用于组织修复的复合材料的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请是国际专利申请，基于35u.s.c.§119(e)，主张2014年8月15日提交的美国临时专利申请us62/038,030的权益，该临时专利申请名为《用于组织修复的复合材料》，且该临时申请通过引用而以其整体并入本文。
本公开关于修复损失的软组织体积、同时促进软组织再生的复合材料及方法。
背景技术：
由创伤、肿瘤切除术、或先天畸形造成的软组织缺损难以使用传统手段治疗。目前的疗法，包括组织重整或组织移植，造成给位缺损。其它疗法，如假体植入物，导致纤维化和封闭。现存的促进组织向内生长的策略也不适用于软组织缺损的治疗。目前的非细胞组成的基质导致扁平、纤维化的片状组织而非理想重建所需的柔软的三维组织。最后，虽然脂肪移植物可修复软组织缺损，但其更广泛的应用受限于易变的移植物存活率和有限的修复体积。理想的软组织修复途径将会激励软组织如体内脂肪组织的再生，随后移植该组织以促进再生。但是，脂肪组织再生长需要适当的令细胞粘附、迁移、增殖、分化、及组成新组织的基质。多数原生细胞外基质(ecm)在该修整位缺失。因此，当使用基于脂肪组织的重建来修整软组织缺损时，再创建合成基质变为基本任务，其中，该合成基质不仅立即修复所损失的组织体积，而且再次调整微环境、支持宿主细胞浸润、并激励软组织再生。
水凝胶作为用于软组织修复的纤维材料具有若干优点。但是，为了实现足够的机械性质，往往需要更高的交联密度。然而，在这些条件下，宿主组织细胞(如，脂肪祖细胞及内皮祖细胞)不能渗透及生长到该支架内。在可降解水凝胶的例子中，因为宿主组织的向内生长出现得太慢，或至少比该纤维材料的吸收慢一步，瘢痕和纤维组织的形式是典型的。
近年来，已经研发出官能化纳米纤维用作ecm模拟物，以支持各种细胞活性。fda-认可的合成性生无可降解聚-α-酯类，如聚己内酯(pcl)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)可用来通过名为电纺的过程生成纳米纤维。由于优异的生物相容性记录，从这些聚合物制备的生物可降解手术缝合线和植入物已经广泛用于临床。已经研发出用于干细胞工程应用的各种不同直径和形貌的纳米纤维。然而，这些纳米纤维并不具有宏观结构，令它们难以用作3d支架。
考虑到与这些传统方法和系统相关的各种问题，该领域仍然需要改善的解决手段来愈合软组织缺损。本公开提供用于该需求的解决手段，该解决手段克服了该领域中关注的多个问题。
技术实现要素：
本发明基于，至少部分基于，具有聚合物纤维组分的支架复合物的鉴别，其中，该聚合物纤维组分具有改善的性质(如，改善的软组织重建品质，如后文详述)。一方面，本发明提供支架复合物，包括评价共价链接至水凝胶材料的直径为约100nm至约8000nm的聚合物纤维，其中，该纤维与水凝胶材料的比，以组分质量为基准计，为约1:10至约10:1，或以浓度为基准计，该纤维与水凝胶材料的为约1至50mg/ml。
一种具体例中，该聚合物纤维包括生物相容性生物可降解聚酯。任选地，该聚合物纤维包括聚己内酯。
另一具体例中，该水凝胶材料以功能性网络存在于该复合物中。
再一具体例中，纤维与无水性水凝胶材料的比为约1:10至约10:1。
另一具体例中，该聚合物纤维包括无纺聚合物纤维。
某些具体例中，该聚合物纤维包括电纺聚己内酯纤维。任选地，该聚合物纤维包括合成性聚合物材料，该合成性聚合物材料包含聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚乳酸、及/或聚己内酯、或其组合。
一种具体例中，该复合物配制为实质上生物相容。任选地，该聚合物纤维包括生物性聚合物材料，该生物性聚合物材料包括丝、胶原、壳聚糖、及/或其组合。
一种具体例中，该水凝胶材料包括透明质酸。任选地，该水凝胶材料包括聚乙二醇、胶原、葡聚糖、弹性蛋白、藻朊酸盐、纤维蛋白、藻朊酸盐、透明质酸、聚乙烯醇、其衍生物、或其组合。
某些具体例中，该水凝胶材料包括经加工的组织细胞外基质。
一种具体例中，该经加工的组织细胞外基质源自脂肪组织。
另一具体例中，该支架复合物包括无纺聚己内酯纤维。
一种具体例中，该水凝胶材料包括实质上覆盖该聚己内酯纤维至少一部分外表面的透明质酸。
某些具体例中，该水凝胶材料结合至该聚合物纤维的外表面。
另一具体例中，该支架复合物进一步包括以足以引入聚合物纤维与水凝胶材料间结合的量存在的交联部分。
某些具体例中，该支架复合物包括存在于该支架复合物表面上或表面内的复数个孔，其中，该孔以每cm2表面至少约50孔的浓度存在，以及，至少80％的孔在该表面上的平均孔直径为至少约5微米。
再一具体例中，该支架复合物进一步包括以足以引入该聚己内酯纤维与透明质酸间结合的量存在的交联部分。
任选地，当被植入人类对象体内存在的靶标组织内时，该支架复合物促进组织生长和细胞浸润。
某些具体例中，当被植入人体组织内时，该支架复合物是实质上生物可降解的。
一种具体例中，当被植入人体组织内时，该支架复合物是实质上生物不可降解的。
另一具体例中，该支架复合物进一步包括选自细胞、小分子、核酸、及多肽的治疗剂。
另一方面，本发明提供包括本发明的支架复合物的可植入生物材料。
某些具体例中，该可植入材料是实质上非细胞组成的及/或实质上不含多肽。
一种具体例中，该可植入材料配制为用于注射给药。
另一具体例中，该可植入材料配制为用于皮下给药。
再一方面，本发明提供含有本发明的可植入材料的试剂盒。
又一方面，本发明提供用于在进行外科手术的对象体内维持组织形状的医疗装置，该装置包括本发明的支架复合物及/或可植入材料，该支架复合物或可植入生物材料的量为，当给药至该对象时，有效供给组织形状的维持。
另一方面，本发明提供制备用于组织或软骨修整的植入物的方法，该方法包括下述步骤：提供非细胞组成的三维支架，该支架包括取向为生产复数个孔的聚合物纤维，其中，该聚合物纤维的至少一部分交联至其它聚己内酯纤维；将包括水凝胶材料的组合物置于该聚合物纤维上，以形成复合物；以及，令该复合物反应或安定化，以形成安定的植入物，从而制备该植入物。
任选地，该组织包括软组织。
再一方面，本发明提供用于组织或软骨修整的植入物的方法，该方法包括下述步骤：提供非细胞组成的三维支架，该支架包括取向为生产复数个孔的聚合物纤维；将包括水凝胶材料的组合物置于该聚合物纤维上，以形成复合物；以及，令该复合物反应或安定化，以形成安定的植入物，其中，该聚合物纤维的至少一部分交联至该水凝胶材料。
某些具体例中，该三维支架包括反应性聚己内酯纤维。
再一方面，本发明提供用于组织或软骨修整的植入物的方法，该方法包括下述步骤：提供非细胞组成的三维支架，该支架包括取向为生产复数个孔的聚合物纤维；将包括水凝胶材料的组合物置于该聚合物纤维上，以形成复合物；以及，令该复合物反应或安定化，以形成安定的植入物，其中，该聚合物纤维的至少一部分交联至该水凝胶材料。
另一方面，本发明提供解决由创伤或外科手术造成的组织缺损的方法，该方法包括扩张该组织，其中，扩张该组织包括将有效量的本发明的支架复合物植入该组织内，从而扩张该组织。
另一方面，本发明提供减轻或反转由于老龄化相关的疾病、病变或病症造成的组织缺损的方法，该方法包括扩张包括该组织的组织，其中，扩张该组合包括将有效量的本发明的支架复合物植入该组织内，从而扩张该组织。
任选地，该组织缺损包括胸膜组织、肌肉组织、皮肤、或其组合。
至少一方面，本发明提供复合材料，该复合材料包括凝胶及至少一种置于该凝胶内的纳米结构。该凝胶可以是水凝胶或任何其它适当凝胶。该纳米结构可以是纳米纤维或任何其它适当的纳米结构。该纳米结构可以共价链接至该凝胶。该纳米结构可由聚己内酯(pcl)或任何其它适当材料作成。
至少另一方面，本发明提供愈合软组织缺损的方法，该方法包含将复合材料施加至软组织缺损，其中，该复合材料包括凝胶及置于该凝胶内的纳米结构。
又一方面，本发明提供制造用于愈合软组织缺损的复合材料的方法，该方法包括提供凝胶，以及将纳米纤维置于该凝胶内。
在适用或未具体否定的情况下，本文中揭示的任一具体例应视为能与任何其它一种或多种具体例合并，即使该一种或多种具体例是在本发明的不同方面中揭示的。
这些和其它具体例由下述详细说明书揭露且涵盖，或自后者明确可见。
附图说明
以实施例途径给出而非欲将本发明唯一性限制为所揭示的具体具体例的下述详细说明书，最好可联合附图进行理解。
图1a是根据本公开的一种复合材料具体例结构的例示性说明，显示置于凝胶中的纳米结构，以及，特别地，该纳米结构至该凝胶中官能团的共价连接。
图1b显示完全肿胀的图1中例示性说明的复合物的光显微镜图像。
图1c是经水合的图1中例示性说明的复合物的宏观外观图像。
图1d显示经脱水的图1中例示性说明的复合物的扫描电镜(sem)图像，表明与ecm的超微结构相似性。
图2a描述图1复合物对单独使用的ha水凝胶绘制的应力应变曲线，表明在相同交联密度下，比水凝胶改善的弹性模量。
图2b描述疲劳测试，显示图2a的复合物具体例维持与规则性水凝胶相似程度的机械完整性的鲁棒性。
图3a和3b显示在纳米纤维-ha水凝胶复合物中培养4天的asc的荧光图像(图3a)和与相衬图像的叠加(图3b)。
图3c和3d显示在规则性ha水凝胶中培养4天的asc的荧光图像(图3c)和与相衬图像的叠加(图3d)。
图4a和4b显示从球状体沿着对齐的650-nm纳米纤维迁移的对比asc的荧光图像(图4a)及与相衬图像的叠加(图4b)。
图5a是显示在鼠鼠蹊部脂肪垫下原位的纳米纤维-水凝胶复合物外观的照片。
图5b显示植入2周后收获的复合物周围组织切片的h&e染色图像。
图5c显示4周时从复合物-组织界面收集的组织切片的h&e染色图像，显示细胞浸润。
图6a描述聚己内酯(pcl)纤维-ha水凝胶复合物的合成式。
图6b描述在pcl纤维与ha链网之间具有界面结合的复合物结构的例示性示意图。
图6c描述显示新鲜制备的具有相同维度的筒状纤维-ha水凝胶复合物(左)和ha水凝胶(右)的通常外观的光学图像(比例尺＝5mm)。
图6d描述同一组样品在冻干并再水化之后的光学图像。
图6e描述ha水凝胶的横截面的sem图像(比例尺＝40μm)。
图6f描述pcl纤维-ha水凝胶复合物的横截面的sem图像(比例尺＝100μm)。
图6g描述去细胞化的原生脂肪组织的横截面的sem图像(比例尺＝10μm)。
图7a描述纤维直径和界面结合对ha水凝胶的增强压缩模量的效果。基于4.5mg/ml的ha制备ha水凝胶和复合物。在50％应变下测量应力值。*p<0.05(学生-t测试(student-ttest))。
图7b描述纤维直径和界面结合对peg水凝胶的增强压缩模量的效果。基于30mg/ml的pegsh和20mg/ml的pegda制备peg水凝胶，且使用1.0-μmpcl纤维来合成该纤维-peg水凝胶复合物。在50％应变下测量应力值。*p<0.05(学生-t测试)。
图8a描述界面结合密度和纤维直径对ha水凝胶的增强剪切储存模量的效果。*p<0.05(学生-t测试)。
图8b描述界面结合密度和纤维直径对peg水凝胶的增强剪切储存模量的效果。在1-hz频率下测量剪切储存模量的值。*p<0.05(学生-t测试)。
图8c描述界面结合密度和纤维直径对ha水凝胶的增强剪切储存模量的效果。在1-hz频率下测量剪切储存模量的值。*p<0.05(学生-t测试)。
图8d描述界面结合密度和纤维直径对ha水凝胶的增强剪切储存模量的效果。在1-hz频率下测量剪切储存模量的值。*p<0.05(学生-t测试)。
图9a描述纤维载荷量对ha水凝胶的剪切储存模量的效果。使用10mg/ml的ha合成该ha水凝胶和复合物。在1-hz频率下测量剪切储存模量。蓝箭头表明用于sh基团与(da+mal)基团的摩尔比为1至2的两种复合物的条件。*p<0.05(学生-t测试)。
图9b描述纤维载荷量对ha水凝胶的剪切储存模量的效果。使用4.5mg/ml的ha合成该ha水凝胶和复合物。在1-hz频率下测量剪切储存模量。蓝箭头表明用于sh基团与(da+mal)基团的摩尔比为1至2的两种复合物的条件。*p<0.05(学生-t测试)。
图10a描述不同频率下该纤维-ha水凝胶复合物的机械强度。对照剪切载荷的不同频率，测量该ha水凝胶和复合物的剪切储存模量。
图10b描述不同再水化下该纤维-ha水凝胶复合物的机械强度。比较该复合物再水化之前和之后的压缩应力(应变＝40％)。
图10c描述不同循环载荷下该纤维-ha水凝胶复合物的机械强度。对照循环载荷，测量ha水凝胶和相应复合物的压缩模量(应变＝25％)。
图11a说明，第27天，人脂肪源干细胞(hasc)在ha水凝胶中的迁移能力。选择展现约1.9kpa的类似压缩模量的ha水凝胶对照和两种复合物。分别使用alexa
图11b说明，第27天，人脂肪源干细胞(hasc)在纳米纤维-ha水凝胶中的迁移能力。选择展现约1.9kpa的类似压缩模量的ha水凝胶对照和两种复合物。分别使用alexa
图11c说明，第27天，人脂肪源干细胞(hasc)在rgd-纳米纤维-ha水凝胶中的迁移能力。选择展现约1.9kpa的类似压缩模量的ha水凝胶对照和两种复合物。分别使用alexa
图11d说明，第27天，人脂肪源干细胞(hasc)在rgd-纳米纤维-ha水凝胶中的迁移能力。选择展现约1.9kpa的类似压缩模量的ha水凝胶对照和两种复合物。(d)和(e)中的黄箭头表明粘合到纤维或纤维簇上的细胞。分别使用alexa
图11e说明，第27天，人脂肪源干细胞(hasc)在纳米纤维-ha水凝胶中的迁移能力。选择展现约1.9kpa的类似压缩模量的ha水凝胶对照和两种复合物。(d)和(e)中的黄箭头表明粘合到纤维或纤维簇上的细胞。分别使用alexa
图11f描述人脂肪源干细胞(hasc)的迁移能力。显示hasc球状体在pcl纤维与ha链网间界面结合的复合物结构中的例示性示意图。
图12a描述由植入的纤维-ha水凝胶复合物及ha水凝胶介导的30天内组织再生。显示该复合物在植入鼠蹊部脂肪垫下之前(插图)和之后的宏观图像(比例尺＝2mm)。白星表明所植入的基质。
图12b描述由植入的纤维-ha水凝胶复合物及ha水凝胶介导的30天内组织再生。显示该ha水凝胶在植入鼠蹊部脂肪垫下之前(插图)和之后的宏观图像(比例尺＝2mm)。白星表明所植入的基质。
图12c描述由植入的纤维-ha水凝胶复合物及ha水凝胶介导的30天内组织再生。显示(i)原生脂肪组织、(ii)sham术后愈合的组织、(iii、v)该纤维-ha水凝胶植入组织、及(iv、vi)该ha水凝胶在植入后第14天和第30天的h&e和masson’s三色染色图像。这些图像中，h＝ha水凝胶，c＝纤维-ha水凝胶复合物，b＝棕色脂肪组织，黄箭头＝血管。比例尺＝200μm。
图12d描述由植入的纤维-ha水凝胶复合物及ha水凝胶介导的30天内组织再生。显示(i)原生脂肪组织、(ii)sham术后愈合的组织、(iii、v)该纤维-ha水凝胶植入组织、及(iv、vi)该ha水凝胶在植入后第14天和第30天的h&e和masson’s三色染色图像。这些图像中，h＝ha水凝胶，c＝纤维-ha水凝胶复合物，b＝棕色脂肪组织，黄箭头＝血管。比例尺＝200μm。来自masson’s三色染色的蓝色表明所检查组织中的总胶原。这些图像中，h＝ha水凝胶，c＝纤维-ha水凝胶复合物，b＝棕色脂肪组织，黄箭头＝血管。比例尺＝200μm。
图13a描述制备具有经paa-接枝方法进行表面改性的具有mal的纤维的示意图。
图13b描述，使用3和10％(v/v)的丙烯酸进行paa-接枝后，纤维上羧基的平均密度(*p<0.05，n＝6)。
图14描述使用4.5mg/mlha-sh制备的具有各种sh与da摩尔比的ha水凝胶的剪切储存模量。
图15a描述从各种量的纤维制备的纤维-ha水凝胶复合物的剪切储存模量。纤维的平均直径为686nm，纤维上mal表面密度为100nmol/mg，且使用4.5mg/ml的ha-sh和5mg/ml的pegda制备该复合物。蓝箭头表明sh基团与(da+mal)基团的摩尔比为1至2。*p<0.05(n＝3)。
