。

为说明目的，全长抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(h)和两个轻链(l)。每个重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区，重链恒定区由三个ch1、ch2和ch3结构域组成(最终ch1和ch2之间存在铰链)。每个轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区，轻链恒定区包含cl结构域。vh和vl区包含高变区，称为互补决定区(cdr)，间隔有更保守的区域，称为骨架区(fr)。每个vh和vl以下列顺序包含三个cdr和四个fr：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。重链和轻链的所述cdr区域是结合特异性的决定因素。

如本文中所使用的，“人源化抗体”表示非人类(例如小鼠、骆驼、大鼠等)抗体其蛋白质序列被改变以增加与人类抗体(即人类天然产生的抗体)的相似性。人源化方法是本领域众所周知的(例子见prestaetal.,1997,cancerres.57(20):4593-9；us5,225,539；us5,530,101；us6,180,370；wo2012/110360)。例如，可以人源化为供人类使用而开发的单克隆抗体，通过取代一个或多个fr区的残基使其看起来像人类免疫球蛋白序列，而可变区的绝大多数残基没有被改变且与非人免疫球蛋白的那些对应。作为一般通则，在fr区的这些氨基酸取代的数目在每个vh或vl的可变区内通常不超过20个。

如本文中所使用的，“嵌合抗体”表示包含一种物种的一或多个元件和另一物种的一或多个元件的抗体，例如，包含人类免疫球蛋白的恒定区(fc)的至少一部分的非人抗体。

很多形式的抗体可以被改造用于本发明的组合。典型的实例包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2、dab、fd、fv、scfv、双-scfv和双抗体(diabody)等。更具体地：

(i)表示为由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段的fab片段；

(ii)表示为包含两个在铰链区通过至少一个二硫键相连的fab片段的二价片段的f(ab')2片段；

(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；

(iv)由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；

(v)由单个可变结构域片段(vh或vl结构域)组成的dab片段；

(vi)单链fv(scfv)，其包含fv片段的两个结构域，vl和vh，最终通过接头融合在一起形成单蛋白质链(例子见birdetal.,1988,science242:423-6；hustonetal.,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-83；us4,946,778；us5,258,498)；以及

(vii)任何其他人工抗体。

制备抗体、其片段和类似物的方法是本领域已知的(例如harlowandlane,1988,antibodies–alaboratorymanual；coldspringharborlaboratory,coldspringharborny)。例如可以用杂交瘤技术(如kohlerandmilstein,1975,nature256:495-7；coteetal.,1983,proc.natl.acad.sci.usa80:2026-30；coleetal.inmonoclonalantibodiesandcancertherapy；alanlisspp77-96中所述)，重组技术(例如使用噬菌体展示技术)，肽合成和酶促切割。抗体片段能通过如本文所述的重组技术产生。抗体片段也可通过利用酶进行蛋白质裂解产生，例如如文中所描述的用木瓜蛋白酶生产fab片段或用胃蛋白酶生产f(ab')2片段(例如wahletal.,1983,j.nucl.med.24:316-25)。类似物(或其片段)可以通过常规分子生物方法(pcr、突变技术)制备。如果有需要，可以与原抗体相同的方式(例如通过标准elisa实验)针对功能性筛选这些片段和类似物。

在一个优选的实施方式中，本发明使用的一或多种免疫检查点调节因子的至少一种是单克隆抗体，特别优选人抗体(其中两个骨架区来源于人种系免疫球蛋白序列)或根据熟知的人源化方法的人源化抗体。

期望地，本发明的使用的一或多种免疫检查点调节因子至少部分拮抗(例如大于50％)抑制性免疫检查点的活性，特别是通过以下任一介导的：pd-1、pd-l1、pd-l2、lag3、tim3、kir、btla和ctla4，特别优选特异性结合任何这样的靶蛋白的单克隆抗体。术语“特异性结合”表示甚至在其他异源蛋白和生物制剂存在的条件下对特定靶或表位的结合特异性和亲和力的大小。因此，在指定的测定条件下，本发明使用的抗体优先结合它的靶，且不以显著量结合测试样品或对象中存在的其他成分。优选地，此抗体表现出对它的靶结合的高亲和力，其平衡解离常数等于或小于1x10^-6m(例如至少0.5x10^-6、1x10^-7、1x10^-8、1x10^-9、1x10^-10等)。可选地，本发明的一或多种免疫检查点调节因子执行激动剂的功能，能够刺激或加强刺激信号，特别是那些cd28介导的优选为icos、cd137(4-1bb)、ox40、cd27、cd40和gitr免疫检查点的任一种。评估抗体对免疫检查点的结合能力的标准测定为本领域已知，包括例如elisa、蛋白质印迹(westernblot)、ria和流式细胞术(flowcytometry)。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也能通过本领域已知的标准测定进行评估，例如通过biacore分析。

在一个优选的实施方式中，本发明使用的至少一种所述一或多种检查点调节因子包含人或人源化的抗体，其能拮抗涉及t细胞介导的反应的免疫检查点。优选的免疫检查点调节因子实例为能够至少部分拮抗程序性死亡蛋白(pd-1)的调节因子，并且特别是特异性地结合人pd-1的抗体。pd-1是免疫球蛋白(ig)基因超家族的一部分，是cd28家族成员。它是在抗原刺激过的细胞(例如活化的b细胞、t细胞、以及骨髓细胞)(agataetal.,1996,int.immunol.8:765-72；okazakietal.,2002,curr.opin.immunol.14:391779-82；bennettetal.,2003,j.immunol170:711-8)中表达的55kda的1型跨膜蛋白。在正常环境中，它通过在炎症反应时限制t细胞的活性起作用，从而保护正常组织不被破坏(topalian,2012,curr.opin.immunol.24:207-12)。pd-1的两个配体已被识别，分别是pd-l1(程序性死亡配体1)和pd-l2(程序性死亡配体2)(freemanetal.,2000,j.exp.med.192:1027-34；carteretal.,2002,eur.j.immunol.32:634-43)。pd-l1在20-50％的人类癌症中被发现(dongetal.,2002,nat.med.8:787-9)。pd-1和pd-l1间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞的降低，t-细胞受体介导的增殖降低，以及癌症细胞的免疫逃避(dongetal.,2003,j.moi.med.81:281-7；blanketal.,2005,cancerimmunol.immunother.54:307-314)。pd-1的完整的核苷酸和氨基酸序列能在genbank登录号nou64863和np_005009.2找到。一些抗pd1抗体可在本领域获得(例如在以下中描述的：wo2004/004771；wo2004/056875；wo2006/121168；wo2008/156712；wo2009/014708；wo2009/114335；wo2013/043569；和wo2014/047350)。本发明情况下优选的抗pd-1抗体为fda批准的或在高级临床研发的，并且尤其可使用以下抗pd-1抗体：nivolumab(由bristolmyersquibb开发，也称为bms-936558)，pembrolizumab(由merck开发，也称为lanbrolizumab或mk-3475)，以及pidilizumab(由curetech开发，也称为ct-011)。