图15b描述具有各种纤维载荷量的纤维-peg水凝胶复合物的剪切储存模量。*p<0.05(n＝3)。
图16描述，基于ha水凝胶和纳米纤维-ha水凝胶复合物横截面的sem图像，评估其平均孔尺寸(*p<0.05)。
图17a描述，第14天，通过该纤维-ha水凝胶复合物的细胞浸润及组织向内生长。以h&e染色所切片组织内的总胶原(蓝)。标记：c＝纤维-ha水凝胶复合物，黄箭头＝血管。比例尺＝50μm。
图17b描述，第14天，通过该纤维-ha水凝胶复合物的细胞浸润及组织向内生长。以masson’s三色染色所切片组织内的总胶原(蓝)。标记：c＝纤维-ha水凝胶复合物，黄箭头＝血管。比例尺＝50μm。
图17c描述，第30天，通过该纤维-ha水凝胶复合物的细胞浸润及组织向内生长。以h&e色染色所切片组织内的总胶原(蓝)。标记：c＝纤维-ha水凝胶复合物，黄箭头＝血管。比例尺＝50μm。
图17d描述，第30天，通过该纤维-ha水凝胶复合物的细胞浸润及组织向内生长。以masson’s三色染色所切片组织内的总胶原(蓝)。标记：c＝纤维-ha水凝胶复合物，黄箭头＝血管。比例尺＝50μm。
图18描述去细胞脂肪组织(上排)和纤维-ha水凝胶复合物(下排)的横截面的sem图像。
图19a描述，第4天，hasc在ha水凝胶(g’＝24.85μ2.92pa)中的迁移能力。使用2.5mg/ml的ha-sh和5.0mg/ml的pegda加工该ha水凝胶。比例尺＝100μm。
图19b描述，第4天，hasc在1.0-μm纤维-ha水凝胶复合物中的迁移能力(g’＝32.29μ2.16pa)。使用2.5mg/ml的ha、5.0mg/ml的pegda和10mg/ml纤维加工该复合物。比例尺＝100μm。
图19c描述，第4天，hasc在286-nm纤维-ha水凝胶复合物中的迁移能力(g’39.56μ1.26pa)。使用2.5mg/ml的ha、5.0mg/ml的pegda和10mg/ml纤维加工该复合物。比例尺＝100μm。
图20a描述注射制剂。该纤维-水凝胶复合物可配制为用于注射。
图20b描述，该可注射复合物在注射后立即安定。
图20c描述，该可注射复合物在水中保持非色散性且保持形状及体积。
图20d描述，第30天，通过该可注射纤维-ha水凝胶复合物的细胞浸润及组织向内生长，显示大量的细胞重构和脂肪细胞形成。以h&e染色所切片的组织。标记：c＝纤维-ha水凝胶复合物。
具体实施方式
本发明关于包含水凝胶及纳米结构的复合材料，该复合材料用于软组织的修复方法中。本发明还关于使用包含水凝胶及置于该水凝胶内的纳米结构的组合物来修整或重建软组织的方法。本发明在其它方面还关于加工用于软组织修复的组合物的方法，其中，该组合物包含水凝胶及置于该水凝胶内的纳米结构。
下文是本发明的详细说明书，提供给该领域技术人员以帮助他们实践本发明。该领域技术人员可对本文中揭示的具体例做出修饰和变更，而不背离本发明的精神或范畴。除非明确否定，本文中使用的全部科技术语具有本发明所属领域技术人员所一般理解的相同意义。本发明说明书中使用的术语仅用于揭示具体具体例，而非限制本发明。本文中述及的全部出版物、专利申请案、专利、图式和其它参考文献通过引用而以其整体明确地并入本文。
尽管与本文中所揭示的相似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试中，但优选现在所揭示的方法和材料。本文中述及的全部出版物通过引用而并入本文，以揭露和揭示与所引用出版物相关联的方法及/或材料。
除非定义否定，本文中使用的全部科技术语均具有本发明所属领域技术人员所一般理解的相同意义。其整体内容通过引用并入本文的下述参考文献，对技术人员提供本发明所使用的多数术语的通常定义(除非本文中定义否定)：singleton等人编纂的《微生物学与分子生物学词典(第二版)》(dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,2nded.1994)；《剑桥科技词典》(thecambridgedictionaryofscienceandtechnology,walkered.,1988)；《遗传学词汇》(theglossaryofgenetics,5thed.,r.riegeretal.(eds.),springerverlag(1991))；以及hale&marham编纂的《柯林斯生物学词典》(harpercollinsdictionaryofbiology(1991))。通常，本文中揭示的或固有的分子生物学方法的过程等是该领域使用的一般方法。可写标准技术可在参考手册如sambrook等人在2000年编纂的《分子克隆——实验室手册(第三版)》(molecularcloning--alaboratorymanual,thirdedition,coldspringharborlaboratories)；以及ausubel等人在1994年编纂的《分子生物学当前技术》(currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,new-york)中发现。
除非明确否定，下述术语具有其下方所述的意义。但应理解，该领域技术人员所已知或理解的其它意义也是可能的，且该其它意义处于本发明范畴内。本文中述及的全部出版物、专利申请案、专利和其它参考文献通过引用而以其整体并入本文。如果发生冲突，以本发明为准，包括定义。此外，该材料、方法、及实施例仅做例示性说明用而非限制。
定义
本文中，“支架复合物”包括两种组分的任何共价关联，该两种组分为：聚合物纤维及水凝胶材料。该支架复合物含有“功能性网络”的聚合物纤维和水凝胶材料，意为组分之间的相互反应造成化学、生物化学、生物物理学、物理学、或生理学益处。此外，功能性网络可包括额外组分，包括细胞、生物学材料(如，多肽、核酸、脂质、碳水化合物)、治疗性化合物、合成性分子等。某些具体例中，当植入人类对象体内存在的靶标组织内时，该支架复合物促进组织生长及细胞浸润。
本文中，术语“水凝胶”是“凝胶”的一种类型，指代水可膨胀的聚合物基质，由通过共价或非共价交联保持在一起的大分子(如，亲水聚合物、疏水聚合物、其掺混物)的三维网组成，可吸收大量的水(如，50％、60％70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％每单位非水分子)以形成弹性凝胶。该聚合物基质可使用任何适当的合成性或天然聚合物材料形成。本文中，术语“凝胶”指代固体三维网状，其跨越液体介质之体积并通过表面张力效应令其入陷。这一内部网状结构可从物理结合(物理凝胶)或化学结合(化学凝胶)、以及在该延伸流体内保持完整的晶体或其它连接获得。事实上，任何流体可用作延伸剂，包括水(水凝胶)、油、及空气(气凝胶)。以重量和体积两者计，凝胶的组合物中大部分为流体，因此凝胶展现与构建它们的液体相似的密度。水凝胶是一种使用水作为液体介质的凝胶类型。
“疏水性”和“亲水性”聚合物是基于聚合物在100％相对湿度下吸收的水蒸气的量而定义的。根据该分类法，在100％相对湿度(“rh”)，疏水性聚合物仅吸收最高1％的水，而中等亲水性聚合物吸收1至10％的水，亲水性聚合物能吸收超过10％的水，且吸湿性聚合物吸收超过20％的水。“水可膨胀”聚合物是下述聚合物：当浸没在水性介质中时，该聚合物吸收的水的量超过其自身重量的至少50％。
本文中，术语“交联的”指代含有分子间及/或分子内交联的组合物且无论该交联以共价或非共价接合方式出现，且可指向或包括交联剂。“非共价”接合包括氢键接合和静电(离子性)接合两种。
术语“聚合物”包括直链和支链聚合物结构，也涵盖交联聚合物和共聚物(可经或未经交联)，因此包括嵌段共聚物、交替共聚物、随机共聚物等。本文中指代为“寡聚物”的那些化合物为分子量低于约1000da的聚合物，优选低于约800da。聚合物和寡聚物可以是天然出现的或从合成性来源获得。
软组织修复
每一年，由肿瘤切除术、创伤、老化、或先天畸形导致的毁灭性软组织损失影响数百万人。包括皮肤、脂肪及肌肉的组织的损失，导致难以通过传统手段治疗的主要功能性和美观性干扰。作为实例，每一年美国均实施超过300,000例部分乳房切除术，导致来自乳房软组织损失的丑陋胸部伤疤。现有的用于软组织修复的可选手段具有显着弊。自体组织瓣移植需要在漫长的手术过程中从身体的另一部位移除软组织，在给位留下缺陷{lotempio2010.plasticandreconstructivesurgery,126(2),393–401；patel2012.annalsofplasticsurgery,69(2),139–144}。假体植入物易引发排异反应，导致纤维化和封闭{calobrace2014plasticandreconstructivesurgery,134(1suppl),6s–11；tsoi2014.plasticandreconstructivesurgery,133(2),234–249}。涉及置换在抽脂术过程中收获的脂肪细胞的脂肪移植，被限制为小体积且受限于极差的移植物存活率{kakagia2014surgicalinnovation,21(3),327–336；largo2014britishjournalofplasticsurgery,67(4),437–448}。最终，可使用可注射的水凝胶软组织填料，但这些仅适用于较小缺损且它们提供的体积修复是暂时的{young2011.actabiomaterialia,7(3),1040–1049；varma2014actabiomaterialia,10(12),4996–5004}。已经提出新一代组织工程解决方法，该方法的焦点在使用水凝胶支架作为模板来再生软组织，如重建位的脂肪组织。
当前使用的软组织修复的组织工程途径
脂肪源干细胞(asc)已经被鉴别为处于环绕软组织缺损的创面床内{salibian2013archivesofplasticsurgery40.6:666-675}。当得到适当的基质微环境支持时，它们可分化为软组织如脂肪。因此，使用功能性材料填充该修整位的策略，具有令使用该内源性asc再生新组织成为可能的潜力。由于水凝胶的与软组织相似的三维(3d)天性和弹性的性质，已经广泛研究它们作为支架基质用于组织缺损的再生。已经使用各种方法来生成具有与原生脂肪组织相似的模量(～2kpa)的水凝胶支架{alkhouli2013americanjournalofphysiology.endocrinologyandmetabolism,305(12),e1427–35；sommer2013actabiomaterialia9.11(2013):9036-9048}，同时对抗来自周边组织的物理学应力而维持该支架的体积和形状。这需要更高的交联密度和更小的平均孔尺寸{ryu2011biomacromolecules12.7(2011):2653-2659；khetan2013naturematerials,12(5),458–465；li2014journalofneurotrauma,31(16),1431–1438}，导致细胞浸润低且再生极差。水凝胶支架促进细胞浸润的能力是成功修复软组织的关键。血管浸润的缺乏是大体积脂肪移植和其它组织工程学尝试失败的原因。当前可获得的材料无一可填充软组织缺损中的体积损失并同时促进早期血管化及asc分化以再生软组织。
水凝胶基质
过去几年中，li和wen已经研发了与层粘连蛋白源环状肽(ccrrikvavwlc，10μm)接合的透明质酸(ha)水凝胶，该水凝胶具有优化的用于干细胞移植的孔尺寸和模量(10至100pa)。它们已经显示，这一水凝胶支持强健神经干细胞(nsc)迁移及神经突从所分化的细胞萌芽{li2014journalofneurotrauma,31(16),1431–1438}。在用于外伤性脑损伤的大鼠受控皮质伤害(cci)模型中，当在cci伤害后第3天注射时，这一水凝胶在移植后4周至6个月，促进填充该损害位的显着的脉管系统网形成(>10mm)。这一改善的血管形成归功于这一水凝胶维持并呈现组织分泌的生长因子特别是血管内皮生长因子(vegf)的能力。文献报道也透露，具有3至10个二糖单元的小ha降解片段是内皮细胞增殖、迁移、小管形成、及血管形成的强力调节子{slevin2002journalofbiologicalchemistry,277(43),41046–41059}。在近期的研究中，测试了这一ha水凝胶在cci伤害后在脑损伤位中输送人胚胎组织源nsc球状体的有效性。这一ha水凝胶在移植后在该支架基质内产生强健的血管形成。再生的血管生长入该损伤内且穿透所植入的基质，并且支持该神经元祖细胞的存活和生长。即使这些研究并非用于脂肪组织再生，但这些结果确证了这一优化的ha水凝胶组合物在促进宿主血管向内生长的独特能力。更重要的是，该水凝胶基质足够多孔，以允许在该水凝胶基质内进行强烈的细胞迁移。但是，由于周围脂肪组织的模量比植入位高了超过10倍，这一ha水凝胶的机械性质不足以高至维持植入位的整体性，因此不能直接用于软组织修复。增加交联密度以改善其模量将令其难以进行细胞浸润及迁移。需要新策略以增加该机械性质而不显着降低大块水凝胶的平均孔尺寸。提供含有经加工的组织细胞外基质及/或从后者分离的物质的水凝胶材料，该组织细胞外基质例如源自脂肪组织及/或从脂肪组织衍生的细胞外基质。
支架复合物
本文提供适用于医疗装置的支架复合物，该医疗装置被并入例如通过注射或植入给药该复合物的人类对象的组织内。该支架复合物含有聚合物纤维，通常，该聚合物纤维的平均直径为约10nm至约10,000nm，如约100nm至约8000nm，或约150nm至约5,000nm，或约100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、或8,000。如本文中提供的，可通过该领域任何已知手段测定聚合物纤维与水凝胶材料的比。例如，以组分质量为基准计，该聚合物纤维与水凝胶材料的比为约1:100至约100:1，如约1:50至约50:1，或1:10至约10:1，如1:5至约5:1，如约1:3至约3:1。聚合物纤维与水凝胶材料的比也提供为以浓度为基准计，给定重量的聚合物纤维每体积如水凝胶材料。例如，该浓度为约1至50mg/ml。水凝胶材料通常置于聚合物纤维上，如结合至该聚合物纤维的外表面(或一个外表面上，取决于组成及形状)。该支架复合物通常并非均匀固体材料。反之，支架复合物含有存在于该支架复合物上或内的复数个孔。该孔的存在、尺寸、分布、频次及其它参数可在创建该支架复合物的过程中调整。孔尺寸可从小于约1微米至最大100微米，包括1、2、3、45、10、15、20、30、40、50、6070、80、90或100微米，且其尺寸可以是窄幅的，如至少40％、如50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％的孔具有所希望的尺寸或处于所希望的尺寸范围内。
本发明的支架复合物适用于并入人类对象的组织内，因此，它们通常是“生物相容的”，意指能与生物系统(如，人体内发现的)相互反应而不在其内部及/或附近诱发病理生理学响应。一些具体例中，为了长久保持在组织内而提供支架复合物。或者，支架复合物暂时保持在人体内，并提供为实质上生物可降解。优选地，聚合物纤维含有生物相容性生物可降解聚酯。在一优选的具体例中，聚合物纤维含有聚己内酯。
如本文中提供的，该含有聚合物纤维和水凝胶的复合物的相互反应的优选形式包括交联部分，该交联部分通常以足以诱发聚合物纤维与水凝胶材料之间结合如诱发聚己内酯纤维与透明质酸之间交联的量存在。
用于软组织修复的支架设计