另一个优选的免疫检查点调节因子的实例为能够至少部分拮抗称为pd-l1的pd-1配体的调节因子，尤其是能够识别人类pd-l1的抗体。一些抗pd-l1抗体在本领域可获得(例子见在ep1907000描述的那些)。优选的抗pd-l1抗体为fda批准的或在高级临床开发的(例如由genentech/roche开发的mpdl3280a和由bristolmyersquibb开发的bms-936559)。

在另一种免疫检查点调节因子的优选实施例为能够至少部分拮抗ctla-4蛋白的调节因子，尤其是识别人类ctla-4的抗体。ctla4(即细胞毒性t-淋巴细胞相应抗原4)也称为cd152，在1987被鉴别(brunetetal.,1987,nature328:267-70)，由ctla4基因编码(dariavachetal.,eur.j.immunol.18:1901–5)。ctla4是受体免疫球蛋白超家族的一员。它在辅助性t细胞的表面表达，在那里它主要调节早期t细胞激活的幅度。最近的研究提示ctla-4可能在生物体内通过从抗原递呈细胞的细胞膜上捕获并移除b7-1和b7-2起作用，因此这些不能激活cd28(qureshietal.,science,2011,332:600-3)。完整的ctla-4核苷酸序列能够在genbank登录号ll5006下获得。一些抗ctla-4抗体在本领域中可获得(例如在us8,491,895中描述的)。本发明情况下优选的抗ctla-4抗体为fda批准的或在高级临床研发的。尤其可引用伊匹木单抗(ipilimumab)，其由bristolmyersquibb作为yervoy销售(见例如us6,984,720；us8,017,114)，由辉瑞开发的曲美木单抗(tremelimumab)(见例如us7,109,003和us8,143,379)以及单链抗ctla4抗体(见例如wo97/20574和wo2007/123737)。

拮抗lag3受体的免疫检查点调节因子也可用在本发明的组合中(见例如us5,773,578)。

另一个合适的免疫检查点调节因子的示例为ox40激动剂，例如ox40的激动剂配体(ox40l)(见例如us5,457,035、us7,622,444；wo03/082919)或针对ox40受体的抗体(见例如us7,291,331和wo03/106498)。

另一种免疫检查点调节因子的实例为cd8+t细胞和nk细胞包含的靶向抑制性受体的抗kir或抗cd96抗体。

本发明包含一种包含多于一种免疫检查点调节因子的组合。优选实例包括但不限于使用与如本文所述的溶瘤病毒组合的抗ctla-4抗体和抗pd-1抗体。

免疫检查点调节因子的制备

本发明使用的所述一或多种免疫检查点调节因子可以通过重组手段使用合适的表达载体和宿主细胞制备。

编码所需的免疫检查点调节因子的相应部分的核苷酸分子能够利用本领域可得的序列数据和提供的信息通过使用常规分子生物学技术(例如pcr扩增、cdna克隆、化学合成)获得。例如，编码抗体的轻链和重链或他们的cdr的cdna能够从杂交瘤、免疫球蛋白基因文库或任何可获得的来源中分离。

在一个实施方式中，编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子能被克隆在合适的载体中并且通过重组手段在宿主细胞中表达以产生所述免疫检查点调节因子。插入表达载体可以通过常规分子生物技术执行，例如在sambrook等中描述的(2001,molecularcloning-alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory)。插入腺病毒载体或者痘病毒载体可以通过同源重组执行，如分别在chartier等(1996,j.virol.70:4805-10)和paul等(2002,cancergenether.9:470-7)中描述的。如本文与所述治疗性基因相关所描述的，编码免疫检查点调节因子的核酸分子也可以被优化以增加表达水平。

可能构建或使用各种宿主-载体系统以表达为本发明所用的所述一或多种免疫检查点调节因子，包括原核生物例如细菌(例如大肠杆菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis))；酵母(例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(saccharomycespombe)、毕赤酵母(pichiapastoris))；昆虫细胞系统(例如sf9细胞和杆状病毒)；植物细胞系统(例如花椰菜花叶病毒camv；烟草花叶病毒tmv)和哺乳动物细胞系统(例如培养细胞)。通常地，这些载体是市售的(例如在英杰公司(invitrogen)、stratagene公司、安玛西亚公司(amershambiosciences)、普罗麦格公司(promega)等)或从保藏机构可得，例如美国模式培养物保藏所(theamericantypeculturecollection)(atcc,rockville,md.)或作为大量的出版物的主题记载它们的序列、组织和制备方法，以允许本领域技术人员应用它们。

在原核系统中使用的合适的载体包括但不限于pbr322(gibcobrl)、puc(gibcobrl)、pbluescript(stratagene)、ppoly(latheetal.,1987,gene57:193-201)、ptrc(amannetal.,1988,gene69:301-15)；petlid(studieretal.,1990,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185:60-89)；pin(inouyeetal.,1985,nucleicacidsres.13:3101-9；vanheekeetal.,1989,j.biol.chem.264:5503-9)；和pgex载体，其中所述核苷酸分子能够与谷胱甘肽s-转移酶(gst)(amershambiosciences产品)融合表达。

在酵母中表达的合适的载体(例如酿酒酵母(s.cerevisiae))包括但不限于butarepyepsec1(baldarietal.,1987,emboj.6:229-34)、pmfa(kujanetal.,1982,cell30:933-43)、pjry88(schultzetal.,1987,gene54:113-23)、pyes2(invitrogencorporation)和ptef-mf(dualsystemsbiotech产品)。

在哺乳动物宿主细胞中表达的合适的载体包括但不限于prep4、pcep4(invitrogene)、pci(promega)、pcdm8(seed,1987,nature329:840)和pmt2pc(kaufmanetal.,1987,emboj.6:187-95)、pvax和pgwiz(genetherapysysteminc；himoudietal.,2002,j.virol.76:12735-46)。

来自多种不同病毒的基于病毒的表达系统也可被用在本发明的情况下(例如杆状病毒(baculovirus)、逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(aav)、痘病毒(poxvirus)、麻疹病毒(measlesvirus)等诸如此类)。如本文中所使用的术语"病毒载体"包含载体dna以及其产生的病毒颗粒。病毒载体优选复制缺陷或复制受损的。

而且，在本发明情况下使用的表达载体可能还包含一个或多个使能够维护、传播或表达编码宿主细胞中的所述免疫检查点调节因子的核苷酸序列的额外元件。这些额外元件包括但不限于为了促进识别和从重组宿主细胞中分离的标记基因(例如通过与营养缺陷型细胞互补或通过抗生素抗性)、稳定元件(例如如在summersandsherrat,1984,cell36:1097-103中描述的cer序列和u.s.5,198,343中描述的dap系统)以及结合元件(例如ltr病毒序列和转座子)。

在原核宿主细胞表达的合适的标记基因包括四环素和氨苄青霉素抗性基因。并且，抗性基因可以被用在哺乳动物宿主细胞中表达，例如二氢叶酸还原酶(dhfr)，其赋予氨甲嘌呤抗性(wigleretal.,1980,proc.natl.acad.sci.usa77:3567；o'hareetal.,1981,proc.natl.acad.sci.usa78:1527)；gpt赋予霉酚酸抗性(mulliganandberg,1981,proc.natl.acad.sci.usa78:2072)；neo赋予氨基糖苷抗生素g418(aminoglycosideg-418)抗性(colberre-garapinetal.,1981,j.mol.biol.150:1)；zeo赋予抗zeomycin抗性；kana赋予卡那霉素以及hygro赋予潮霉素抗性(santerreetal.,1984,gene30:147)。ura3和leu2基因可用在酵母系统中表达，其提供ura3或leu2酵母突变的互补。

表达载体可以，合适地与一或多个成分组合，以提高转染效率和/或载体的稳定性。这些成分在文献中大量记载。帮助向宿主细胞中引入载体的转染试剂的典型实例包括但不限于聚阳离子聚合物(polycationicpolymers)(例如壳聚糖(chitosan)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)、聚醚酰亚胺(pei)等),阳离子脂质体(cationiclipids)(例如dc-chol/dope、现promega出售的transfectamlipofectin)和脂质体(liposomes)。

dna重组技术也能被用于提高核苷酸分子在宿主细胞中的表达，例如通过使用高拷贝数载体，取代或修饰一个或多个转录调控序列(例如启动子、增强子和诸如此类)，优化在宿主细胞中的密码子选择，并且抑制可能使转录物不稳定的负序列(negativesequences)。

优选地，编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子是以适合在其宿主细胞中表达的形式存在的，这意味着所述核苷酸分子处在一个或多个调节序列的控制之下，适合载体、宿主细胞和/或合意的在与所述治疗性基因有关的描述中的表达水平。

适合在大肠杆菌(e.coli)宿主细胞中表达的启动子包括但不限于λ噬菌体pl启动子、lac、trp和iptg-inducibleptac启动子。适合在酵母中表达的启动子包括tef(mumbergetal.,1995,gene156:119-22)、pgk(hitzemanetal.,1983,science219:620-5)、mfalpha(inokuchietal.,1987,mol.cell.biol.7:3185-93)、cyc-1(guarenteetal,1981,proc.natl.acad.sci.usa78:2199)、gal-1、gal4、gal10、pho5、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)(gaporgapdh)和乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase)(adh)(denisetal.,1983,j.biol.chem.25:1165)启动子。被外源化合物调控的可诱导的真核启动子也可以使用，包括但不限于锌诱导金属硫蛋白(mt)启动子(mcivoretal.,1987,mol.cellbiol.7:838-48)、地塞米松诱导(dexamethasone(dex)-inducible)小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、蜕皮激素昆虫启动子(noetal.,1996,proc.natl.acad.sci.usa93:3346-51)、四环素可抑制的启动子(gossenetal.,1992,proc.natl.acad.sci.usa89:5547-51)、四环素诱导启动子(kimetal.,1995,j.virol.69:2565-73)、ru486诱导启动子(wangetal.,1997,nat.biotech.15:239-43)以及雷帕霉素诱导启动子(magarietal.,1997,j.clin.invest.100:2865-72)。最后，为表达所述治疗性基因而描述的启动子也尤其适用于表达一或多种免疫检查点调节因子，特别是在哺乳动物细胞中。

根据本发明，免疫检查点调节因子可以被修饰。多种修饰可被预期，例如那些修饰氨基酸序列和那些针对增加其生物半衰期、其亲和力或其稳定性的修饰。

例如，为促进免疫检查点调节因子在细胞培养中的分泌可能加入信号肽。所述信号肽通常被插入到蛋白质的n-末端，紧接在met启动子之后。信号肽的选择很广并且本领域技术人员容易获得。

作为一个额外的实施例，标签蛋白(通常是能够被可获得的抗血清或组合物识别的短肽序列)也可以被加入以方便重组免疫检查点调节的提纯。多种标签蛋白可被用在本发明的情况下，包括但不限于pk标签、flag八肽、myc标签、his标签(通常是4到10个组氨酸残基的延伸)和e-标签(us6,686,152)。所述标签多肽可能被单独放置在蛋白质的n-末端或二者择一地放置在c-末端或放置在中间或当引入多个标签时，在任何这些位置。标签多肽可能通过使用抗标签抗体的免疫检测实验进行检测。

作为另外的实例，免疫检查点调节因子的糖基化可以被修饰以增加它对靶的亲和力。这样的秀死可以通过突变一个或多个糖基化位点上的残基来实现。可选地，糖基化的类型可能被修改，例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达。为说明目的，非糖基化的蛋白质可能在大肠杆菌(e.coli)中表达，然而碳水化合物中缺少海藻糖的调节因子可以在其它细胞中制备，例如那些在us2004-0110704(缺少α(1,6)岩藻糖转移酶活性)中描述的。这种改造过的糖基化模式被描述为增强抗体的adcc活性。

另一种修饰为聚乙二醇化，例如增加抗体的生物半衰期。聚乙二醇化的方法在本领域已知(例如ep154316；ep401384；wo98/15293，wo01/23001等)。

在本发明的情况下可能追求另一个方法，将免疫检查点调节因子偶联外部因子例如辐射敏化剂、细胞毒素剂和/或标记剂。偶联可能是共价的或非共价的。如本文中所使用的，术语"辐射敏化剂"表示对使细胞对放射治疗更敏感的分子。辐射敏化剂包含但不限于甲硝唑(metronidazole)、米索硝唑(misonidazole)、去甲基醚醇硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、丝裂霉素c(mitomycinc)、rsu1069、sr4233、e09、rb6145、烟酰胺(nicotinamide)、5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine)(budr)、5-碘-2-脱氧尿苷(5-iododeoxyuhdine)(iudr)、5-溴去氧胞苷(bromodeoxycytidine)、氟脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine)(fudr)、羟基脲(hydroxyurea)和顺铂(cisplatin)。

如本文中所使用的，术语“细胞毒性剂”表示对细胞有直接毒性阻止它们增殖或生长的化合物，例如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)。如本文中所使用的，“标记剂”表示可检测的化合物。所述标签剂可能本身是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)或就酶标记而言可能催化可检测的基质组合物的化学变化。

重组生产免疫检查点调节因子的方法在本领域中常见。典型地，这些方法包含(a)将本文描述的表达载体引入合适的生产细胞中制备转染或感染的生产细胞，(b)在适于其生长的条件下体外培养所述转染或感染的生产细胞，(c)从细胞培养物中回收免疫检查点调节因子，以及(d)任选地，纯化回收的免疫检查点调节因子。在本发明的情况下，生产细胞包括原核细胞、低等真核细胞例如酵母，和其他真核细胞例如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人和非人)细胞。优选为大肠杆菌细胞包括但不限于大肠杆菌bl21(amershambiosciences)。优选的酵母生产细胞包含但不限于酿酒酵母(s.cerevisiae)、裂殖酵母(s.pombe)、毕赤酵母(pichiapastoris)。优选的哺乳动物生产细胞包括但不限于bhk-21(仓鼠婴儿肾脏)、cv-1(非洲猴肾脏细胞系)、cos(例如cos-7)细胞、中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary)(cho)细胞、小鼠nih/3t3细胞、小鼠nso骨髓瘤细胞、海拉细胞(helacells)、韦罗细胞(verocells)、hek293细胞和perc.6细胞以及相应的杂交瘤细胞。