复合物概念已经广泛用作材料增强机制。例如，将羟磷灰石颗粒加入水凝胶内可增加其刚度{wu2008materialschemistryandphysics107.2(2008):364-369}，且使用细长颗粒时，该复合物拉伸模量增加更多{yusong2007journalofmaterialsscience,42(13),5129–5134}。由于电纺纳米纤维网片的相貌与原生ecm类似，前者已经广泛用作组织工程学基底。尤其有趣的是，脂肪组织的去细胞化ecm是天然高纤维性且多孔的(图6g){young2011.actabiomaterialia,7(3),1040–1049}。若干近期研究已经通过将片段化聚丙交酯(pla)或壳聚糖纤维引入聚乙二醇(peg)、聚丙烯酰胺、或藻朊酸盐水凝胶中而尝试概括该纤维性组分{coburn2011smartstructuresandsystems,7(3),213；#37；zhou2011colloidsandsurfacesb:biointerfaces,84(1),155–162；shin2015journalof材料schemistry}。将该片段化纤维与水凝胶前体溶液混合，在凝胶化过程中并入水凝胶内以创建3d架构。这些包埋有纤维的水凝胶已经显示比相应水凝胶改善的机械性质。但是，尚未有在体内测试宿主细胞浸润的报导。此外，这些水凝胶不可降解且需要粘合配体进行脂肪细胞粘附和分化。
纳米纤维-水凝胶复合物设计
为了实现纤维增强效果同时维持水凝胶相中的高孔隙率，提供比其它支架优异的性质的电纺纤维-水凝胶复合物。掺混纳米纤维与水凝胶基质之后，先前报导{coburn2011smartstructuresandsystems,7(3),213}且引入本文的是纤维表面与水凝胶交联网之间的界面结合(图6)。这一复合物设计不仅允许更强的来自该固体纤维组分的机械增强性，而且允许独立调整该水凝胶相的整体机械性质和平均孔尺寸/孔隙率，令优化的细胞浸润性质和结构整体性称为可能。进一步预期，可采用纤维作为用于asc和内皮祖细胞的优选的细胞粘附基底，从而作为支持细胞迁移和asc分化的引导。
创新
某些方面，关键创新为具有纳米纤维表面与水凝胶网络纸巾的界面结合的纳米纤维r-水凝胶组合物(图6a)。这一工程化的富恶化为具有彻底改善该水凝胶的机械性质而不显着降低该水凝胶相平均孔尺寸的潜力。界面结合的引用可提供比仅进行两种组分物理掺混优异的机械强化效果。该研究将制订使用电纺聚己内酯(pcl)纤维-ha水凝胶复合物可得到的与掺混物相对照的机械性质(压缩模量和剪切模量)范围。第二创先是这一纳米纤维-水凝胶复合物修复软组织缺损的示范。初步表征表明，该复合物具有与脂肪组织相同的结构特征(图6){christman,2012us20120264190a1；young2011.actabiomaterialia,7(3),1040–1049}。猜测这一复合物提供对于软组织再生很重要的结构整体性和机械性质。该研究还表明，复合物与水凝胶相比的多功能性和效率。
这一项目的成功完成将提供用于修复缺失软组织体积的现成的解决手段，特别是用于较大缺损，其中，构建血管网络、维持组织修整位整体性、促进细胞迁移和构成、以及复原宿主细胞，对于可持续性组织修复都是至关紧要的。大量关于本复合物设计中使用的材料组分即ha水凝胶和生物可降解聚酯纤维的临床应用记录，连同组织相容性的这些初始数据一起，暗示用于临床应用的优异的组织相容性和直截了当的监管审批可路径。
特征
一些具体例中，本发明提供水凝胶组分中纳米纤维与聚合物网之间的界面结合。这对于“真实”复合物的形成是重要的。这表明将这些纤维与水凝胶掺混并不提供相同程度的机械增强。也有使用纳米纤维-水凝胶掺混物的先前报导。换句话说，界面结合是这一新产品与该领域其它产品的重要分别。此外，该界面结合可包括如本手稿中显示的共价键，以及二级结合如氢键和静电荷相互作用。
这也是该领域首次说明各向同性增强的工作，该复合物在全部取向都进行强化，如替代任何形状的体积缺损所需要的。使用纳米纤维垫和少量对准细丝的设计是天然各向异性的。这一设计能形成各向同性成材料和各向异性材料。
对于指示某些方面，本文中存在的工作设计了用于形成待成为水凝胶网的复合物的组分，其中，该水凝胶网具有足够孔尺寸和孔隙率以用于细胞迁移和宿主细胞向内生长，且纳米纤维松散地包括直径为50nm至10μm范围的聚合物纤维。
凝胶/水凝胶组分
本发明的水凝胶复合物可包括任何类型的适当水凝胶组分。本发明预期包括任何适当凝胶组分的纳米结构/凝胶复合物，包括该领域已知的任何适当的水凝胶组分。该凝胶及/或水凝胶可由任何适当的合成性材料或天然材料形成。
例如，该凝胶及/或水凝胶的聚合物组分可包含纤维素酯类，如醋酸纤维素、醋丙酸纤维素(cap)、醋丁酸纤维素(cab)、丙酸纤维素(cp)、丁酸纤维素(cb)、丙丁酸纤维素(cpb)、二醋酸纤维素(cda)、三醋酸纤维素(cta)等。这些纤维素酯类揭示于us1,698,049、us1,683,347、us1,880,808、us1,880,560、us1,984,147、us2,129,052、及us3,617,201中，且可使用该领域已知技术制备或商购。可商购的适用于本文的纤维素酯类包括ca320、ca398、cab381、cab551、cab553、cap482、cap504，全部可自伊士曼化学公司(eastmanchemicalcompany,kingsport,tenn)获得。这些纤维素酯类典型具有约10,000至约75,000之间的数均分子量。
该纤维素酯类可包含纤维素与纤维素酯单体单元的混合物；例如，可商购的醋丁酸纤维素含有醋酸纤维素单体单元以及丁酸纤维素单体单元和未酯化的纤维素单元。
本发明的凝胶/水凝胶也可由其它水可膨胀聚合物如丙烯酸酯聚合物组成，通常由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、及/或其它乙烯基单体。适当的丙烯酸酯聚合物是那些可在商品名“eudragit”下从德国罗姆药厂(rohmpharma(germany))购得的共聚物，如前文所述。eudragit系列e、l、s、rl、rs和ne共聚物可作为溶解于有机溶剂中的形式、水性分散液、或干粉而获得。优选的丙烯酸酯聚合物是甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的共聚物，如eudragitl和eudragits系列聚合物。特别优选的此类共聚物是eudragitl-30d-55和eudragitl-100-55(后一种共聚物是eudragitl-30d-55的喷干形式，可使用水复原)。eudragitl-30d-55和eudragitl-100-55共聚物的分子量为大约135,000da，游离羧基与酯基的比为大约1:1。该共聚物通常不可溶于ph低于5.5的水性流体。另一特别适当的甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物是eudragits-100，它与eudragitl-30d-55的区别在于前者的游离羧基与酯基的比为大约1:2。eudragits-100在ph低于5.5的情况下不可溶，但与eudragitl-30d-55不同，在ph为5.5至7.0的水性流体中微溶。这一共聚物在ph为7.0及以上的液体中可溶。也可使用eudragitl-100，其具有界于eudragitl-30d-55与eudragits-100之间的ph依赖性溶解性，在ph低于6.0的情况下不可溶。该领域技术人员应知悉，eudragitl-30d-55、l-100-55、l-100、和s-100可替换为其它可接受的具有类似的ph依赖性溶解度特征的聚合物。
本文中揭示的任何凝胶/水凝胶组合物均可改性，以令其含有活性剂，并因此在施加至体表(如，组织修复位)时作为活性剂输送系统，而该组合物与体表是活性剂运输的关系。“载荷”活性剂释放入本发明的水凝胶组合物中牵涉经由膨胀控制机制的水的吸收和该剂的吸收。可采用含有活性剂的水凝胶组合物，例如，透皮药物输送系统、伤口敷料、外用药物制剂、植入的药物输送系统、口服剂型等形式。
可并入本发明水凝胶内并全身输送(如，使用适用于药物的全身性给药的透皮、口服、或其它剂型)的适当的活性剂包括，但不限于：兴奋剂；止痛剂；麻醉剂；抗关节炎剂；呼吸系统药物，包括镇喘剂；抗癌剂，包括抗肿瘤药物；抗胆碱能药；抗痉挛药；抗抑郁药；抗糖尿病剂；止泻剂；抗蠕虫药；抗组胺药；抗高血脂剂；抗高血压剂；抗感染剂，如抗生素和抗病毒剂；抗炎剂；抗偏头痛制剂；抗呕吐剂；抗帕金森病药物；止痒药；抗精神病药；退热药；抗痉挛药；抗结核剂；抗溃疡剂；抗病毒剂；抗焦虑药；食欲抑制剂；注意力缺失症(add)和注意力缺失性多动症(adhd)药物；心血管制剂，包括钙通道阻断剂、抗心绞痛剂、中枢神经系统(cns)剂、β-阻断剂和抗心律失常剂；中枢神经系统刺激剂；咳嗽和感冒制剂，包括减充血剂；利尿剂；基因性材料；草药；激素药物(hormonolytics)；安眠药；降血糖剂；免疫抑制剂；白三烯抑制剂；有丝分裂抑制剂；肌肉松弛剂；麻醉药品拮抗剂；尼古丁；营养剂，如维生素、必需氨基酸和脂肪酸；眼药，如抗青光眼剂；抗副交感神经药；肽药物；精神振奋药物；镇静剂；甾体，包括孕激素、雌激素、皮质类固醇、雄激素和合成代谢剂；戒烟剂；拟交感神经药；镇定剂；和血管舒张药，包括通常的冠状动脉舒张药、外周血管舒张药和脑血管舒张药。可与本发明的黏合剂组合物合用的具体活性剂包括，而不限于，新烟碱、辣椒素、硝酸异山梨酯、氨基斯的明、硝化甘油、异搏定(verapamil)、心得安、斯拉柏林(silabolin)、foridone、氯压定、金雀花碱、芬纳西泮(phenazepam)、硝苯地平、fluacizin、和柳丁氨醇。
对于外用药物给药及/或含药衬垫(如，含药物的脚垫)，举例而言，适当的活性剂包括下列：
抑菌剂和杀菌剂：适当的抑菌剂和杀菌剂包括，例如：卤素化合物，如碘、碘聚维酮络合物(即，pvp与碘的络合物，也指代为“聚维酮”并可在商品名betadine下从purduefrederick获得)、碘化物盐、氯胺、氯己定、及次氯酸钠；银及含银化合物，如磺胺嘧啶、银蛋白质乙酰单宁酸盐、硝酸银、醋酸因、乳酸银、硫酸银和氯化银；有机锡化合物，如苯甲酸三-正丁基锡；锌和锌盐；氧化剂，如过氧化氢和高锰酸钾；芳基汞化合物，如硼酸苯基汞或汞溴红；烷基汞化合物，如硫柳汞；酚类，如百里香酚、邻苯基苯酚、2-苄基-4-氯苯酚、六氯酚和己基间苯二酚；和有机氮化合物，如8-羟基喹啉、氯喹那多、氯碘羟喹、依沙吖啶、海克替啶、洗必泰、及安巴腙。
抗生素：适当的抗生素包括，但不限于，洁霉素家族抗生素(指代一类最初从林可链霉菌回收的抗生素)、四环素家族抗生素(指代一类最初从金色链霉菌回收的抗生素)、及基于硫的康生物，即磺胺类。例示性洁霉素加送抗生素包括洁霉素、克林霉素、在例如us3,475,407、us3,509,127、us3,544,551和us3,513,155中揭示的相关化合物、及其药物可接受的盐和酯。例示性四环素家族抗生素包括四环素本身、氯四环素、氧四环素、四环霉素、地美环素、氢吡四环素、甲烯土霉素、强力霉素(doxycycline)、及其药物可接受的盐和酯，特别是酸加成盐如盐酸盐。例示性基于硫的抗生素包括，但不限于，磺酰胺类、磺乙酰胺、苯酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、及其药物可接受的盐和酯，如磺乙酰胺钠。
止痛剂：适当的止痛剂是局部麻醉剂，包括但不限于，乙酰胺基丁香酚、醋酸阿法多龙、阿法沙龙、优卡因(amucaine)、阿莫拉酮、阿米卡因、丁氧普鲁卡因、杯托卡因、苯柳胺酯(biphenamine)、丁哌卡因、burethamine、布他卡因、butaben、布坦卡因(butanilicaine)、丁柳妥(buthalital)、丁氧卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、2-氯普鲁卡因、辛可卡因、cocaethylene、可卡因、环甲卡因(cyclomethycaine)、二丁卡因、二甲异喹(dimethisoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、diperadon、达克罗宁、脱水芽子碱、芽子碱、氨基苯甲酸乙酯、氯乙烷、依替卡因、乙苯二恶哌啶、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、福吗卡因、环己烯巴比妥、己基卡因(hexylcaine)、羟孕酮(hydroxydione)、羟基普鲁卡因、羟丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、氯胺酮、亮氨卡因(leucinocainemesylate)、左沙屈尔、利多卡因、马比佛卡因、美普卡因(meprylcaine)、metabutoxycaine、美索比妥、氯甲烷、咪达唑仑、卖替卡因(myrtecaine)、纳依卡因、奥塔卡因、俄妥卡因、羟乙卡因、对乙氧卡因、芬那卡因、苯环己哌啶、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇、丙玛卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮尼地、丙泮卡因(propanocaine)、丙美卡因、丙哌卡因(propipocaine)、异丙酚、丙氧卡因、假可卡因、吡咯卡因、利索卡因、水杨醇、丁卡因、硫稀比妥(thialbarbital)、thimylal、硫仲丁比妥钠(thiobutabarbital)、硫喷妥钠、托利卡因、美索卡因、佐拉敏(zolamine)、及其组合。丁卡因、利多卡因和丙胺卡因是本文中优选的止痛剂。
可使用本发明的水凝胶组合物作为药物输送系统输送的其它外用剂包括下列：抗真菌剂，如十一碳烯酸、托萘酯、咪康唑、灰黄霉素、酮康唑、环匹罗司、克霉唑和氯二甲苯酚；角质软化剂，如水杨酸、乳酸和尿素；起疱剂，如斑蝥素；抗痤疮剂，如有机过氧化物(如，过氧化苯甲酰)、类维生素a(如，视黄酸、阿达帕林、及他扎罗丁)、磺胺类(如，磺乙酰胺钠)、间苯二酚、皮质类固醇(如，去炎松)、α-羟基酸(如，乳酸和乙醇酸)、α-酮酸(如，乙醛酸)、及具体指明用于治疗痤疮的抗菌剂，包括壬二酸、克林霉素、红霉素、甲氯环素、米诺环素、那氟沙星(nadifloxacin)、头孢氨苄、去氧环素(doxycycline)、及氧氟沙星；皮肤光亮和增白剂，如氢醌、曲酸、乙醇酸及其它α-羟基酸、artocarpin、和某些有机过氧化物；用于治疗疣的药剂，包括水杨酸、咪喹莫特、二硝基氯苯、二丁基方酸、鬼臼酯、足叶草毒素、斑蝥、三氯乙酸、博来霉素、西多福韦、阿德福韦、及其类似物；以及抗炎剂，如皮质类固醇和非甾体抗炎药(nsaids)，其中，该nsaids包括酮基布洛芬、氟比洛芬、布洛芬、萘普生、非诺洛芬、苯恶洛芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、恶丙嗪、普拉洛芬、舒洛芬、阿明洛芬、butibufen、芬布芬(fenbufen)、和噻洛芬酸(tiaprofenicacid)。
对于伤口敷料，适当的活性剂是那些可用于治疗伤口的，且包括但不限于，抑菌和杀菌化合物、抗生素、止痛剂、血管舒张剂、组织愈合增强剂、氨基酸、蛋白质、蛋白水解酶、细胞因子、和多肽生长因子。