所述生产细胞能够在发酵生物反应器、烧瓶和培养皿内培养。培养可以在适合给定宿主细胞的温度、ph以及氧含量条件下进行。在此不再尝试赘述已知的在原核和真核细胞中生产蛋白质的多种方法。免疫检查点调节因子的生产可以是周质的、细胞内的或优选分泌到生产细胞外的(例如在培养基中)。

如果必须，特别是当免疫检查点调节因子不分泌到生产细胞外时或没有完全分泌时，其可以通过常规的细胞裂解回收，包括冻融、声波裂解法、机械裂解、使用裂解剂等。如果分泌，则可从培养基中回收。

所述免疫检查点调节因子然后可以用周知的提纯方法被提纯，包括硫酸铵沉淀、酸萃取、凝胶电泳、过滤和层析法(例如反向层析、体积排阻、离子交换、亲和、磷酸纤维素、疏水反应或羟基磷灰石等层析法)。提纯特定蛋白质所使用的条件和技术取决于例如净电荷、分子重量、疏水性、亲水性和本领域技术人员显见的因素。此外，纯化水平取决于使用目的。也可以理解的是，取决于生产细胞，免疫检查点调节因子蛋白可具有多种糖基化的形式或如本文所述的可能是非糖基化的(例如当在细菌中生产时)。

优选地，本发明使用的免疫检查点调节因子至少部分提纯，就实质上不含其他具有不同抗原特异性的抗体和/或其他细胞物质而言。进一步地，可根据本领域使用的常规条件合成免疫检查点调节因子(例如wo2009/073569)。

本发明的另一方面是本文描述的关于编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子的用途。例如，免疫检查点调节因子可通过表达一或多种免疫检查点调节因子的载体形式递送至对象中。任何本文描述的载体均可被使用。

组合治疗

溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子可在单个组合物中一同施用或在不同组合物中同时施用，任选地包含除有效治疗剂量的这些活性剂之外药学上可接受的媒介。单个组合物包含溶瘤病毒和所述一或多种免疫检查点调节因子混合的情况(例如溶瘤病毒和一或多种抗体的混合物或溶瘤病毒和一或多种为表达一或多种抗体的载体的混合物)。溶瘤病毒和所述一或多种免疫检查点调节因子的不同组合物可在同一时间或先后施用，各一次或多次(分别或通过穿插的方式)并且通过相同或不同的路径施用。

“有效治疗剂量”相当于本发明的组合或组合物中包含的每个活性剂的剂量(溶瘤病毒和其一或多种免疫检查点调节因子)，其足够产生一或多个有益效果。此有效治疗剂量可作为不同变量特别是施用方式、疾病状态、对象的年龄体重、对象对治疗的应答能力、并行治疗的种类、治疗频率和/或治疗或预防的需要的函数而变化。当涉及预防疾病的用途，组合物以足够能够预防或拖延病理情况(例如增生性疾病例如癌症)的发生和/或确立和/或复发的剂量在特别是在有得病风险的对象体内施用。为“治疗”用途，病毒和免疫检查点调节因子的组合物在被确诊患有病理装态(例如增生性疾病例如癌症)的对象中施用，目的是为了治疗疾病，最终与一或多种传统治疗方式联用。尤其有效治疗剂量可能是与不进行治疗的基状态或预期状态相比造成可见的临床状态改善的剂量，例如肿瘤数目的降低、肿瘤大小的降低、转移的数目或范围的降低、缓解期的延长、疾病状态的稳定(即没有恶化)、疾病的发展或严重程度的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和、生存期延长、对常规治疗的更好应答、生活质量的提高、死亡率降低等。有效治疗剂量还可能是造成有效非特异性(先天的)和/或特异性抗肿瘤应答的发展的必须剂量。典型地，在特定t细胞应答中的免疫应答的发展可在体外、在合适的动物模型内或使用从对象中收集的生物样品进行评估。例如，在实验室中通常使用的技术手段(例如流式细胞术、组织学)可能被用来监控肿瘤。人们可能还会使用多种既有的抗体以辨认不同的涉及抗肿瘤应答的存在于受治对象中的免疫细胞群，例如细胞毒性t细胞、活化的细胞毒性t细胞、自然杀伤细胞和活化的自然杀伤细胞。临床状态的改善能容易地通过任何医生或其他医疗保健技术人员使用的相关临床测量手段进行评估。

术语“药学可接受的媒介物”意图包含任何和所有载体、溶剂、稀释剂、赋型剂、佐剂、分散介质、包被、抗菌剂和抗真菌剂、吸收剂等在哺乳动物和特别是人类对象中与施用兼容的此类物质。

每种溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子或二者的组合可被放置于适合人类或动物使用的溶剂或稀释剂中。所述溶剂或稀释剂优选为等渗的、低渗的或弱低渗的并且具有相对低的离子强度。典型示例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、林格液(ringer’ssolution)、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、hank’s液和其他水性生理平衡盐溶液(例如remington最新一期:thescienceandpracticeofpharmacy,a.gennaro,lippincott,williams&wilkins)。

在另一个实施方式中，每种溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子组合物为人类使用做适当缓冲。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如pbs)、碳酸氢盐缓冲液和/或能够保持生理上或微偏碱性的ph(例如从大约ph7到大约ph9)的tris缓冲液。

每种溶瘤病毒和/或免疫检查点调节因子组合物可能还包含其他药学可接受的赋型剂以提供合意的药物或药效的性能、包含例如同渗容摩、黏度、透明度、颜色、灭菌度、稳定性、配方溶解速率、改变或保持在人或动物对象中的释放或吸收、促进穿越血液屏障的运输或促进在特定器官的渗透力。

每种溶瘤病毒和免疫检查点调节因子组合物还可包含一个或多个能够刺激免疫的佐剂(尤其是t细胞介导的免疫)或促进在施用后感染肿瘤细胞，例如通过toll样受体(tlr)例如tlr-7、tlr-8和tlr-9，包括但不限于明矾、矿物油乳胶例如，弗氏完全佐剂和不完全佐剂(freundscompleteandincomplete)(ifa)、脂多糖(lipopolysaccharide)或其衍生物(ribietal.,1986,immunologyandimmunopharmacologyofbacterialendotoxins,plenumpubl.corp.,ny,p407-419)、皂苷(saponins)例如qs21(suminoetal.,1998,j.virol.72:4931；wo98/56415)、咪唑-喹啉化合物(imidazo-quinolinecompounds)例如咪喹莫特(imiquimod)(suader,2000,j.amacaddermatol.43:s6)、s-27609(smorlesi,2005,genether.12:1324)和相关化合物例如在wo2007/147529中描述的,cpg寡聚脱氧核苷酸(cytosinephosphateguanosineoligodeoxynucleotides)例如cpg(chuetal.,1997,j.exp.med.186:1623；triteletal.,2003,j.immunol.171:2358)以及阳离子肽(cationicpeptides)例如ic-31(kritschetal.,2005,j.chromatogranal.technol.biomed.lifesci.822:263-70)。

在一个实施方式中，本发明组合物中包含的溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子可能为提高其稳定性特别是在生产条件下和长期(即至少6个月，优选至少2年)冰冻(例如-70℃、-20℃)储存、冷藏储存(例如4℃)、室温环境储存的稳定性而制备。多种本领域既有的病毒制剂或为冰冻的液体形式或为冻干的形式(例如wo98/02522、wo01/66137、wo03/053463、wo2007/056847和wo2008/114021等)。固体(例如干粉或冻干)组合物能通过涉及真空干燥和冻干的步骤获得。为说明目的，无菌组氨酸、醋酸柠檬酸盐或磷酸盐缓冲含有表面活性剂的盐溶液例如聚山梨酸醇酯八十(polysorbate80)和稳定剂例如蔗糖或者甘露醇适于保存重组抗体，加入nacl和/或糖的缓冲制剂特别适于保存病毒(例如tris10mmph8加入蔗糖5％(w/v)、谷氨酸钠10mm和nacl50mm，或磷酸盐缓冲的盐溶液加入甘油(10％)和nacl)。

在特定实施例中，免疫检查点调节因子为保证在生物体内正常分布或延时释放而制备。例如它可在脂质体中被制备。可使用生物可降解的、生物相容性的高分子，例如乙稀醋酸乙烯酯(ethylenevinylacetate,polyanhydrides)，聚乙醇酸(polyglycolicacid)、胶原蛋白(collagen)、聚正酯(polyorthoesters)和聚乳酸(polylacticacid)。很多制备此制剂的方法被描述，例如j.r.robinson在“sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems”,ed.,marceldekker,inc.,newyork,1978中。

溶瘤病毒和免疫检查点调节因子的合适剂量可根据多种参数进行改变并且从业者可根据相关情况日常确定。免疫检查点调节因子的合适剂量约为0.01mg/kg到约50mg/kg，理想约为0.1mg/kg到约30mg/kg，更理想为0.5mg/kg到约25mg/kg,优选为约1mg/kg到约20mg/kg，更优选为约2mg/kg到约15mg/kg，当全身使用时特别优选剂量为约3mg/kg到约10mg/kg(例如3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)。然而，降低10-100的系数的剂量可能被考虑做免疫检查点调节因子的瘤内注射。溶瘤病毒的合适剂量为从约105到约1013vp(病毒颗粒)，感染性单位(iu)或空斑形成单位(pfu)取决于使用的病毒和定量技术。作为通用指导，痘苗病毒的剂量约10⁵到约10¹³pfu是合适的，优选从约10⁶pfu到约10¹¹pfu，更优选从约10⁷pfu到约5x10⁹pfu；特别优选剂量为从约10⁸pfu到约10⁹pfu(例如剂量为10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸、9x10⁸或10⁹pfu)，特别为人类使用时。同理，降低10-100的系数的剂量可能被考虑做溶瘤病毒的瘤内注射。10⁶到5x10¹²vp的单个剂量特别适合溶瘤腺病毒，优选10⁷到10¹²vp，更优选10⁸到5x10¹¹vp。病毒在样品中存在的数量可能通过常规滴定手段确定，例如使用受纳细胞并感染受纳细胞之后数空斑的数量(例如bhk-21或cef)、免疫染色(例如使用抗病毒抗体；carolletal.,1997,virology238:198-211)、测量a260吸光度(vp效价)或定量荧光免疫检测法(iu效价)。

施用

溶瘤病毒和/或免疫检查点调节因子可向对象中一同或分开单一剂量或多剂量施用。可通过相同的或不同的路径进行施用，并且可在同一部位或不同部位施用。

为施用本发明的组合物中包含的每个活性剂，任何常规的施用路径都可在本发明的情况下使用，包括非肠道的、局部的或粘膜路径。非肠道途径为注射或输液施用，包含全身以及局部路径。通常非肠道注射类型是静脉内的(进入静脉)、动脉内的(进入动脉)、皮肤内的(进入真皮层)、皮下的(表皮以下)、肌肉的(进入肌肉)以及瘤内的(进入肿瘤或极为贴近肿瘤的部位)。典型的输液是通过静脉途径。粘膜施用包含但不限于口/食道、鼻内、气管、肺内、阴道内、或直肠内的途径。局部施用也可通过透皮肤的手段完成(例如贴片等依此类推)。可使用常规的注射器和针头来施用(例如quadrafuse注射针)或任何现有技术中已有的能够促进或提高在对象内提送活性剂的化合物或装置。优选的施用免疫检查点调节因子的路径包括静脉内的(例如静脉注射或输入)、瘤内的和腹膜内的路径。皮肤贴片也可被设想。优选的施用溶瘤病毒的路径包括静脉内的和瘤内的路径。局部瘤内接种溶瘤病毒可有利地与局部瘤内注射免疫检查点调节因子相组合，同时或不同时的优化远转移性肿瘤或肿瘤病灶的远位效果。这可以降低每个产品的有效剂量并也能减少有害的副作用。

在一个优选的实施方式中，溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子能分开施用，例如溶瘤病毒先施用，免疫检查点调节因子后施用，或反之亦可(免疫检查点调节因子先施用，溶瘤病毒后施用)。如果多于一的免疫检查点调节因子被使用(例如抗-pd-1和抗-ctla-4抗体)，他们可能被同时或相继施用，在这种情况下每种施用的抗体的剂量落入本文表明的范围中。此外，如果多余一剂量的组合治疗被相继施用，相继施用的顺序可以颠倒或每次施用都保持同样的顺序。此外，相继施用可与同时施用相组合。也可在休息期之后继续重复周期性的相继施用。每次施用的间隔可为几小时到一年(例如24h、48h、72h、每周、每两周、每月或每年)。间隔也可为不定期的(例如在测量病人血液中单克隆抗体的水平之后)。每次施用的剂量可在上述范围内改变。

在本发明的情况下，可一次或多次施用溶瘤病毒(例如2、3、4、5、6、7或8次等)，剂量在10⁷到5x10⁹pfu的范围之内。每次病毒施用的间隔可从约1天到约8周范围内变化，有利为约2天到约6周，优选为约3天到约4周，更优选为从约1周到约3周。相组合地，以在2mg/kg到15mg/kg的范围内的剂量施用一次或多次免疫检查点调节因子(例如2、3、4、5、6、7或8次等)。每次施用免疫检查点调节因子的时间间隔能从约1天到8周的时间内变化、有利为约2天到约6周，优选为约3天到约4周，更优选为从约3天到约3周。为说明目的，优选的伊匹木单抗的施用安排为3mg/kg，静脉输注每3周总共注射4剂量。在一些实施例中，两或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体被一同施用，在这种情况下，每种抗体的剂量落入所述范围内。在一个优选的实施方式中，溶瘤病毒和免疫检查点调节因子相继施用(分别或穿插)，特别优选先病毒后免疫检查点调节因子。溶瘤病毒首次施用和免疫检查点调节因子首次施用的时间段可从约几小时(至少6小时)到几周的时间内变化。在一个优选的实施方式中，本发明的方法包含在开始免疫检查点调节因子施用之前至少1次溶瘤病毒的施用，特别优选至少2次病毒施用之后2-5次免疫检查点调节因子施用(例如在第2次病毒施用到第1次免疫检查点调节因子施用间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。另一优选治疗方案涉及10⁸或10⁹pfu的溶瘤痘苗病毒的2到5次(例如3次)静脉或瘤内施用，大约有1或2周间隔，或每2或3周穿插2-5次(例如3或4)静脉内施用3到10mg/kg的抗免疫检查点抗体。