对于一些活性剂的外用和透皮给药以及在伤口敷料中，将渗透增强剂并入该水凝胶组合物中以提升该剂进入或通过皮肤的速率是必需的或是所希望的。适当的增强剂包括，例如下列：亚砜类，如二甲基亚砜(dmso)和癸基甲基亚砜；醚类，如二乙二醇单乙醚(可作为transcutol商购)和二乙二醇单甲醚；表面活性剂，如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、泊洛沙姆(231、182、184)、吐温(20、40、60、80)和卵磷脂(us4,783,450)；1-取代的氮杂环庚-2-酮类，特别是1-正十二烷基氮杂-环庚-2-酮(可在商标azone下从nelsonresearch&developmentco.,irvine,calif.购得；见us3,989,816、us4,316,893、us4,405,616和us4,557,934)；醇类，如乙醇、丙醇、辛醇、癸醇、苯甲醇等；脂肪酸类，如月桂酸、油酸和戊酸；脂肪酸酯类，如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈树异丙酯、丙酸甲酯、和油酸乙酯；多元醇类及其酯类，如丙二醇、乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇、和聚乙二醇单月桂酸酯(pegml；见us4,568,343)；酰胺类和其它含氮化合物，如尿素、二甲基乙酰胺(dma)、二甲基甲酰胺(dmf)、2-吡咯烷酮、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；萜烯类；烷酮；以及有机酸类，特别是水杨酸和水杨酸盐、柠檬酸和琥珀酸。也可使用两种或多种增强剂的混合物。
某些其它具体例中，本发明的包含凝胶(如，水凝胶组分)和纳米结构的复合组合物也可包含额外的人选添加组分。这些组分是该领域已知的且可包括，例如，填料、防腐剂、ph调节剂、软化剂、增稠剂、颜料、染料、折射颗粒、安定剂、增韧剂、减粘剂、药学剂(如，抗生素、血管生成促进剂、抗真菌剂、免疫抑制剂、抗体等)、以及渗透增强剂。这些添加剂及其用量可以令它们不显着干扰水凝胶组合物的所希望的理化性质的方式而选择。
当该黏合剂位于皮肤上或其它体表时，较佳可并入吸收剂填料以控制水合程度。此类填料可包括微晶纤维素、云母、乳糖、高岭土、甘露醇、胶体氧化硅、氧化铝、氧化锌、氧化钛、硅酸镁、硅酸镁铝、疏水性淀粉、硫酸钙、硬脂酸钙、磷酸钙、磷酸二氢钙、纺织和无纺纸、以及棉材料。其它适当的填料是惰性的，即实质上非吸附剂，且包括，例如，聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯-聚醚酰胺共聚物、聚酯和聚酯共聚物、尼龙、和嫘萦。
该组合物也可包括一种或多种防腐剂。防腐剂包括，举例而言，对氯间苯酚、苯乙醇、苯氧乙醇、氯丁醇、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、氯己定二醋酸盐或葡萄糖酸盐、及丙二醇。
该组合物也可包括ph调节化合物。可用作ph调节剂的化合物包括，但不限于，甘油缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、或柠檬酸-磷酸盐缓冲剂，可采用ph调节化合物以确保该水凝胶组合物的ph与个体的体表相匹配。
该组合物也可包括适当的软化剂。适当的软化剂包括柠檬酸酯类，如柠檬酸三乙酯或乙酰柠檬酸三乙酯；酒石酸酯类，如酒石酸二丁酯；甘油酯类，如二醋酸甘油酯和三醋酸甘油酯；邻苯二甲酸酯类，如邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二乙酯；及/或亲水性表面活性剂，优选亲水性非离子表面活性剂，如糖的部分脂肪酸酯类、聚乙二醇脂肪酸酯类、聚乙二醇脂肪醇醚类、和聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯类。
该组合物也可包括增稠剂。本文中优选的增稠剂是天然化合物或其衍生物，且包括，例如：胶原；半乳甘露聚糖；淀粉；淀粉衍生物和水解物；纤维素衍生物如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、及羟丙基甲基纤维素；胶体硅酸；以及糖类如乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖。也可使用合成增稠剂如聚乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇、及聚丙二醇。
某些具体例中，本发明的包含水凝胶和纳米结构的水凝胶组合物复合物进一步包含促进血管生成的组分。在本发明之前，用以实现临床相关软组织再生的挑战是所再生的组织优选应换以新的血管。因此，任何促进软组织再生的材料优选海英鼓励血管生成。一种用以实现这一目标的途径是通过使用含有肝素的水凝胶组分，该组分可用作生长因子结合位点以富集并保持促进血管生成和组织形成的生长因子。
多个其它具体例中，本发明的复合材料可基于作为该水凝胶材料的透明质酸(ha)。ha是非硫酸化的具有二糖重复单元的线性多糖，形成该水凝胶组分。ha也是人体组织内细胞外基质的非免疫原性的天然组分，且在没学和重建过程中广泛用作真皮填料。
通过原生透明质酸酶促进ha的分解，该酶的表达在组织损坏及发炎区域增加。重要的是，研究已经显示，具有3至10个二糖单元的ha降解小片段是内皮细胞增殖、迁移、管形成、及血管生成的潜在调节子。ha的这些生物学功能被认为是经由cd44以牵涉ras和pkc的途径介导的。使用抗-cd44抗体阻滞cd44/ha相互反应，在体外降低了人微脉管内皮细胞的增殖和迁移。ha水凝胶已经作为用于多种细胞和组织伤害模型中细胞输送的潜在基质而被探究。这些水凝胶可用作细胞的保护和支持之间，且可降低瘢痕形成。因此，据信ha通过促进细胞浸润并促进血管生成而在提升组织再生方面扮演关键角色。
首先，该材料具有三维整体性以及与原生脂肪组织类似的一致性。这使得其可直接用于损失软组织体积的修复。其次，该材料优选可与复数挠性纳米纤维共同放置，可用作用于脂肪细胞和内皮细胞祖细胞的迁移的基底。第三，该材料具有足够孔隙率，以允许这些前体细胞快速浸润并迁移至该支架内而非形成环绕该支架的纤维囊。第四，该ha水凝胶组分提供可压缩性和体积膨胀，同时也提供重要的血管生成线索。第五，该纳米纤维和水凝胶组分是生物可降解的，允许它们被所再生的软组织替换。第六，全部组分材料在众多fda许可的装置中具有高安全记录，潜在地降低临床应用的监管障碍。
本发明的凝胶/水凝胶/纳米结构复合物也可包括组织修整剂，如大量生长因子，包括表皮生长因子(edf)、pdgf、及神经生长因子(ngf's)。例如，该组合物可包括egf。当允许实验小鼠舔舐自身时，小鼠皮肤上的伤口似乎愈合更快，于此观察之后，发现了表皮生长因子(egf)。由于唾液中的一些防腐剂(如，溶菌酶)的存在，这一发现并不简单。一种具体的生长因子，现在称为egf，显示对此负责。egf与尿抑胃激素相同，且具有血管生成性质。转变生长因子-α(tgf-α)非常相似，结合至相同受体，甚至在刺激表皮细胞再生(上皮形成)中更有效。
因此，本发明的包含egf/tgf的水凝胶较佳可用于加速伤口和烧伤的愈合、减少瘢痕瘤疤痕形成(尤其用于烧伤)、皮肤移植敷料中、及慢性腿部溃疡的治疗中。
可用于本发明的组织修整剂包括大量生长因子，包括表皮生长因子(edf)、pdgf、及神经生长因子(ngf's)。通常，促生长激素将影响1至4种组织。从此类蛋白质研发的多数产品均以一种或另一种伤口修整位目标，但存在其它适应症。一些最重要的组织生长因子进一步揭示如下。
本发明的凝胶/纳米结构组合物也可包括一种或多种可用于本发明的组织修整方法和其它应用中的生长因子。
例如，本发明预期在本发明的组成物中包括pdgf。血小板源生长因子(pdgf)是用于几乎全部源自间叶细胞的细胞即血液细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、软骨细胞、和结缔组织细胞的有丝分裂原。它是糖蛋白二聚体，以aa或bb同源二聚体形式或ab异源二聚体形式存在。就多数生长因子而言，pdgf现在被认为是更大的因子家族中的成员。除了pdgf，该家族包括同源二聚体因子血管内皮生长因子(vegf)和胎盘生长因子(pigf)；vegf/pigf异源二聚体；及结缔组织生长因子(ctgf)，一种由人血管内皮细胞和纤维母细胞分泌的pdgf样因子。连同ngf、tgf-β和糖蛋白技术如人绒毛促性腺素(hcg)，pdgf现在被归类为半胱氨酸结生长因子超家族的成员。这些因子全部可与本发明的水凝胶协同使用。
pdgf是在血液凝结进程中由血小板产生并释放。它只是源自这些细胞的生长因子之一。pdgf将纤维母细胞和白血球吸引至损伤位，也刺激替换结缔组织(主要是纤维母细胞和平滑肌细胞)的生长。它刺激多种细胞包括那些生产胶原的细胞的细胞分裂，因此激励血管生成。它还刺激有丝分裂发生、血管收缩、趋药性、酶活性、和钙动员。
血小板源生长因子可用来在使用本发明组合物的某些治疗过程中修复骨骼和软组织再生长，以及用来加速急慢性伤口的愈合过程。据此，本发明的水凝胶/纳米结构组合物较佳可包含血小板源生长因子混合物。
举例而言，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可在基因治疗中用于pdgf基因的局部输送。将编码质粒dna的pdgf并入该水凝胶基质中，起源于环绕伤口的活体组织的肉芽组织纤维母细胞增殖且迁移入该基质内，扮演质粒基因转移和表达的靶标。
本发明的水凝胶/纳米结构组合物也可包括vegf以促进血管生成。血管内皮生长因子(vegf，也称为血管通透因子)是另一种血管生长因子，而且是多功能血管生成细胞因子。它通过在微管水平刺激内皮细胞的增殖，造成它们迁移并改变它们的基因表达，对血管生成(血管生长)产生间接和直接贡献。vegf也令这些内皮细胞变得高通透，造成它们将血浆蛋白释放至血管空间之外，从而造成该区域内的变化，对血管生成起作用。
本发明的组合物也可包括fgf。实际上，纤维母细胞生长因子(fgf)是至少191418kd肽的家族，属于肝素结合生长因子家族，而且可以引起所培养的纤维母细胞和血管内皮细胞的有丝分裂。它们在体内造成血管生成，且这一血管生成活性通过tnf而得以提升。fgf's可以与egf相似的方式使用。bfgf，也称为fgf-2，牵涉入控制人巨核细胞生成中，且fgf已经显示在刺激内皮细胞形成及帮助结缔组织修整中有效。
水凝胶/纳米结构组合物也可包含角质形成细胞生长因子(kgf)，也称为fgf-7，用于伤口愈合及牵涉内皮细胞毁坏的其它病变中。
转化生长因子(tgf's)具有转化多种细胞系的能力，以及，举例而言，可赋予该能力以在培养基中生长超过所限制的世代数目、在多层而非单层中生长、以及反常染色体组型的攫取。tgf家族存在只是5个成员，两个被最广泛研究的是tgf-α和tgf-β。前者是促进纤维母细胞和内皮细胞的有丝分裂、生成血管、并促进骨骼吸收。组合物也可包括tgf。tgf-β是细胞调控的通常中介物和细胞生长的强力抑制剂，并抑制多种细胞类型的增殖。tgf-β可抵消其它肽生长因子的促有丝分裂效果，也可意指多种肿瘤细胞系的生长。tgf-β也具有促有丝分裂效果，并且促进纤维母细胞中的胶原形成。本发明的水凝胶的适应症包括慢性皮肤溃疡，如糖尿病患者的神经营养性脚溃疡。其它领域包括伤口愈合、骨骼修整、及免疫抑制性疾病。
举例而言，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可用来携带适当的细胞。这些细胞可仅在将该凝胶施加至伤口或其它适当区域之前并入该凝胶，以最大化效能。适当的细胞包括自体纤维母细胞和角化细胞，它们主要对真皮和表皮形成产生响应。各自包含一种细胞类型的独立凝胶可连续施加或一起施加，或一种凝胶可包含两种细胞类型，但这通常非优选。
本发明的水凝胶/纳米结构组合物可有用地包含诸如胶原。但此形式的胶原不太可能具有有用的结构功能，它主要在蛋白水解活性不可思议的高时用作牺牲蛋白，从而帮助防止诸如健康组织的浸渍。
水凝胶/纳米结构组合物也可包括某些酶。酶用于急慢性伤口的清创术中。清创术是从伤口移除无法存活的组织和异物，并且是伤口修正过程中天然出现的事件。在炎性期过程中，中性粒细胞和巨噬细胞消解并移除伤口区域的“用过的”血小板、细胞屑、和无血管的损伤组织。但是，随着大量受损组织的蓄积，这一天然进程变得不堪重负且不足够。随后，坏死组织在伤口处的堆积需要相当大的吞噬需求并阻碍伤口愈合。因此，坏死组织的清创是典型疗法的特定目标和优化伤口管理的重要组成部分。
举例而言，可将酶并入本发明的外用水凝胶中以提供清创术的选择性方法。适当的酶可源自各种来源，如磷虾、螃蟹、木瓜、牛提取物和可商购的细菌，适当的酶包括胶原酶、木瓜蛋白酶/尿素、以及溶纤酶与去氧核糖核酸酶的组合。
用于本发明中的酶通常以下述两种途径之一工作：通过直接消解腐肉组分(如，纤维蛋白、细菌、白血球、细胞屑、浆液渗出物、dna)；或通过溶解将无血管组织固定在下层伤口床的胶原“锚”。
若需要，本发明的水凝胶可包含达金溶液(dakin'ssolution)，通常发挥抗微生物效果和气味控制。作为清创剂，因为其细胞毒性的性质，达金溶液是非选择性的。达金溶液令蛋白质变性，使其更容易从伤口移除。腐肉的松动也有助于通过其它方法进行的清创。如果目标是清创，包含达金溶液的水凝胶可每天改变两次。受伤皮肤的包含应通常由例如药膏、液体皮肤阻挡膜敷料、或固体皮肤阻挡片提供。
本发明的凝胶可通过任何适当方法输送，如经由注射器或波纹管包(单剂输送系统)或多剂系统如加压输送系统或经由“罐内包”类型的系统输送(如，wo98/32675中的系统)。波纹管包的实例显示于第2082665号英国公开设计中。
如是，本发明也延伸至包含根据本发明的凝胶的单剂输送系统，用于伤口的处置。本发明也延伸至包含根据本发明的凝胶的加压输送系统，以及放入能在从其释放压力时形成喷雾的气溶胶容器中的根据本发明的加压水凝胶。使用此类输送手段，令该凝胶被输送至通过直接施加难以到达的患者部位，如患者躺倒时的患者背部。
某些具体例中，对于在生物医学电极和其它电疗法情境中的用途，即，将电极或其它导电元件粘附至身体表面时，较佳使得本发明的水凝胶组合物导电。例如，该水凝胶组合物可用来将经皮神经刺激电极、电外科学返回电极、或ekg电极颠覆至患者皮肤或粘膜组织。这些应用牵涉该水凝胶组合物的改性以含有导电物质。适当的导电物质是离子性导电的电解质，特别是那些通常用于制造用于施加至皮肤或其它身体表面的导电性黏合剂的物质，且包括可离子化的无机盐、有机化合物、或两者的组合。离子性导电的电解质的实例包括，但不限于，硫酸铵、醋酸铵、醋酸单乙醇胺、醋酸二乙醇胺、乳酸钠、柠檬酸钠、醋酸镁、硫酸镁、醋酸钠、氯化钙、氯化镁、硫酸钙、氯化锂、高氯酸锂、柠檬酸钠和氯化钾，以及氧化还原电对如亚铁盐与铁盐如硫酸盐和葡糖酸盐的混合物。优选的盐式氯化钾、氯化钠、硫酸镁、和醋酸镁，且对于ekg应用，氯化钾是最优选的。尽管几乎任何量的电解质均可存在于本发明的组合物中，但优选任何电解质存在的浓度范围是该水凝胶组合物的约0.1至约15wt.％。nielsen等人在us5,846,558中揭示的用于制作生物医学电极的过程可能适合与本发明的水凝胶组合物合用，而该专利的公开内容通过关于制造细节的引用而并入本文。也可其它适当的制作过程，如该领域技术人员所明了的。
交联
对于某些应用，特别是当希望高凝聚强度时，本发明的凝胶/水凝胶的聚合物可以经共价交联。本公开预期，该凝胶/水凝胶组分的聚合物之间的交联可以是所希望的，而且本发明复合材料的凝胶/水凝胶的聚合物与该纳米结构组分之间的交联也可以是所希望的。本发明预期任何用于将聚合物彼此交联以及将凝胶/水凝胶与本发明纳米结构组分交联的适当手段。该凝胶/水凝胶聚合物可以共价交联至其它聚合物，或交联至该纳米结构，该交联可以是分子内交联或分子间交联或通过共价键交联。在前一种情况下，不存在该聚合物彼此之间或该聚合物与纳米结构之间的共价键；而在后一种情况下，存在将该聚合物彼此结合或将该聚合物结合至纳米结构的共价交联。可使用任何适当手段形成该交联，包括使用热、辐射或化学固化(交联)剂。交联程度应足以消除或至少最小化在压缩下的冷流动。交联也包括使用第三分子，用于交联过程中的“交联剂”。