本发明还涉及治疗增生性疾病例如癌症的方法，包含向有此需要的对象中施用溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子。特别是如本文所述的溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子的组合在治疗增生性疾病，特别是在患有癌症或有患癌风险的对象中治疗癌症的用途。

本发明还涉及抑制肿瘤细胞在生物体内生长的方法，其包含向需要其的对象施用溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子。特别是如本文所述的溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子的组合用于增加分裂细胞的细胞溶解的用途。

本发明还涉及增强对肿瘤细胞免疫应答的方法，其包含向需要其的对象施用溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子。特别是，如本文所述的溶瘤病毒和一或多种免疫检查点调节因子的组合用于增加cd8+t淋巴细胞的数目和/或功能特别是肿瘤浸润cd8+t淋巴细胞的用途。

本发明还涉及同种异系肿瘤细胞系体外感染本文所述的溶瘤病毒和本文所述的一或多种免疫检查点调节因子的组合以及体外治疗增生性疾病的方法，例如癌症其包含向需要其的对象中施用感染了溶瘤病毒的所述同种异系肿瘤细胞系，而后施用所述一或多种免疫检查点调节因子，以在所述对象中激活所述感染的同种异系肿瘤细胞系诱导的免疫。

可通过使用本发明的组合和方法治疗的增生性疾病的示例包括骨癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、食道癌、口咽癌、肺癌、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、肛门癌、前列腺癌、淋巴瘤、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、软组织瘤、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、神经胶质瘤等。本发明还用于治疗转移性癌症，特别是表达pd-l1的转移性癌症(iwaietal.,2005,int.immunol.17:133-44)。优选的可通过本发明的组合疗法治疗的癌症包括对免疫疗法典型地应答的癌症。非限定性的优选治疗的癌症示例包含黑色素瘤(例如转移性的恶性黑色素瘤)、肾癌(例如明细胞癌(clearcellcarcinoma))、前列腺癌(例如激素难以治疗的前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)和肝癌(例如肝癌)。

根据有利实施例，特别当溶瘤病毒装备有自杀基因时，根据本发明的组合疗法或方法可包含额外步骤，其中向对象施用药学可接受量的前药，优选为胞嘧啶的类似物，特别是5-fc。以实例说明，可使用50-500mg/kg/天的剂量，优选为200mg/kg/天或100mg/kg/天。在本发明的情况下，前药按照与通常操作一样的方式施用(例如口服、系统性地等)。优选地，该施用发生在施用溶瘤病毒之后，在施用病毒之后优选至少3天,更优选至少4天并且更更优选至少7天。优选口服路径。可施用单剂量的前药或在一段时间内反复施用足够使得有毒代谢物在宿主组织或细胞中生产的剂量。

本发明的组合或方法与一或多种有效抗癌治疗的物质相关。在有效抗癌治疗的药物物质中，其可与本发明的组合物联合或组合使用，可更具体描述如下：

√烷化剂，例如丝裂霉素c(mitomycinc)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、异环磷酰胺(isosfamide)、美法仑(melphalan)、六甲聚氰胺(hexamethylmelamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)或氮烯唑胺(dacarbazine)；

√抗代谢物，例如吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、2-氟脱氧胞嘧啶(2-fluorodeoxycytidine)、氨甲叶酸(methotrexate)、伊达曲沙(idatrexate)、拓优得(tomudex)或曲美沙特(trimetrexate)；

√拓扑异构酶il抑制剂，例如阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)或米托蒽醌(mitoxantrone)；

√拓扑异构酶i抑制剂，例如伊立替康(irinotecan(cpt-11)),7-乙基-10-羟基-喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin(sn-38))或拓扑替康(topotecan)；

√抗有丝分裂药，例如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)；

√铂派生物(platinumderivatives)例如铂化合物(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、顺螺铂(spiroplatinum)或卡铂(carboplatinum)；

√酪氨酸激酶活性的受体抑制剂，例如舒尼替尼(sunitinib)(pfizer)和索拉非尼(sorafenib)(bayer)；和

√抗肿瘤抗体。

本发明的组合或方法也可被用于与一或多种其他药剂联用，包括但不限于免疫调节剂，例如α、β或γ干扰素、白介素(特别是il-2、il-6、il-10或il-12)或肿瘤坏死因子；影响细胞表面受体的药剂，例如表皮生长因子受体抑制剂(特别是西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)或拉帕替尼(lapatinib))或人表皮生长因子受体-2抑制剂(特别是曲妥珠单抗(trastuzumab))；以及影响血管生成的药剂，例如血管内皮细胞生长因子抑制剂(特别是贝伐单抗(bevacizumab)或兰尼单抗(ranibizumab))。

这些有效抗癌治疗物质可与本发明的组合或方法同时地或后续地向对象中施用。

可选地或组合地，本发明的组合或方法也能与放疗联用。

本发明还提供包含试剂盒形式的本发明的组合的活性试剂的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含至少一种本文讨论的溶瘤病毒在一个容器内(例如在无菌玻璃或塑料药瓶中)，和一个或多个如本文所述的免疫检查点调节因子在另一个容器内(例如在无菌玻璃或塑料药瓶中)。优选试剂盒包含溶瘤痘苗病毒(例如tk和rr活性缺陷，装备有自杀基因的痘苗病毒)和免疫检查点调节因子，其特异性地结合ctla-4(例如抗-ctla-4抗体、例如伊匹木单抗)。另一优选试剂盒包含溶瘤痘苗病毒(例如tk和rr活性缺陷，装备有自杀基因的痘苗病毒)以及免疫检查点调节因子，其特异性结合pd-1(例如抗-pd-1抗体，例如nivolumab或lanbrolizumab)。另一优选试剂盒包含溶瘤痘苗病毒(例如tk和rr活性缺陷，装备有自杀基因的痘苗病毒)和免疫检查点调节因子，其特异性结合pd-l1(例如抗-pd-l1抗体，例如mpdl3280a或bms936559)。任选地，试剂盒能包含施用活性剂的装置。试剂盒还能包含说明书，其包括涉及试剂盒中组成成分或各部分成分以及剂型的信息。

附图简要说明

图1a、b和c说明在小鼠中在不同时间点(分别为d2、d13和d20)植入的mca205肿瘤，在第0、3天时，2次瘤内注射10⁷pfu的wrtg17137；在第6、9、12天时，3腹膜内注射250μg的抗-pd-1抗体进行治疗的生长情况。

图2说明植入了8x10⁵mca205肿瘤细胞并在第0、3天时，2次瘤内注射10⁷pfu的wrtg17137；在第6、9、12天时，3次腹膜内注射250μg的抗-pd-1抗体进行治疗的小鼠的存活率。

图3a、b和c说明在小鼠中在不同时间点(分别为d3、d8和d13)植入的mca205肿瘤，在第0、3天时，2次瘤内注射10⁷pfu的wrtg17137；在第6、9、12天时，3次腹膜内注射100μg的抗-ctla-4抗体进行治疗的生长情况。

图4说明植入了8x10⁵肿瘤细胞并在第0、3天时，2次瘤内注射wrtg17137；在第6、9、12天时，3次腹膜内注射抗-ctla-4抗体进行治疗的小鼠的存活率。

图5a和b说明植入小鼠的mca205肿瘤，在第0、3天时，2次瘤内注射wrtg17137(10⁵、10⁶或10⁷pfu)；在第6、9、12天时，3腹膜内注射250μg的抗-pd-1抗体进行治疗的生长情况。在第12和14天测量肿瘤的发展。黑色圆形点表示在小鼠中仅通过病毒治疗的肿瘤的发展；灰色方形点表示在小鼠中通过病毒和抗-pd1抗体治疗的肿瘤的发展。

图6说明植入小鼠的mca205肿瘤，在第0、3天时，2次瘤内注射10⁷pfu的wrtg17137；3腹膜内注射250μg的抗-pd-1抗体或同型对照，第一次抗体注射发生在第二次病毒注射后的第1、3、5或7天进行治疗的生长情况。随着时间的推移测量肿瘤的发展。黑色圆形点表示在小鼠中通过病毒和同型对照治疗的肿瘤的发展；灰色方形、三角形、五边形、六边形的点表示在小鼠中通过在第二次病毒注射后的1、3、5、7天加入病毒和抗-pd1抗体进行治疗的肿瘤的发展。

图7说明植入小鼠的mca205肿瘤，在第0、3天时，2次瘤内注射10⁷pfu的wrtg17137；在第6、9、12天时，3次腹膜内注射100μg的抗-ctla-4抗体或同型对照，第一次抗体注射发生在第二次病毒注射后的第1、3、5或7天进行治疗的生长情况。随着时间的推移测量肿瘤的发展。黑色圆形点表示在小鼠中通过病毒和同型对照治疗的肿瘤的发展；灰色方形、三角形、五边形、六边形的点表示在小鼠中通过在第二次病毒注射后的1、3、5、7天加入病毒和抗-ctla-4抗体进行治疗的肿瘤的发展。

实施例

本发明将免疫检查点阻断方法与溶瘤痘苗病毒载体相组合。病毒在肿瘤中的复制会导致细胞死亡、破坏肿瘤并释放肿瘤抗原。溶瘤病毒和抗-免疫检查点抑制剂的组合会解除t细胞生成的制动，导致肿瘤特异性t-细胞。免疫检查点阻断与病毒载体组合的协同效应的临床前的证据在鼠肿瘤模型中展示。这意味着使用i)鼠特异性抗-免疫检查点抗体，和ii)能高效感染鼠细胞的溶瘤痘病毒。

为这些实验挑选的溶瘤病毒(wrtg17137)是痘苗病毒(vv)wr株(westernreservestrain)，其胸苷激酶(tk^-)(j2r位点)和rr^-(i4l位点)的缺陷使得病毒在健康(非分裂中)细胞中不复制。相反，vvtk^-rr^-应该选择性地有效地在肿瘤细胞中复制。它装备有嵌合的酵母来源的基因fcu-1，用于将前药5-氟胞嘧啶(5-fc)转变为有毒的合成代谢产物5-氟二氧嘧啶(5-fu)和5-氟尿苷-5’单磷酸盐的酶(erbsetal.,2000,cancerres.,60(14):3813-22)。

两种免疫检查点调节因子，即抗-pd-1和抗-ctla4单克隆抗体，分别与wrtg17137组合进行测试。

溶瘤vv与抗-pd-1mab组合

首先选择合适的针对免疫检查点阻断鼠pd-1(mpd-1)的抗体。大鼠抗mpd-1抗体rmp1-14(bioxcell)被选择作为抗mpd-1。此抗体可以阻断mpd1和其配体间的相互作用(yamazakietal.,2005,j.immunol.175(3):1586-92)。

mpd-1抑制剂(商业的克隆rmp1-14)和溶瘤病毒wrtg17137的组合在mca205(shuandrosenberg,1985,cancerres.45(4):1657-62)鼠模型进行生物体内测试。实验了多种施用方案。

在第一设置中，c57bl/6小鼠皮下注射8x10⁵mca205肿瘤细胞。肿瘤细胞植入后的第7天，在第0、3、6天时腹膜内(ip)注射250μg抗mpd1抗体rmp1-14或其同型对比2a3。之后在第7、10天时两次瘤内(it)注射病毒wrtg17137(1x10⁷pfu)。4组13只小鼠被测试，对照组注射同型对照(在第0、3、6天注射3ip)，一组小鼠用抗-pd-1mab进行治疗(在第0、3、6天注射3ip)，一组小鼠用溶瘤病毒进行治疗(在第7、10天注射2it)第四组在2次wrtg17137的最后抗体注射(在第7、10天注射2it)的1天之后注射抗-pd-1mab(在第0、3、6天注射3ip)。肿瘤的发展和小鼠的存活率跟踪40天。

不出所料地，肿瘤在对照组中非常快速的增大，然而肿瘤的生长在其他三组中均被相同程度地延缓，不过在接受抗体和溶瘤病毒的组中可以看到轻微的改善。存活率结果为在同一条线上的在第16、23、24和26天获得的50％存活，分别为对照组、抗体组、wrtg17137-治疗组和抗体+wrtg17137-治疗组。

在第二设置中，c57bl/6小鼠如前一样皮下注射8x10⁵mca205肿瘤细胞，动物被分为4组13只小鼠，分别为接受同型对照的对照组(在第6、9、12天3ip注射)，一组小鼠接受溶瘤病毒治疗(在第0、3天2it注射1x10⁷pfuwrtg17137)，一组小鼠接受抗-pd-1mab治疗(在第6、9、12天3ip注射250μg抗mpd1抗体rmp1-14)，第四组小鼠接受抗体(每三天进行3ip注射，即在第6、9、12天时)3天之后接受病毒(在第0、3天)治疗。肿瘤的发展和存活率跟踪监测40天。

不出所料地，肿瘤在对照组中非常快速的增大，然而肿瘤的生长在其他三组中均被延缓。但是，如图1所示，在使用一种成分(mpd-1抗体或溶瘤病毒)治疗的组中肿瘤的生长被相同程度的延缓，在接受mpd-1抗体和溶瘤病毒治疗的组中延缓更为显著，特别是在第13天和第20天时。

如图2所示，在对照组中，50％存活在第16天获得。由于注射wrtg17137，观察到存活率的提高(在第22天50％存活)或由于注射mpd-1抗体，观察到存活率的提高(在第20天50％存活)。在施用抗体之后施用wrtg17137使得存活率进一步提升(在第28天50％存活)。