对于热交联，使用自由基聚合反应引发剂，且可以是任何传统上用于乙烯基聚合反应的已知生成自由基的引发剂。优选的引发剂是有机过氧化物和偶氮化合物，用量通常为可聚合材料的约0.01wt％至15wt％，优选0.05wt％至10wt％，更优选约0.1wt％至约5wt％，且最优选约0.5wt％至约4wt％。适当的有机过氧化物包括过氧化二烷基，如过氧化叔丁基和2,2-双(叔丁过氧基)丙烷；过氧化二芳基，如过氧化苯甲酰和过氧化乙酰；过酸酯，如过氧苯甲酸叔丁酯和2-乙基过氧己酸叔丁酯；过二碳酸酯，如过氧二碳酸二-十六烷基酯和过氧二碳酸二环己酯；酮过氧化物，如过氧化环己酮和过氧化甲乙酮；以及氢过氧化物，如氢过氧化异丙苯和氢过氧化叔丁基。适当的偶氮化合物包括偶氮双异丁腈和偶氮双(2,4-二甲基戊腈)。热交联的温度将取决于实际组分且可由该领域技术人员轻易推导出，但典型为约80℃至约200℃的范围。
也可使用辐射，典型在光引发剂的存在下，实施交联。该辐射可以是紫外、α、β、γ、电子束、及x射线辐射，但优选紫外辐射。可用的光敏剂是“氢抽取”类型的三重敏化剂，且包括二苯甲酮及经取代的二苯甲酮以及苯乙酮，如苄基二甲基缩酮、4-芳氧基二苯甲酮(abp)、1-羟基-环己基苯基酮、2,2-二乙氧基苯乙酮、及2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮；经取代的α-酮醇，如2-甲基-2-羟基苯丙酮；苯偶姻醚类，如苯偶姻甲醚和苯偶姻异丙醚；经取代的苯偶姻醚类，如茴香偶姻甲醚(anisoinmethylether)；芳香族磺酰氯，如2-萘磺酰氯；光活性肟类，如1-苯基-1,2-丙二酮-2-(o-乙氧基-羰基)-肟；噻吨酮类，包括经烷基和卤素取代的噻吨酮类，如2-异丙基噻吨酮、2-氯噻吨酮、2,4-二甲基噻吨酮、2,4-二氯噻吨酮、和2,4-二乙基噻吨酮；以及酰基膦氧化物。本文中使用的辐射优选具有200至800nm，优选200至500nm的波长，且在大部分情况下，低强度紫外光足以诱发交联。但是，使用氢抽取类型的光敏剂，可能必需高强度uv曝光来实现足够的交联。该曝光可由汞灯处理器如可从ppg、fusion、xenon等获得的那些。也可通过使用γ辐射或电子束照射而诱发交联。用以有效交联的适宜照射参数即辐射类型和剂量，是该领域技术人员所熟知的。
适当的化学固化剂，也指代为化学交联“促进剂”，包括而不限于，聚硫醇，如2,2-二巯基二乙醚、二季戊四硫醇六(3-巯基丙酸酯)、亚乙基双(3-巯基醋酸酯)、季戊四硫醇四(3-巯基丙酸酯)、季戊四硫醇四硫代乙醇酸酯、聚乙二醇二巯基醋酸酯、聚乙二醇二(3-巯基丙酸酯)、三羟甲基乙烷三(3-巯基丙酸酯)、三羟甲基乙烷三硫代乙醇酸酯、三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)、三羟甲基丙烷三硫代乙醇酸酯、二硫代乙烷、二硫代丙烷、三硫代丙烷、及1,6-己二硫醇。将该交联促进剂加入未交联的亲水聚合物中，以促进其共价交联；或加入未交联的亲水聚合物与互补寡聚物中，以提供两种组分之间的交联。
也可在与互补寡聚物混合之前将该聚合物及/或纳米结构交联。这种情况下，优选通过将该聚合物的单体性前体与多官能组分混合并共聚而以交联形式合成该聚合物。单体性前体和相应聚合产物的实例如下：用于聚(n-乙烯基酰胺)产物的n-乙烯基酰胺前体；用于聚(n-烷基丙烯酰胺)产物的n-烷基丙烯酰胺；用于聚丙烯酸产物的丙烯酸；用于聚甲基丙烯酸产物的甲基丙烯酸；用于聚丙烯腈产物的丙烯腈；以及用于聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)产物的n-乙烯基吡咯烷酮(nvp)。聚合反应可在本体中、悬浮液中、溶液中、或乳液中进行。优选溶液聚合，且特优选极性有机溶剂如乙酸乙酯和低级烷醇(如，乙醇、异丙醇等)。对于亲水性乙烯基聚合物的制备，合成将典型在上文揭示的自由基引发剂的存在下经由自由基聚合而发生。该多官能共单体包括，例如，双丙烯酰胺、二醇如丁二醇和己二醇的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯(优选1,6-己二醇二丙烯酸酯)、其它丙烯酸酯如季戊四醇四丙烯酸酯、1,2-乙二醇二丙烯酸酯、和1,12-十二烷二醇二丙烯酸酯。其它可用的多官能交联单体包括寡聚性和聚合性多官能(甲基)丙烯酸酯，如聚环氧乙烷二丙烯酸酯或聚环氧乙烷二甲基丙烯酸酯；聚乙烯性交联剂，如经取代和未取代的二乙烯基苯；以及二官能尿烷丙烯酸酯，如ebecryl270和ebecryl230(重均分子量分别为1500和5000的丙烯酸酯化尿烷，两者均可从ucbofsmyrna,ga.获得)；及其组合。若采用化学交联剂，则其量优选为令该交联剂与亲水聚合物的重量比为约1:100至1:5的范围。所需要，将化学交联与辐射固化合用以实现更高的交联密度。
纳米结构
本发明的纳米结构组分可以是任何适当的形式，包括纤维、细丝、网片、分枝细丝或网、片、或成形件。该纳米结构也可包含任何适当的化学官能团，以促进本发明水凝胶的纳米结构与聚合物之间的共价或非共价交联。制作并官能化纳米材料的方法、技术和材料是该领域熟知的。
某些具体例中，使用微加工方法来制作本发明的纳米结构。在多个具体例中，所揭露的装置可使用任何适当的微加工技术组装及/或制造。这些方法和技术在该领域广为人知。
可用于制作本文中揭示的纳米结构的微加工过程包括平板印刷；蚀刻技术，如激光蚀刻、等离子体蚀刻、光刻、或化学蚀刻如湿化学、干、和光刻胶移除；或通过固体自由形式技术，包括三维打印(3dp)、立体平板印刷(sla)、选择性激光烧结(sls)、弹道颗粒制造(bpm)和融合沉积建模(fdm)；通过显微机械加工；硅的热氧化；电镀和无电镀；扩散过程，如硼、磷、砷、和锑扩散；离子植入；膜沉积，如蒸发(细丝、电子束、闪光、遮蔽和阶梯覆盖)、溅射、化学气相沉积(cvd)、外延生长(气相、液相、和分子束)、电镀、丝网印刷、层压；或其组合。见jaeger的《微电子加工入门》(introductiontomicroelectronicfabrication(addison-wesleypublishingco.,readingmass.1988))；runyan等人的《半导体集成电路加工技术》(semiconductorintegratedcircuitprocessingtechnology(addison-wesleypublishingco.,readingmass.1990))；proceedingsoftheieeemicroelectromechanicalsystemsconference1987-1998；rai-choudhury编纂的《显微光刻法手册》(handbookofmicrolithography,micromachiningµfabrication(spieopticalengineeringpress,bellingham,wash.1997))。用作模具的材料的选择决定了表面如何被配置为形成分支结构。
例如，可使用采用源自半导体工业的光刻过程和方法的用于加工微电子机械系统(microelectromechanicalsystems,mems)的该领域最新技术。更近期研发的方法包括“软光刻”(whitesidesetal,angewchem.inted,37；550-575,(1998))和微流体构造(u.s.pat.no.6,488,872,beebeetal.,nature；404:588-59(2000))。聚合物微装置加工的综述和其它讨论包括madou,m.j.fundamentalsofmicrofabrication:thescienceofminiaturization；2nded.；crcpress:bocaraton,1997；becker,h.,andlocascio,l.e."polymermicrofluidicdevices."talanta,56(2):267-287,2002；quake,s.r.,andscherer,a."frommicro-tonanofabricationwithsoftmaterials."science,290(5496):1536-1540,2000；以及whitesides,g.m.,andstroock,a.d."flexiblemethodsformicrofluidics."physicstoday,54(6):42-48,2001，各自通过引用而并入本文。
也可通过电纺(也指代为电纺)加工本发明的纳米结构。能形成纤维的液体及/或溶液电纺技术，是熟知的且已经揭示于大量专利中，如us4,043,331和us5,522,879。电纺过程通常牵涉将液体引入电场内，因此该液体被导致生产纤维。这些纤维通常在吸引电位被拉出为导体而收集。在液体转化为纤维的过程中，该纤维硬化及/或干燥。这一硬化及/或干燥可由该液体的冷却造成，即，在该情况下该液体于室温正常为固体；通过溶剂的蒸发造成，如通过脱水造成(物理引发的硬化)；或通过固化机制造成(化学引发的硬化)。
典型地，电纺的过程已经被引导朝向使用纤维以创建垫或其它无纺材料，例如，在us4,043,331中揭示的。直径为50nm至5微米范围内的纳米纤维可被电纺为无纺或对准的纳米纤维网。由于纤维直径小，电纺的纺织品具有非常高的表面积和小的孔尺寸。这些形状令电纺纤维织物称为大量应用的备选，该应用包括膜、组织支架、及其它生物医学应用。
电纺的纤维可生产为具有非常细的直径。影响电纺纤维直径、一致性和均匀度的参数包括形成该纤维的组合中的聚合物材料和交联剂浓度(载荷)、所施加的电压、收集针的距离。根据本发明的一种具体例，纳米纤维的直径为约1nm至约100μm的范围。其它具体例中，该纳米纤维的直径为约1nm至约1000nm的范围。再者，该纳米纤维可具有至少约10至约至少100的纵横比。应领会，因为该纤维的直径非常小，该纤维的每单位体积具有高的表面积。这一高的表面积与质量比允许形成纤维的溶液或液体从液体或溶剂化纤维形成材料在一秒加工内转化为固体纳米纤维。
用以形成本发明的纳米纤维/纳米结构的聚合物材料可从任何能与该交联剂相容的纤维成形材料中选择。依据所打算的应用，该纤维成形聚合物材料可以是亲水、疏水或两亲的。据此，该纤维成形聚合物材料可以是热响应聚合物材料。
合成或天然的、生物可降解或生物不可降解的聚合物可形成本发明的纳米纤维/纳米结构。“合成聚合物”指代合成性制备的聚合物，且包括非天然出现的单体性单元。例如，合成聚合物可包括非天然单体性单元，如丙烯酸酯或丙烯酰胺单元。合成聚合物典型通过传统聚合反应如加成聚合、缩合聚合、或自由基聚合而形成。合成聚合物也可包括具有与非天然单体单元(例如，合成肽、核苷酸、和糖衍生物)合用的天然单体性单元如天然出现的肽、核苷酸和糖单体性单元的那些。这些类型的合成性聚合物可通过标准合成技术如固相合成、或重组(当允许时)而生产。
“天然聚合物”指代其聚合物骨架由天然单体性单元组成的天然的、重组制备的、或车程制备的聚合物。一些例子中，该天然聚合物可经改性、加工、衍生、或反向处理以改变该天然聚合物的化学及/或物理性质。这些例子中，术语“天然聚合物”将被改性，以反映该天然聚合物的变化(例如，“衍生的天然聚合物”或“去糖基的天然聚合物”)。
例如，纳米纤维材料可包括加成聚合物和缩合聚合物两种材料，如聚烯烃、聚缩醛、聚酰胺、聚酯、纤维素醚和酯、聚亚烷基硫醚、聚芳醚、聚砜、改性聚砜聚合物、及其混合物。这些范类中的例示性材料包括聚乙烯、聚(ε-己内酯)、聚乳酸酯、聚乙交酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(及其它丙烯酸树脂)、聚苯乙烯及其共聚物(包括aba类型的嵌段共聚物)、聚偏氟乙烯、聚偏氯乙烯、更种水解程度(87％至99.5％)的聚乙烯醇，该聚合物可为交联形式和非交联形式。例示性加成聚合物倾向于类似玻璃(tg高于室温)。这是聚氯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯聚合物组合物、或聚偏氟乙烯与聚乙烯醇材料的合金或低结晶度材料的例子。
本发明的一些具体例中，该纳米纤维/纳米结构材料是聚酰胺缩合聚合物。在更具体的具体例中，该聚酰胺缩合聚合物是尼龙聚合物。术语“尼龙”是全部长链合成聚酰胺的通用名。另一尼龙可通过ε-己内酰胺在少量水的存在下的缩聚反应而制作。这一反应形成尼龙-6(由环状内酰胺也称为ε-氨基己酸制作)，其是线性聚酰胺。再者，也预期尼龙共聚物。共聚物可通过下述制作：将各种二胺化合物、各种二酸化合物、与各种环状内酰胺结构合并为反应混合物，随后形成聚酰胺结构的具有随机定位的单体性材料的尼龙。例如，尼龙6,6-6,10材料是从六亚甲基二胺与c6及c10掺混二酸制造的一种尼龙。尼龙6-6,6-6,10是通过ε-氨基己酸、六亚甲基二胺与c6及c10掺混二酸制造的一种尼龙。
嵌段共聚物也可用作纳米纤维材料。在制备用于纳米纤维制剂的组合物中，可选择溶剂系统，故两个前段均可溶于该溶剂。一个实例是二氯甲烷溶液中的aba(苯乙烯-ep-苯乙烯)或ab(苯乙烯-ep)聚合物。该嵌段共聚物的实例是kraton类型的ab和aba嵌段共聚物，包括苯乙烯/丁二烯和苯乙烯/氢化丁二烯(乙烯-丙烯)；pebax类型的ε-己内酰胺/环氧乙烷；以及sympatex类型的聚酯/环氧乙烷、和环氧乙烷与异氰酸酯的聚氨酯。
加成聚合物如聚偏氟乙烯、间同立构聚苯乙烯、聚苯乙烯与六氟丙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、无定形加成聚合物如聚丙烯腈及其与丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯及其各种共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯及其各种共聚物，可相对溶液地进行溶液纺，盖因它们在低压低温下可溶。高结晶度聚合物如聚乙烯和聚丙烯如进行溶液纺，通常需要更高温度和高压溶剂。
纳米纤维也可由包含两种或多种聚合物材料的聚合物组合物形成，该聚合物组合物的形式为聚合物混合物、合金形式、或交联化学键合结构。可掺混两种相关的聚合物材料，以提供具备有利性质的纳米纤维。例如，高分子量聚氯乙烯可与低分子量聚氯乙烯掺混。同样，高分子量尼龙材料可与低分子量尼龙材料掺混。再者，可掺混同一聚合物属的相异品种。例如，高分子量苯乙烯材料可与低分子量高抗冲聚苯乙烯掺混。尼龙-6材料可与尼龙共聚物如尼龙-6；6,6；6,10共聚物掺混。再者，具有低水解程度的聚乙烯醇如87％水解的聚乙烯醇可与水解程度为98至99.9％或更高之间的完全或超水解聚乙烯醇掺混。可使用适宜的交联机制将混合物中的全部这些材料交联。尼龙可使用能与酰胺链接中的氮反应的交联剂交联。聚乙烯醇材料可使用可与羟基反应的材料交联，该可与羟基反应的材料为，如单醛如甲醛、脲、三聚氰胺-甲醛树脂及其类似物、硼酸、及其它无机化合物、二醛、二酸、尿烷、环氧、及其它已知交联剂。交联剂反应并在聚合物链之间形成共价键，以实质上改善分子量、耐化学性、整体强度、及对机械降解的耐性。
生物可降解聚合物也可用于本发明纳米结构的制备中。已经作为生物可降解材料研究的合成聚合物类别的实例包括聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚原酸酯、聚己内酯(pcl)、聚亚胺基碳酸酯、脂肪族碳酸酯、聚磷腈、聚酸酐、及其共聚物。可用于与例如可植入医学装置联系的生无可降解材料的实例包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚二氧六环酮、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-局二氧六环酮)、聚酸酐、聚(乙交酯-共-碳酸-1,3-丙二酯)、及聚(乙交酯-共-己内酯)。也可使用这些聚合物与其它生物可降解聚合物的掺混物。
一些具体例中，该纳米纤维是生物不可降解的聚合物。生物不可降解的聚合物指代通常不能经非酶、水解、或酶降解方式降解。例如，生物不可降解的聚合物对可能由蛋白酶造成的降解具有耐性。生物不可降解的聚合物可包括天然共聚物或合成共聚物。