抗-ctla4抑制剂的组合

抗-ctla-4抗体(商业的克隆9d9)与溶瘤病毒wrtg17137的组合在mca205小鼠模型中进行体内测试。实验了多种施用方案。

在第一设置中，c57bl/6小鼠皮下注射8x10⁵肿瘤细胞(mca205)。在植入肿瘤细胞后的第7天，在第0、3、6天100μg抗ctla-4抗体9d9(bioxcell)ip注射。在第7、10天，病毒wrtg17137(1x10⁷pfu)皮下注射2次。测试4组6只小鼠，分别为接受同型对照mcp-11(在第0、3、6天3ip注射)的对照组，一组小鼠进行抗-ctla-4mab治疗(在第0、3、6天3ip注射)，一组小鼠进行溶瘤病毒治疗(在第7、10天2it注射)，第四组小鼠注射抗-ctla-4抗体(在0、3、6天3ip注射)，在最后一次抗体注射后1天进行wrtg17137注射2次(在第7、10天2it注射)。肿瘤的发展和小鼠的存活率跟踪监测35天。

不出所料地，肿瘤在对照组中非常快速的增大，然而肿瘤的生长在其他三组中均被相同程度地延缓。

在第二设置中，小鼠如前一样皮下注射8x10⁵mca肿瘤细胞。4组6只小鼠被测试，接受同型对照mcp-11(在第0、3、6天3ip注射)的对照组，一组小鼠进行溶瘤病毒治疗(在第0、3天2it注射1x10⁷pfuwrtg17137)，一组小鼠进行100μg抗-ctla-4mab9d9治疗(在第6、9、12天3ip注射)，第四组接受抗-ctla-4抗体治疗(每3天3ip注射，即在第6、9、12天)3天后进行病毒治疗(在第0、3天)。肿瘤的发展和小鼠的存活率跟踪监测35天。

不出所料地，肿瘤在对照组中非常快速的增大。肿瘤的生长在其他三组中均被延缓。但是，如图3所示，肿瘤的体积在接受一种成分(抗-ctla-4抗体或溶瘤病毒)的组中减小，在接受抗ctla4抗体和溶瘤病毒处理的组中，肿瘤发展的延缓更加明显。

如图4所示，在对照组中，在第18天获得50％存活。观察到存活率的上升由于wrtg17137的注射(在第21天50％存活)或由于抗ctla-4抗体的注射(在第20天50％存活)。在施用抗体之后施用wrtg17137的组中存活率更进一步上升(在第32天测量50％存活)。

剂量效应

进行如前的相同的实验使用不同剂量的病毒。4组6只小鼠在植入肿瘤(8x10⁵mca肿瘤细胞)后进行治疗。对照组接受制剂缓冲液替代病毒并用同型对照替代抗体。第二组中进行10⁵、10⁶或10⁷pfuwrtg17137治疗(在第0、3天2it注射)，第三组进行抗-pd-1mab治疗(在第6、9、12天3ip注射250μg抗mpd1抗体rmp1-14)。第四组接受抗体治疗(每3天3ip注射，即在第6、9、12天)3天后接受病毒(在第0、3天10⁵、10⁶或10⁷pfu)。肿瘤的发展跟踪15天。

图5表示在第一次病毒注射后的第12天和第14天，观察接受相同剂量的病毒单独治疗(黑圆点)或与抗-pd-1组合治疗(灰方点)的小鼠中的肿瘤的发展。无论向肿瘤内注射的病毒剂量是多少，与接受病毒单独治疗的小鼠相比，接受病毒+抗-pd-1组合治疗的小鼠的肿瘤的生长被延缓。

这些结果表明本发明组合物的治疗和协同的抗肿瘤活性，特别是当病毒在施用免疫检查点调节因子前首先施用时。

病毒和抗体施用之间的时间间隔变化

抗-pd1抗体的组合

6周大的雌性c57bl/6小鼠皮下(sc)右侧腹部注射8x10⁵mca205肿瘤细胞。在第0天(d0)，当肿瘤体积达到40-60mm2，该动物被随机抽取并分成11组6只。对照组接受缓冲液(在第0、3天2it注射)，一组小鼠进行溶瘤病毒治疗(在第0、3天2it注射1x10⁷pfuwrtg17137)，一组接受病毒(在第0、3天)和同型对照(在第6、9、12天3ip注射)，一组小鼠进行病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在4、7、10天3ip注射250μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在第6、9、12天3ip注射250μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在第8、11、14天3ip注射250μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在第10、13、16天3ip注射250μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在4、7、10天3ip注射100μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在第6、9、12天3ip注射100μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在第8、11、14天3ip注射100μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-pd-1mab(在第10、13、16天3ip注射100μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)的治疗。随时间跟踪肿瘤的发展和存活率。

如图6所示，与接受溶瘤病毒和同型对照治疗的小鼠相比，接受病毒和抗-pd-1(250μg/小鼠)治疗的小鼠中的肿瘤的生长被拖延。施用病毒和抗体的间隔时间越长，越能控制肿瘤的生长。对照组和病毒+抗pd-1组(d+7，即在10、13、16天3ip注射250μg抗mpd1抗体克隆rmp1-14)间的统计学差异在治疗后的第9、13天可见。相同趋势可在wrtg17137(1x10⁷pfu/小鼠)和抗-pd-1(100μg/小鼠)的组合的组中可以观察到，虽然与对照组(1x10⁷pfu/小鼠+100μg同型对照/小鼠)之间没有统计学差异。

抗-ctla-4抗体的组合

6周大的雌性c57bl/6小鼠皮下(sc)右侧腹部注射8x10⁵mca205肿瘤细胞。在第0天(d0)，当肿瘤体积达到40-60mm²，该动物被随机抽取并分成11组6只。对照组接受缓冲液(在第0、3天2it注射)，一组小鼠进行溶瘤病毒治疗(在第0、3天2it注射1x10⁷pfuwrtg17137)，一组接受病毒(在第0、3天)和同型对照(在第6、9、12天3ip注射)，一组小鼠进行病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在4、7、10天3ip注射100μg抗mctla4抗体克隆9d9)治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在第6、9、12天3ip注射100μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在第8、11、14天3ip注射100μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在第10、13、16天3ip注射100μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在4、7、10天3ip注射50μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在第6、9、12天3ip注射50μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在第8、11、14天3ip注射50μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗，一组小鼠接受病毒(在第0、3天)和抗-ctla4mab(在第10、13、16天3ip注射50μg抗mctla4抗体克隆9d9)的治疗。随时间跟踪肿瘤的发展和存活率。

如图7所示，与接受溶瘤病毒和同型对照治疗的小鼠相比，接受病毒和抗-ctla-4(100μg/小鼠)治疗的小鼠中的肿瘤的生长被拖延。考虑统计学差异，施用病毒和抗体的间隔时间越短(1、3、5天)，这三组与对照组在治疗6、9、13天后相比，越能控制肿瘤的生长。相同趋势可在进行wrtg17137(1x10⁷pfu/小鼠)和抗-ctla-4(50μg/小鼠)组合治疗的d+1、d+3和d+5组中可以观察到，虽然与对照组(1x10⁷pfu/小鼠+100μg同型对照/小鼠)之间没有统计学差异。

使用不超出常规实验，本领域技术人员会确认或能够弄清很多与本文描述的特定方法等同的方法和试剂，包括替代物、变体、新增、缺失、修改和替换。这些等同物也被认为是包含在本发明范围中的，并且被以下权利要求所覆盖。