在形成纳米纤维的组合物中内含交联剂，允许该纳米纤维与广泛的支持表面相容。该交联剂可单独使用或与其它材料合用，以提供所希望的表面特征。
适当的交联剂包括单体性材料(小分子材料)或聚合性材料，具有至少两种能在经受能量源如辐射能、电能或热能处理时与其它材料形成共价键的潜在反应性可活化基团。通常，潜在反应性可活化基团是响应具体施加的外部能力或刺激而生成活性部位，结果共价键合至相邻化学结构的化学个体。潜在反应性基团是那些在存储条件下保留其共价键，但在通过外部能量源活化时与其它分子形成共价键的那些基团。一些具体例中，潜在反应性基团形成活性部位如自由基。当吸收外部施加的电能、电化学能、或热能时，这些自由基可包括氮烯、卡宾、或酮的激发态。已知的或可商购的潜在反应性基团的多个实例报导于us4,973,493、us5,258,041、us5,563,056、us5,637,460、或us6,278,018中。
例如，可使用可从aldrichchemicals、produitschimiquesauxiliairesetdesyntheses,(longjumeau,france)、shin-nakamarachemical、midorichemicalsco.,ltd.、或panchims.a.(france)商购的基于三氯甲基三嗪的多官能光交联剂。该八种化合物包括2,4,6-叁(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(甲基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(4-甲氧基萘基l)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(4-乙氧基萘基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、4-(4-羧基萘基)-2,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(4-甲氧基苯基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(1-乙烯基-2-2'-呋喃基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪和2-(4-甲氧基苯乙烯基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪。
使用方法和例示性具体例
本发明的凝胶/水凝胶/纳米结构组合物较佳可用于大量组织修补状况以及其它应用中，如提供导尿管及其它手术装置和植入物上的涂层。本发明的凝胶/水凝胶/纳米结构组合物也可用来输送本文中揭示的活性剂，如抗生素、生长因子、及免疫抑制剂。
某些具体例中，本发明提供愈合软组织缺损的方法，包含将复合材料施加至软组织缺损处，其中，该复合材料包括凝胶和置于该凝胶内的纳米结构。
应知悉，本文所揭示的水凝胶/纳米结构组合物的优势性质包括下述能力：1)提供容易的表征和质控；2)与现有组织基质整合；3)直接并入新鲜形成的基质中；4)直接包括细胞和生物活性因子；5)维持生物相容性；6)控制生物吸收；7)由于该纳米结构造成的更高结构刚度而容易浇铸入复杂的解剖形状中；以及8)展现原生组织如关节软骨的机械性质。
一种应用中，本发明的水凝胶/纳米结构复合组合物可用来修补软骨组织。当前基于生物学的软骨修补手术过程包括自体软骨细胞移植、钻孔、磨损软骨成形术、微骨折、及镶嵌关节成形术。这些过程全部进治疗病灶关节软骨伤害，而不治疗软骨剥蚀表面如重度骨关节炎和类风湿性关节炎中可见者。又，它们使用软骨组织栓或从患者获取的扩充软骨细胞来填充软骨缺损。这些组织或软骨细胞被预期通过完整合成从头合成材料如新鲜合成的透明软骨而填充该缺损，而该从头合成材料已经整合入现有软骨基质中且具有正常软骨的生物机械性质。但是，此类过程全部促进修缮组织(纤维软骨)而非真实透明软骨的形成，对纤维软骨造成进一步的机械损害，令关节更易罹患骨关节炎。再者，内源性软骨作为修补材料的可应用性受其自身风险的获得性和患者发病率的控制极大。因为来自牵涉讨论的证据，本文中揭露的所得水凝胶/纳米结构组合物提出用于对患有软骨退化性疾病的患者的有希望的新疗法中的实际材料。
如本文中揭示的，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可制备为具有适用于任何数目的合成组织移植或增加以及其它临床应用的广泛可变性质。如已经揭示的，本发明的材料可用来修补作为伤害或疾病结果而产生的软骨缺损。可如是修补的由于伤害造成的缺损可以是体育或事故相关的，且可仅牵涉表面软骨层，或可包括下方的软骨下骨。可使用本文揭示的组合物修补的由于疾病造成的缺损包括从骨关节炎和类风湿性关节炎获得的那些。无论来自伤害或疾病，该缺损可以是成熟软骨或生长板软骨。用于合成性生长板软骨的水凝胶配方可能需要内含未取代的支架材料以允许生长过程中该生物材料的受控生物吸收。
可使用本文中揭示的水凝胶/纳米结构组合物的另一领域是头颈部软骨质组织以及软组织的修补、重建或增加。生物材料用于软组织增加和头颈部重建的可应用性在造型和重建手术领域保持根本性挑战。已经进行大量调查研究来研发具有适宜生物相容性和使用寿命的材料。这一研究的成果不令人期待。当置于免疫活性动物体内时，由于框架被吸收，当前推荐材料的结构完整性已经显示失败。再者，尽管传统合成材料具有优异的寿命，但它们存在某些不可避免的缺点。例如，聚硅酮具有安全性和长期免疫相关效果方面的担忧。合成聚合物ptfe(gortex)和硅橡胶(silastic)具有较低的组织反应性但不具有组织整合性，且可能表现对于异体感染和排异的长期风险。所揭示的用于本应用的材料将可用来制备用于头颈部软组织缺损的增加或修补的合成性软组织支架材料。特别地，该非炎性、非免疫原性、且可制备为具有适宜程度的粘弹性(见本文中说明)的水凝胶/纳米结构组合物，将会用作有效的可植入支架材料。
此外，举例而言，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可用作新颖的、生物相容性和生物依从性材料，以制备频繁用于头颈部重建过程而修补由于创伤或先天下畸形造成的软骨质或骨质二次缺损的软骨植入物。用于耳朵的具体应用包括耳成形术和耳重建，该手术一般用来修补由创伤、赘生物(即，鳞状细胞癌、基底细胞癌、及黑素瘤)、及先天性缺损如小耳症造成的软骨质缺损。用于鼻子的具体应用包括鼻和鼻中隔的美容和重建过程。鼻梁垫高、鼻尖、鼻背和鼻翼移植频繁用于美容性鼻整形术中。创伤、赘生物、自体免疫疾病如魏格纳肉芽肿(wegenersgranulomatosis)、或先天性缺损后的鼻部重建需要用于修补的软骨。隔膜穿孔难以管理且一般是失败的治疗方式。对于这些应用，由于自体或供体软骨一般不可用，因此软骨移植是理想的。具体用于喉部的应用包括喉气管重建，对于儿童来说一般需要获取不无发病率的肋软骨。耳软骨和中隔软骨一般不适用于本应用。基于调整水凝胶合成的参数如反应剂浓度、取代率、和交联率，从本文中揭露的水凝胶制备的合成性软骨质材料可合成为适应前述各应用。一般实施喉气管重建治疗由于声门下或气管狭窄造成的气道缩小。该致病源可以是创伤的(即，插管创伤、或气管切开)或先天的。除了众多颅面应用之外，其它可能性包括垫下巴和丰颊，以及用于下眼睑的外翻修补。应注意，这些应用可能不需要具有关节软骨的严格机械性质的软骨。内含细胞群落或生物活性剂也可以是所希望的。
本文中揭示的水凝胶/纳米结构组合物也可用于鼻腔的修补和缩小，正常在过度侵略性手术切除术之后进行，以防止液体在鼻道中的慢性淤积，而该淤积导致感染和结壳。另一有希望的应用是儿童和成人的喉气管重建，例如，作为由手术如心血管手术过程中插管导致的喉气管伤害的结果。本文中揭示的水凝胶/纳米结构组合物也可用来提供环状软骨环替换件，以在用于治疗癌症的颈切除后保护颈动脉，即，本发明的组合物可放置于该颈动脉与皮肤之间作为保护性屏障，用来令颈动脉对抗皮肤屏障的损失。作为被切除伸进的神经元群落恢复过程中的保护性涂层，纤维组织往往比防止其最终形成的神经元群落恢复更快。本发明的水凝胶/纳米结构组合物预铸管内神经末端的配置将会不包括从群落恢复位点形成的纤维组织。
本发明的水凝胶/纳米结构组合物也可用于修补任何内部或外部器官的软组织缺损。例如，除了众多颅面应用之外，本发明的材料可用于垫下巴和丰颊，以及用于下眼睑的外翻修补。对于除头颈部之外的美容性和重建性目标，例如用作丰胸的乳房植入物，用作伤口密封剂，用以例如填充乳腺或颈部淋巴结移除(如，由于癌症)后留下的空洞，用以密封淋巴及减轻流体至切除位内的不受控制的渗漏，而该渗漏可导致感染和其它并发症。
除了上述应用之外，本文中揭示的水凝胶/纳米结构组合物可用于其它组织工程应用中，以生产合成性矫形组织，包括但不限于，骨、腱、韧带、半月板和椎间盘，使用与上文揭示者相似的策略和方法用于合成人造形式的软骨。该水凝胶/纳米结构组合物也可用来制作合成性非矫形组织，包括但不限于，声带、玻璃体、心脏瓣膜、肝脏、胰腺和肾脏，使用与上文揭示者相似的策略和方法用于合成人造形式的软骨。
可使用本文中揭露的水凝胶/纳米结构组合物的另一领域是胃肠道应用，其中，必需处理或预防腹内或胃肠道器官内的疤痕组织或狭窄的形成。已经存在大量处于临床和fda许可各阶段的产品，通常定义为“水凝胶”，它们设计或倾向于可用于瘢痕形成及/或狭窄形成的治疗和预防中。本发明的材料比其它已知水凝胶杰出，其中，本文中揭示的材料可包括纳米结构，该纳米结构可对水凝胶材料提供支持、形状和强度。本文中揭露的水凝胶/纳米结构组合物可用于与已知水凝胶所使用或倾向于使用的相似应用中，包括下列：胃肠道的狭窄或瘢痕形成的治疗。该治疗牵涉将水凝胶材料注射至预期狭窄位点以防止瘢痕形成，或注射至治疗后的现存下站位点以扩增该变窄的gi道以预防瘢痕形成的再次出现。
本发明的材料也可用于食管狭窄的治疗。食道狭窄是胃食管反流疾病(gerd)的常见并发症。gerd是由回流至食道内并伤害食道衬细胞的酸、胆酸和其它伤害性胃内容物造成的。大约7到23％的gerd患者发展处食道狭窄或食道的纤维状瘢痕形成。食道瘢痕形成也可通过用来治疗巴雷斯特食道症(barrett'sesophagus)的消融疗法造成。该消融疗法的主要并发症为，消融性伤害延伸过伸，以至于进入食道壁内并导致食道瘢痕或狭窄。食道狭窄阻碍正常吞咽，并且是患者发病的主要肇因。本文中揭示的材料可用来治疗或预防缘于gerd、巴雷斯特食道症、和食道消融疗法的食道狭窄。
本发明的复合材料也可用于克罗恩病的治疗。克罗恩病造成阻挡或缩窄肠内腔的狭窄或瘢痕，妨碍正常的肠功能。本发明的材料可用来治疗或预防此类狭窄。
该复合材料也可用于治疗原发性硬化性胆管炎(psc)的方法中。psc是肝脏胆管的罕见疾病。该胆管在肝脏内形成分支网络，并经由两个主要分支离开肝脏，该两个主要分支合并为将肝脏和胆囊内的胆汁抽入十二指肠的胆总管。该胆管的直径非常窄，正常在其最大最末端部分测得最大仅为2mm，但它们仍必须每天正常地将几升胆汁从肝脏抽入十二指肠内。这些导管的任何阻断均可导致称为黄疸的严重情况，这使得众多毒素特别是血红蛋白分解产物在身体内蓄积。psc是肝脏内胆管及上述连接肝脏与小肠的肝外胆管的瘢痕形成或狭窄疾病。psc的胆管狭窄可使用本发明的水凝胶/纳米结构组合物治疗或预防。
本发明的复合材料也可用来治疗慢性胰腺炎。慢性胰腺炎是胰腺的慢性炎性疾病，可能是胰腺管的瘢痕或狭窄的并发症。这些狭窄阻断了胰液的渗漏，而正常情况下胰液必须通过导管或渗漏管系统离开胰腺并进入小肠内。胰液含有众多消化酶和其它对于正常消化和营养吸收重要的元素。由慢性胰腺炎造成的胰腺管的阻断或缩窄可导致严重的并发症，其中，胰腺自消化并形成威胁生命的腹部感染和/或脓肿。慢性胰腺炎的胰腺管狭窄可使用本发明的水凝胶治疗或预防。
本发明揭示的组合物也可用于治疗胆石症诱发的导管和胰腺管狭窄。胆石症是很常见的病变，其主要并发症为胆管狭窄和胰腺管狭窄的形成，可使用用于治疗缺血性肠病的该水凝胶治疗或预防。当肠道的血液供应被损害时，该肠道被证实形成了瘢痕或狭窄。被损害的血流称为缺血，可由多种途径造成，包括心血管疾病、动脉粥样硬化、低血压、血容量减少、肾病或肝病引发的低白蛋白血症、血管炎、药物引发的疾病等。全部这些致病源的末期结果可导致肠道狭窄，其阻断肠并妨碍其正常功能。本发明的水凝胶/纳米结构复合物可用来治疗或预防缺血性肠狭窄。
本发明的组合物也可用于治疗辐射引发的肠狭窄。癌症的辐射疗法与大量发病有关，其中重要的是肠狭窄的形成。本发明的水凝胶复合物可用来治疗或预防辐射引发的肠狭窄。
除了制作合成组织或修补原生组织外，本文揭露的水凝胶/纳米结构复合物也可用来提供用于待用于手术或体内移植中的非生物结构或装置的涂层，该非生物结构或装置是例如手术器械或陶瓷或金属假肢。该涂层将提供该非生物装置材料与活体组织之间的屏障。水凝胶作为屏障用于非生物装置的角色包括但不限于：1)预防非生物装置表面上大分子及/或细胞的吸收，该吸收可能导致该装置表面的蛋白质污垢或血栓形成；2)令由非生物相容性材料制作的装置呈现非毒性、非炎性、非免疫原性、生物相容性的表面；3)与装置功能的相容性，该功能为例如对于葡萄糖传感器的葡萄糖扩散、对于压力传感器的机械力的传送、或人工血管或血管内支架的内皮化；4)提升装置功能，如向基于mems的人造肾元中的现有屏障提供电荷屏障；5)并入陷于水性、生理学相容性环境中的不同细胞群落的非生物装置；以及6)内含药物或生物活性因子如生长因子、抗病毒剂、抗生素、或设计为鼓励该装置进行血管生成、上皮形成或内皮化的粘附分子。
基于前文，本发明的水凝胶/纳米结构复合物可用来向多种可植入装置提供不会引起过敏的涂层，该装置包括用于糖尿病关联的可植入葡萄糖传感器。此外，该水凝胶/纳米结构复合物可用来提供：用于研发基于mems的人造肾元的电荷屏障；能够并入基于mems的人造肾元设计的其内部包埋肾细胞如足状突细胞的水性、生理学相容性环境；以及，用于可植入mems装置的涂层，该装置设计为用于多种目标，该目标包括但不限于，药物输送、机械传感、以及作为生物检测系统。
所揭露的水凝胶/纳米结构复合物，特别是基于透明质酸的水凝胶，也可共价接合至硅基结构，如通过酪胺的伯胺的第一共价接合而结合至硅表面，以提供涂覆有羟基苯基的表面化学。这可使用与用以将已经使用游离胺改性的dna结合至硅表面相同的化学手段。随后，通过以上文揭示的其优选交联模式使用的相同过氧化物酶驱动化学，将该基于ha的水凝胶共价偶合至该涂覆有羟基苯基的表面。
该水凝胶/纳米结构复合物也可用于涂覆非生物心血管装置，如导管、心脏瓣膜、及人工血管。这些将会包括由传统上因为其生物学不相容性而不使用的材料制作，但具有比当前使用的那些装置杰出的设计特征。生物活性因子将并入水凝胶中，以促进该水凝胶的内皮化或上皮形成，以及因此而来的植入装置的内皮化或上皮形成。
尽管本文中已经揭示本发明的水凝胶/纳米结构复合物的具体实例，但这些具体用途并非意欲限制。本发明的水凝胶/纳米结构复合物可用于通常用于已知水凝胶的应用，特别地，可用于身体内任何位置软组织的修补及/或再生。
现在对图式做出说明，其中，相似的参考数字确定相似的揭露主体的结构特征或方面。为了解释和例示性说明而非限制，根据本公开的生物可降解复合物具体例的例示性说明图显示于图1a中，且通常通常参考字符100标注。本文中揭示的系统和方法可用来提升软组织缺损的愈合。
通常参照图1a至1d，生物可降解复合物100可包括纳米纤维101增强的凝胶103，其合并了凝胶103及纳米纤维101的优点。凝胶103可包括任何适当的材料，例如但不限于，水凝胶。纳米纤维101可使用任何适当的纳米材料制作，如聚己内酯(pcl)或任何其它适当的材料，且可为任何适当的性质及/或尺寸。复合物100包括高孔隙率(如，用以介导细胞粘附和迁移)，同时维持足够的机械性质(如，用以维持刚度和组织支持)。
至少一些具体例中，纳米纤维101共价接合至水凝胶103，形成一个或多个聚合物链。水凝胶103至纳米纤维101的共价结合可导致具有比单独使用或简单掺混使用该构建材料杰出的理想性质组合集合的材料。
图2a说明图1复合物具体例相对于单独使用的ha水凝胶的应力应变曲线，显现比相同交联密度的水凝胶改善的弹性模量。如图中所示，所测试复合物100(4.5mg/mlha、10mg/mlpeg-da、6.75mg/mlpcl纤维)的弹性模量为750pa，而单独使用的相同密度水凝胶的弹性模量则为320pa。图2b说明疲劳试验，显示图1中例示性说明的复合物维持与规则水凝胶相似的机械完整性的鲁棒性。
参照图3a至3b，显示复合物100支持脂肪组织源干细胞(asc)迁移。gfp标记的来自抽脂手术抽出物的asc生长为球状体，并随后种植于复合物或水凝胶中。
图3a和3b显示在纳米纤维-ha水凝胶复合物中培养4天的asc的荧光(图3a)和与相衬图像的叠加(图3b)。细胞向外迁移延伸的长过程和轨迹。反之，图3c和3d中显示的在单独的ha水凝胶中培养的asc并不显示显着的细胞迁移。
图4a和4b显示从球状体沿着对准的650-nm纳米纤维101迁移的对比asc的荧光(图4a)和与相衬图像的叠加(图4b)，显示它们对于纳米纤维101的存在的强力迁移响应。
[实施例]
实施例1：纳米纤维-水凝胶复合物的制备
通过电纺pcl(聚己内酯，80k，来自sigmaaldrich)生产纳米纤维。将纳米纤维纺为随机网片。纺纱参数为pcl在90％/1％w/wdcm-dmf中的10％wt溶液，以0.6ml/hr的流速通过与靶标金属板相距15cm的27gauge钝针。针电压为+10kv，靶标板具有电压为-3kv的负偏压。每圈纺纱1ml的溶液。
随后使用多步骤过程令该纤维官能化。简言之，等离子体处理该纤维以令该纤维表面上具有反应性基团，丙烯酸通过uv光引发而接合至该反应性基团。随后令丙烯酸酯基与edc和重氮胺(diazimine)反应以形成伯胺。这些胺可随后与smcc反应以粘附马来酰亚胺基，而马来酰亚胺基可轻易地与水凝胶中的硫醇基团反应。
将官能化的纤维网片切割为60mg或更小的碎片。将60mg样品浸泡于乙醇中，随后加入已经使用液氮部分填充的陶瓷研钵内。该纤维样品将变得非常硬。将该样品保持为足够凉以维持刚度，用剪刀将纤维片切割为约5mmx5mm的碎片。当整片被切割后，使用研钵和研杵研磨约20min，保持该研钵部分地填充有液氮。随后将纤维浆料倾入乙醇中。将约1mg表面活性剂加入该浆料中，以帮助预防纤维缠绕。将该悬浮液以300g离心min，丢弃上清液。令纤维干燥过夜。随后将纤维称重放入第二离心管内，故可得到纤维的精确浓度。随后将纤维浸泡于乙醇中消毒，离心，丢弃上清液，令其在生物安全柜中干燥过夜。随后将纤维再次以所希望的浓度悬浮于去离子水中，该浓度一般为15mg/ml。
为了形成水凝胶复合物，使用1ml的该纤维悬浮液来再水化1小瓶的glycosil透明质酸，得到含有15mg/ml纤维和10mg/ml透明质酸的溶液。向900μl这一溶液中加入100μl的10％peg-da原液，以给出下述最终浓度：13.6mg/ml纤维、9mg/ml透明质酸、和10mg/mlpeg-da。这是用于初始体内实施例的配方，但通过改变构建浓度已经制作其它配方。
与不具纤维的透明水凝胶不同，所得复合物颜色为奶白色(图1c)。该复合凝胶维持其形状，且具有良好的可操作性，而单独的水凝胶组更倾向于撕裂。该纤维在水凝胶中是分散的，且长度为几十至几百微米的范围(图1b)。断裂的冻干样品复合物的横截面的sem显示了纤维与水凝胶组分之间的紧密联系，以及分散纤维的高密度(图1d)。
材料和方法
材料
从esibio(alameda,ca)购买经硫醇化的透明质酸(ha)。从laysanbio,inc(arab,al)购买聚乙二醇二丙烯酸酯。从sigma获得下列：聚(ε-己内酯)、乙胺-马来酰亚胺、丙烯酸、甲苯胺蓝、o,n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、半胱氨酸、牛血清白蛋白(bsa)、醋酸和tritontmx-100。从英杰生物科技公司(invitrogenlifetechnologies)购买杜尔贝科氏改性伊戈尔介质(dulbecco’smodifiedeaglemedium,dmem)、胎牛血清(fbs)、青霉素/链霉素、alexa
方法
用于流变学实验的pcl纳米纤维的电纺：
为了制造两种不同直径的pcl纤维，分别在二氯甲烷与二甲基甲酰胺的混合物(9:1，v/v)中和氯仿与甲醇的混合物(3:1，v/v)中制备11.0和8.5％(w/v)的pcl溶液。将每一均质pcl溶液置于具有27g金属针的注射器内。随后，使用下述参数实施电纺：1.0ml/h的喂料速率，对金属针施加15kv的正电压，以及针端与地面的距离为12cm。使用场发射扫描电镜(fesem，jeol6700f)观察纤维形貌，并使用imagej软件(usnationalinstitutesofhealth,bethesda,md)以fesem图像测量纤维直径。
体内复合物的电纺：
纺纱条件：在二氯甲烷与二甲基甲酰胺的溶剂混合物(9:1,w/w)中的16％w/vpcl(95％45.000mnpcl，5％80,000mnpcl，两者均来自sigma)。该纤维通过与接地轮表面相距10cm的以1000rpm旋转的27gauge钝针以5.25ml/hr的速率纺纱。所施加的电压为15kv，且电纺泵以2mm/sec速率横跨85mm的行进距离来回往复进行光栅扫描140次(约4小时)。随后，经纤维片切割为直径14cm的个体片材，进行官能化。
使用mal制备表面官能化的纤维：
为了使用mal进行纤维表面的官能化，根据文献使用小改性通过接枝聚丙烯酸(paa)而向纤维表面引入羧基[interfacefocus2011,1,725-733]。简而言之，在室温于280mmhg氧气氛中等离子体处理纤维10min，以向纤维表面引入自由基。随后将处于10ml的3或10％(v/v)丙烯酸的0.5mmnaio3溶液中的70mg纤维在uv(36mw/cm2,dymax光固化系统5000flood,torrington,ct)中暴露90s，进行paa在纤维表面上的光聚合(paa-纤维)。将paa-纤维在室温孵化20min后，使用20ml去离子水洗涤paa-纤维三次以移除未反应的丙烯酸。完全空气干燥paa-纤维后，通过甲苯胺蓝o(tbo)检验来测定paa-纤维上的羧基密度，该检验假设tbo与纤维上的羧基以1:1摩尔比反应[jbiomedmaterres2003,67,1093-1104]。简而言之，在浸泡20μl的50％(v/v)的乙醇之后，将paa-纤维(1x1cm2)完全浸没于1ml的溶解在0.1mmnaoh(ph10)中的0.5mmtbo溶液中，并在温和震荡下载室温反应5h。使用0.1mmnaoh(ph10)洗涤之后，使用1ml的50％(v/v)醋酸在剧烈震荡下于室温令表面上吸附tbo的paa-纤维解吸1h。随后，使用酶标仪(biotecksynergy2,winooski,vt)在633nm测量上清液的光密度。使用溶解于50％(v/v)醋酸中的tbo作为标样。
使用低温研磨机(freezer/mill6770,spexsampleprep,metuchen,nj)使用下述参数研磨paa-纤维以制备纤维片段：10循环研磨1min，且在液氮中冷却3min。将paa-纤维片段收集在50-ml锥形试管中之后，将paa-纤维片段完全分散于10ml的异丙醇与去离子水混合物(1:1，v/v)中，以使用氨基乙基-mal改性纤维表面。简而言之，将paa-纤维加入nhs和edc，以活化纤维上paa的羧基。羧基与nhs和edc的摩尔比分别为1至4和4。在温和震荡下于室温实施该活化。1h后，将氨基乙基-mal加入羧基被活化的纤维中，其中，羧基与氨基乙基-mal的摩尔比为1至2。随后在温和震荡下于室温实施反应12h。表面以mal官能化的纤维在使用蒸馏水洗涤三次后，冻干该纤维。这里，纤维上mal的密度假设为纤维表面上的全部羧基被mal完全取代。
纤维-ha水凝胶复合物的制备：
对于制备纤维-ha水凝胶复合物，将硫醇化的ha及pegda完全溶解于pbs(ph7.4)，浓度分别为所希望的12.5mg/ml和100mg/ml。将具有所希望的25mg/ml浓度的mal-纤维完全分散于pbs(ph7.4)中。随后，依次加入纳米纤维悬浮液、ha、peg-da、及pbs，以达到配方所希望的最终浓度。均质混合该复合物前体溶液后，对于流变研究，将100μl的复合物前体溶液倾入模具(φ＝8mm)内，并于37℃孵化2h进行凝胶化。对于压缩研究，将200μl的前体溶液加入筒状聚四氟乙烯(teflon)模具(φ＝6.35mm，h＝6.35mm)内，并入上文所述孵化。为了使用fesem观察纤维-ha水凝胶复合物和ha水凝胶的形貌，通过在临界点干燥(samdri-795,tousimis,rockvillle,md)或化学干燥(hdms)之前的系列乙醇洗涤(10min，各自以50％、70％、80％、90％、100％、及100％乙醇洗涤)将复合物和ha水凝胶脱水。该样品在液氮中冷冻断裂，以显示内部的孔结构。该结构溅射涂覆10-nm层的铂(hummer6.2溅射系统,anatechuda,hayward,ca)，随后使用场发射sem(jeol6700f,tokyojapan)成像。
对于用于动物体内研究的复合物的制备，将硫醇化的ha在pbs中重建至12.5mg/ml。将peg-da以100mg/ml溶解于pbs中。将mal-纤维以25mg/ml再次悬浮于无菌pbs中。该纤维首先与ha合并，令其反应10min，之后与peg-da合并以获得所希望的最终浓度。随后，立即将该悬浮液用移液管吸取入筒状teflon模具(mcmaster-carr,robbinsville,nj)中，吸取体积300μl，获得直径为11.125mm且高度为3mm的筒状模塑件作为体内研究的样品。随后将凝胶置于37℃孵化器中胶凝过夜。
为了证实ha与纤维上mal之间界面结合的效果，使用半胱氨酸淬灭纤维上的mal，以制备经淬灭的纤维-ha水凝胶复合物。简而言之，将1mg纤维分散于1ml的半胱氨酸pbs(ph8.0)溶液中，令mal与半胱氨酸的摩尔比为1至2。在温和震荡下于室温将mal淬灭12h后，以1ml蒸馏水洗涤mal被淬灭的纤维5次，以移除未反应的半胱氨酸，并冻干。
纤维-ha水凝胶复合物的机械性质：
压缩测试。使用移液管将水凝胶前体悬浮液吸取入筒状teflon模具(mcmaster-carr,robbinsville,nj)中，吸取体积为200μl，获得直径为6.35mm且高度为6.35mm的筒状模塑件进行压缩测试。随后将凝胶置于37℃孵化器中胶凝过夜。将凝胶从其模具中移除，立即使用elf3200系列的enduratec机械测试仪(series,boseelectroforce,edenprairie,mn)经由两片平行班之间的无约束单轴压缩进行测试。样品被压缩至50％应变，从应力应变曲线中10％至20％应变的直线部分的斜率测定弹性模量。每一样品测试三次，每组测试三个样品，测定平均压缩模量。为了测量再水化的纤维-ha水凝胶复合物的压缩模量，将该复合物冻干，并使用1ml的pbs(ph7.4)在37℃再水化24h。对于疲劳测试，该压缩样品以0.1hz从0％至25％应变重复循环。
流变测试。使用具有平行板(φ＝8mm)的振荡流变仪(ares-g2rheometer,tainstruments,newcastle,de)测量多种纤维-ha复合物的剪切储存模量(g’)。采用振荡扫频来监控从1hz至10hz且在10％的恒定应变下g’的变化。
纤维-ha水凝胶复合物中hasc的迁移：
在含有10％fbs、1％青霉素/链霉素、及1ng/mlbfgf的高葡萄糖dmem中培养人脂肪源干细胞(hasc)。为了最佳生长，培养基每周交换三次。为了制备hasc球状体，将50μl的hasc溶液(5.6x105细胞/ml)倾入所浇铸的微模塑琼脂糖凝胶(
将ha和pegda完全溶解于pbs(ph7.4)中，ha的最终浓度为4.5和2.5mg/ml，而pegda的最终浓度为5.0mg/ml。将预先以20μl的50％(v/v)乙醇润湿的纤维完全分散于pegda中，最终浓度为10.0mg/ml，随后将ha加入纤维与pegda的混合物中。将30μl的复合物前体溶液倾入96孔组织培养板的各孔内，并在37℃孵化以交联1h，从而避免在组织培养板表面上达到hasc球状体。随后，将具有3至5个hasc球状体的50μl复合物前体溶液倾入各孔内。在37℃交联1h后，将200μl新鲜培养基加入各孔内，每两天交换一次培养基。为了观察从该复合物内的hasc球状体迁移的细胞，分别使用alexa
纤维-水凝胶复合物的体内效能：
将硫醇化的ha在pbs中重建至12.5mg/ml。将该peg-da以100mg/ml溶解于pbs中。将mal-纤维以25mg/ml再次悬浮于无菌pbs中。该纤维首先与ha溶液合并，令其反应10min，之后与peg-da合并，以获得所希望的最终浓度。随后，立即使用移液管将该悬浮液吸取至筒状teflon模具(mcmaster-carr,robbinsville,nj)内，吸取体积为300μl，筒状模具直径为11.125mm且高度为3mm。随后将该凝胶置于37℃孵化器内胶凝过夜。选择两种配方以匹配脂肪组织的2kpa硬度。单独使用ha的配方为10mg/mlpeg-da和9mg/mlha-sh，而ha-纤维复合物配方为5mg/mlpeg-da、5mg/mlha-sh、及12.5mg/ml分散的纳米纤维。
为了研究该复合纳米材料支架的生物相容性，将它们植入sprague-dawley大鼠的鼠蹊部脂肪垫下，观察长度随时间的变化。在挥发性麻醉下，在紧邻鼠蹊部折痕的两侧作出1cm切口。进行皮下组织的钝器解剖后，暴露鼠蹊部脂肪垫。通过使用电烙器的细致止血和饲养血管的小心观察令其升高。将支架植入动物右侧脂肪垫下方。左侧不接收植入物，且用作假手术对照。两侧切口均以标准层状缝合封闭。观察动物7、14、30、及90天。在采集的时间点，牺牲动物，暴露具有和不具有支架的鼠蹊部脂肪垫并以4％pfa固化。将试样嵌入并切片，用于标准苏木精和曙红染色。
统计分析
全部结果表达为均值和标准偏差。通过实施单程anova使用sigmaplot12.0软件(spss)测定两组之间的统计显着性，认为p值<0.05是统计显着的。
本文预期制作本文中揭露的复合物100的实施形式的任何其它适当方法。
实施例2：纳米纤维-水凝胶复合物的压缩测试
对于压缩测试，形成纤维-水凝胶的直径为8.5mm且高度约4mm的筒状样品，令其在37℃磨具中固化过夜。使用boseenduratecelf3200(edenprairie,mn)经压缩测试而测定弹性模量。样品进行两块平行板之间的单轴压缩，压缩至50％应变。通过测量初始线性区域的斜率来测定弹性模量。测试两个样品组，两组具有相同的水凝胶配方，分别具有及不具有纤维。使用4.5mg/ml的硫醇化透明质酸(gylcosanglycosil)和10mg/mlpeg-da(聚乙二醇二丙烯酸酯，分子量3350)形成仅包含水凝胶的样品。纤维-水凝胶复合物组具有相同的水凝胶浓度，但额外具有6.75mg/ml的pcl纳米纤维，且该纳米纤维使用马来酰亚胺基进行表面官能化，能轻易与该硫醇化的透明质酸反应。
图2a中可见代表性应力应变轨迹。仅包含水凝胶的组的弹性模量为320pa，而纤维-水凝胶复合物的弹性模量更高，为750pa。该纤维-水凝胶复合物的增加的硬度可见于每一应变值对应的更高应力值中。官能化纳米纤维的存在极大增加了该材料的强度和硬度。因此，该复合物的整体结构可具有与靶标组织匹配的硬度，而与不利用纳米纤维而实现相同硬度所需的密度相比，该水凝胶组分的交联密度可以更低。这应导致更佳的对于给定植入物硬度的细胞响应。
随后，经由以0.1hz重复压缩至25％应变(20次循环)测试样品组。代表性轨迹可见于图2b中。这显示，水凝胶和复合物可忍受重复压缩，且该复合物比无纤维组的硬度更持久。
实施例3：细胞与材料的相互作用
为了测试细胞对于复合物水凝胶的响应，在各种具有和不具有纤维的水凝胶配方中测试脂肪源干细胞(asc)的迁移潜力。
转染asc以表达gfp，随后通过将细胞在由微组织模具制作的藻朊酸盐模具中种植过夜而将该asc形成为球状体簇。由于球状体是独特的点源且从球状体迁移的细胞可轻易测量，因此将该细胞作为球状体种植以更好地评估细胞运动性。将该球状体混入水凝胶内，之后使用移液管吸取入96孔板内，令其固化。随后在后续几天中成像该细胞并观察其迁移。由于各自增加的孔尺寸，随着透明质酸和peg-da浓度的减少，细胞能逐渐迁移得更远。在相同的水凝胶密度(4.5mg/ml透明质酸和2.5mg/mlpeg-da)下，细胞在具有分散纳米纤维的样品(12mg/ml，图3a和3b)中比在不具有纳米纤维的样品(如图3c和3d中所示)中更能迁移。这表明，官能化纳米纤维的存在不仅改善了纳米纤维的机械性质，而且有助于改善细胞迁移。
为了明确证明asc受到纳米纤维的存在的强烈影响，在对准的无水凝胶的纳米纤维片上培养asc球状体。96小时后，细胞(图3c和3d中的绿色)明显沿着该对准的纳米纤维的相同轴迁移出球状体(显示于图3d中)。
实施例4：纳米纤维-水凝胶复合物的组织相容性
为了研究该复合纳米材料支架的生物相容性，将它们植入sprague-dawley大鼠的鼠蹊部脂肪垫下，观察长度随时间的变化。在挥发性麻醉下，在紧邻鼠蹊部折痕的两侧作出1cm切口。
图5a是显示纳米纤维-水凝胶复合物在大鼠的鼠蹊部脂肪垫下原位外观的照片。图5b显示植入2周后获取的复合物周围组织切片的h&e染色图像。显示，嗜曙红叶、深粉色染色的间充质细胞迁移入纳米材料(染色为浅粉色)中。
图5c显示在第4周采集自复合物-组织界面的组织切片的h&e染色图像，该图像显示细胞浸润。使用曙红将环绕植入位点的间质组织染色为深粉色。纳米材料呈现浅粉色。浸润粉色间质细胞可见于界面处，且推定为具有明显圆形液泡的脂肪细胞。
进行皮下组织的钝器解剖后，暴露鼠蹊部脂肪垫。通过使用电烙器的细致止血和饲养血管的小心观察令其升高。将支架植入动物右侧脂肪垫下方。左侧不接收植入物，且用作假手术对照。两侧切口均以标准层状缝合封闭。观察动物2、4、及6周。在采集的时间点，牺牲动物，暴露具有和不具有支架的鼠蹊部脂肪垫并以4％pfa固化。将试样嵌入并切片，用于标准苏木精和曙红染色。在早期时间点(2周)，发现来自伤口床的间质细胞浸润该材料，表明该材料具有足够的孔隙率，令原生细胞向内生长称为可能(图5b中的深粉色染色)。
甚至在不存在外源性生长因子的情况下实现了重要的细胞向内生长。浸润细胞而不是仅环绕细胞的材料的存在，将这一复合纳米材料与目前使用的其它异质成形材料区分开来。后一种材料通过纤维囊被隔离，且因此对于软组织修复是不希望的。在晚期时间点(4周)，细胞向内生长甚至更明显具有液泡区域的外观，其可代表初期的脂肪细胞分化(图5c中的深粉色染色和明显圆形)。
实施例5：纤维-ha水凝胶复合物的设计
纤维可形成纤维状架构，该架构一般可见于原生细胞外基质中，有助于迁移和增强水凝胶的初始低机械性质。通过引入水凝胶与纤维间的界面结合(图6a、图6b)，该复合物得以强化而不减小平均孔尺寸和孔隙率(图6)，而该减小将显着阻碍细胞迁移。还预计，可通过控制水凝胶与纤维表面间的界面结合密度而调整机械性质。这里，使用马来酰亚胺(mal)制备表面官能化的纤维，以引入与硫醇化透明质酸的界面结合(ha-sh)(图6)。使用o2等离子体处理电纺聚(ε-己内酯)(pcl)纤维的表面，以在接枝聚丙烯酸(paa)之前将自由基引入纤维表面上。通过偶联剂nhs和edc活化羧基，随后n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与经活化的羧基反应(图13)。接着，将mal官能化的纤维引入由ha-sh及pegda构成的水凝胶前体溶液中，用来加工纤维-水凝胶复合物。采用ha的巯基通过与纤维上的mal基团和peg交联剂的da基团反应来形成凝胶。有趣的是，与具有相同交联密度的ha水凝胶的横截面相比，纤维-水凝胶复合物的横截面显示具有高孔隙率的纤维状3d结构(图6)。所得复合物显示纳米纤维横跨该复合物宽度和高度的均匀分布，令各向同性增强成为可能。又，再水化的纤维-ha水凝胶复合物显示99.34％的冻干后体积恢复，而ha水凝胶显示70.17％的体积恢复(图6d)。
实施例6：纤维-ha水凝胶复合物的压缩模量
首先，证实当以摩尔计的反应性基团相等时，该复合物具有其最大硬度(在剪切下)。ha上的巯基可与纳米纤维的mal基团或peg-da上的丙烯酸酯基团反应，因此当sh与(da+mal)的摩尔比约为1比1时，该凝胶显示最优的剪切储存模量。因此，对于全部后续研究维持这一比值。该凝胶进行无侧限压缩测试，以评估ha水凝胶及纤维-ha水凝胶复合物的弹性模量(图7)。该官能化纳米纤维的增强效果可见于当应变至50％时的压缩应力中(图7a)。1.0-μm纤维组的压缩应力比仅水凝胶组高3.1倍，显示机械增强的效果。该286-nm纤维组显示甚至更显着的增强效果，在50％应变的压缩应力比仅水凝胶组高4.2倍。有趣的是，当在凝胶化之前淬灭马来酰亚胺基团时，286-nm纤维的硬化效果被极大地降低至仅1.3倍于水凝胶，确认纤维与水凝胶的界面结合对于官能化纤维的增强效果是关键。此外，当未在形成复合物之前官能化286-nm纤维时，该增强效果消失，导致复合物勉强比单独的水凝胶硬。当通过配制具有更高浓度ha和peg-da的复合物来配制更硬的凝胶时，可见相同的增强效果(图7)。该界面结合也显示该复合物凝胶硬化中的剂量响应，随着加至纳米纤维表面的马来酰亚胺基团逐渐增加，导致逐渐更硬的材料，提供该界面结合的重要性的更多证据。还测试该复合物在脱水和再水化之前和之后的机械性质的改变。在压缩下对具有和不具有两种不同马来酰亚胺的官能性纳米纤维的凝胶进行机械测试。随后冻干凝胶，令其完全再水化，并再次测试压缩。全部样品在再水化之后维持其硬度，表明该复合物可能作为冻干产品而适用于临床用途。虽然单独的ha凝胶看起来似乎维持了其硬度，但不同于含有凝胶的组，该凝胶本身在脱水-再水化过程中具有显着压紧。该复合物凝胶也进行循环荷载，以测试疲劳效果，代表性轨迹显示于图10中。重复荷载至25％应变，该复合物凝胶随时间流逝维持了其硬度，且一直比单独的水凝胶硬。
实施例7：纤维-ha水凝胶复合物的剪切储存模量
除了更高的压缩模量外，该纤维-ha水凝胶复合物显示显着高于单独的ha水凝胶的剪切储存模量(图8a)。使用286-nm纤维的复合物的剪切储存模量比使用686-nm纤维的复合物高(图8c)。也证实，通过增加286-nm纤维上的马来酰亚胺表面密度，增加了该复合物的剪切储存模量，与牙髓测试下的模量相似(图8d)。通过引入其表面上具有62nmol/mgmal的纤维，该复合物显示其剪切储存模量比单独的ha水凝胶增加1.3倍。此外，使用其表面上具有147nmol/mgmal的纤维的复合物的剪切储存模量比具有62nmol/mgmal组的模量增加了1.8倍，显示了明显的剂量响应，该响应对应于纤维上的mal表面密度增加2.4倍。当在凝胶化之前淬灭纤维上的mal基团时，剪切储存模量比未淬灭的纤维相应地降低，与压缩测试中所见相似。此外，当频率增加至10hz时，复合物的剪切储存模量得以维持，同时，单独的ha水凝胶以及具有经淬灭纤维的复合物在10hz均显示不同于1hz时的剪切储存模量。物理无论纤维的表面积(直径)如何，复合物的剪切储存模量随着纤维上mal表面密度的增加而增加，表明先前观察到的纤维直径对于硬度的效果可能是马来酰亚胺密度的函数(图8d)。从mal表面密度与剪切储存模量之间的关联获得r2＝0.93的线性回归。此外，该复合物显示对于纤维载荷的剂量响应，该复合物的剪切储存模量随着官能化纤维与水凝胶组分的重量比的增加而增加(图9)。
实施例8：纤维-ha水凝胶复合物中细胞的体外迁移
假设纤维-ha水凝胶复合物比ha水凝胶提高细胞迁移，原因为(i)该复合物具有更大的孔尺寸和更高的孔隙率，当它们具有相同的机械性质时，提供用于细胞迁移的空间性；以及(ii)该复合物中的模拟ecm的纤维架构令其固有地引导细胞迁移。因此，对于证明当前假设，将人脂肪源干细胞(hasc)的球状体作为模型细胞植入ha水凝胶和复合物内部并模拟组织块，随后将hasc培养27天(图11)。选择asc的缘由是它们存在于脂肪组织中且在血管生成和脂肪细胞形成中均重要。尽管该些复合物的杨氏模量为与ha水凝胶相似的1.9kpa，但该复合物的孔尺寸比ha水凝胶大2.08倍(图16)。因此，清楚地观察到，因为更大的孔能适应容纳细胞的迁移，hasc三维地迁移至该复合物内部(图11b至11e)，同时hasc维持其球状体形状而无任何细胞迁移入ha水凝胶中(图11a)。特别地，当使用细胞粘附肽rgd改性该复合物的纤维时，细胞迁移得以显着提升(图11c)。但是，在体内设定中，因子从局部环境扩散入该复合物内应提供额外的粘合线索，以减小这一差异。一些例子中，由于pcl纤维之间的疏水作用，部分纤维轻微成簇，且观察到细胞体优先吸引该复合物内的纤维簇(图11d和11e)。此外，在相同的ha和peg-da浓度(图19)，该复合物显示比无纤维组提升的细胞迁移，显示，无论孔隙率如何，该纳米纤维本身将会固有地帮助引导细胞迁移。
实施例9：组织响应和宿主组织浸润
为了确定这些复合植入物的治疗性潜力，在大鼠脂肪垫模型中进行该复合植入物的体内测试。配制各植入物组的配方，以实现该复合物凝胶与靶标脂肪组织相同的初始2kpa硬度。因此，单独使用ha凝胶的植入物配方具有更高的硫醇化ha浓度和peg-da浓度，以匹配该纤维复合物组的硬度。尽管浓度更高，单独使用ha的植入物仍不能在研究进程中维持其形状和体积。在4周后的总体观察下，取出单独使用ha的植入物，其体积显着变小。考虑到它们的总体外观和它们对于浸润的组织学缺失，单独使用ha的系统不能被优化为能够鼓励细胞浸润并维持预设形状。但是，在90天体内测试后的总体观察下，纤维-凝胶复合植入物良好地维持了其初始形状。但是，引人注目的是，在组织学观察下，该复合物已经被如此彻底地浸润，以至于植入物与原生组织间的边界已经变得难以确定。
已经研发路易斯鼠(lewisrats)体内的软组织缺损模型，其中，使用显微手术暴露并抬起鼠蹊部脂肪垫，并将预先成形的复合物置于脂肪垫下。这一良好定义的模型对于涵盖aim3假设的全部元素和服从r21研究的规格是理想的。虽然这并未直接表明此复合物用于修复大缺损的能力，当将建立原理证明并证实该复合物设计的全部基本功能，且为用来测试大多数临床相关模型中大缺损修复的较大动物模型奠定基础。
在预备研究中，以相似模量将pcl纳米纤维-ha水凝胶复合物和ha水凝胶植入8至12周龄雄性路易斯鼠(每一时间点，n＝3)的鼠蹊部脂肪垫下。在移植后14天和30天，ha水凝胶组和复合物组均显示良好的组织相容性(图12，pod14，在pod30具有相似的观察结果。pod＝手术后日期)。在pod30的组织学并不显示比假手术组更高水平的炎性响应。h&e和masson’s三色染色显示原生脂肪穿过该复合物的分隔作用和细胞浸润、周界附近的毛细管形成、及原生脂肪的腺体以及脂肪细胞部分的再生(图12)。另一方面，ha水凝胶对照组缺乏细胞浸润并形成薄片纤维组织和异体响应。这一ha水凝胶制备为2kpa，以确保足够的机械性质。这一结果突出了支架孔隙率对于细胞浸润的重要性。
在早期时间点(2周)，发现来自伤口床的间充质细胞浸润该材料，表示该材料具有足以令原生细胞向内生长称为可能的孔隙率(图12中的深紫色染色)。重要的是，甚至在不存在外源性生长因子下实现细胞的向内生长。细胞浸润材料而非仅环绕该材料的存在，将此复合纳米材料与目前使用的其它异质成形材料区分开来。后一种材料通过纤维囊被隔离，并因此对于软组织修复较不合适。在晚期时间点(4周)，细胞向内生长甚至更明显，具有可能表示初期脂肪细胞分化的液泡外观。
实施例10：肝素化制剂
还使用接合至透明质酸的肝素制备了复合制剂。与上述预先形成的支架同样进程该制剂的体内测试。在第7、14、30、和90天收获组织(n＝3)。多数相关生长因子具有肝素结合域，如bfgf、pdgf、和vegf。所接合的肝素可服务于两个目的；首先，其可结合可能存在于注射位点的多数外源性生长因子，并用作再生组织的局部蓄积池和吸引线索。其次，该肝素化的制剂可用来预载荷具有生长因子的支架，以更好地加强再生。在第7和14天，肝素化的支架显示比未肝素化复合支架提升的血管生成，但第30和90天的结果相近。
实施例11：可注射制剂
水凝胶-纳米纤维复合也配制为可注射制剂。将200μl与用于体内的预先形成的复合物相同的组成(5mg/ml硫醇化ha、5mg/mlpeg-da、12.5mg/ml纤维)混合，并令其在注射器中部分固化8至10min。此时，该复合物是粘稠的可流动液体，其可通过外科手术针注射(图20)。注射后，当该复合物翻转时维持其形状，且当浸没于水中时是非色散性的、维持形状、且不膨胀/低膨胀的。为了测试该可注射复合物的生物相容性，随后通过21-gauge针将该悬浮液注射入鼠蹊部脂肪垫。随后，在第7、14、30、和90天收获组织(n＝3)，并进行与前述实施例相同的分析。该复合物在第30天表明广泛的细胞重塑，同时维持体积且不造成纤维囊化。在该复合材料中清晰可见早期脂肪细胞的发展。
实施例12：实施例5至11的讨论
由于水凝胶的促进细胞迁移的3d水合环境和高孔隙率，水凝胶作为用于组织缺损再生的填充材料已经被广泛研究。但是，由于水凝胶可被体液和内部及外部应力轻易地降解和崩溃，水凝胶的相对弱的机械性质不足以在组织再生的整个期间内维持其体积，因此水凝胶已经被证明是大体积缺损的极差替代物。为了改善水凝胶的机械性质，该领域已经采用的主要策略为(i)增加水凝胶前体的浓度，(ii)增加水凝胶内部交联网络的密度，以及(iii)引入增强材料，如通过包埋羟磷灰石颗粒或与纤维片层压[materchemphysics,2008,107,364-369；biomaterials2006,27,505-518；actabiomaterialia2010,6,1992-2002]。不幸的是，这些非常强化的策略固有地降低所得水凝胶的平均孔尺寸和孔隙率，防止细胞迁移进入这些水凝胶的可能性。因此，寻找通过仍将维持允许快速细胞浸润的高孔隙率的新机制来强化水凝胶的方法。通过引入将强化整体水凝胶复合物同时保留尽可能完整的水凝胶相(包括孔隙率)的官能化纳米纤维而设计复合材料。因为两个关键因素，所得纤维-水凝胶复合物比先前软组织复合物有所改善。首先，需要将该纳米纤维以高载荷水平均匀地分散于水凝胶内，以实现各向同性强化。该组织工程学领域已经使用纤维平片或垫形式的电纺纳米纤维。随后，通过使用水凝胶前体溶液浸渍该垫，将这些制作为复合物。
这极大地约束了纳米纤维在整个水凝胶中的分散，且将该复合物的几何形状限制为2d片状或管状。尽管这些几何形状可用于某些应用如神经修整或伤口敷料中，但它们是用于修整大体积缺损的极差选择。通过低温球磨该纤维片，可能将平均纤维长度减小至足够短的长度，该长度令它们保留在水性溶液中的悬浮液中。因此，随后使用移液管将该样品轻易地吸取至水凝胶前体溶液内，创建纳米纤维片段在整个水凝胶内的均匀悬浮液，之后凝胶化。随后，该溶液可直接用作可注射制剂，或加至模具中以形成任何几何形状的支架凝胶，不同于大多数电纺纳米纤维筛网的受限的平面几何形状。分散于水凝胶内的纤维的复合结构也概况了细胞外基质的纤维性架构(图6g)，提供可辅助该复合物内细胞迁移的粘附位点。
其次，将纳米纤维简单分散于水凝胶内足以形成强健的复合物。这些数据表明，仅包括该纳米纤维本身提供了对于该复合物弹性模量的非常小的改善，且改善仅在引入界面结合时出现。因为无法在水凝胶与纤维组分之间形成强健链接，水和水凝胶组分可滑动越过纤维组分而不将载荷转移至更硬的材料，因此界面结合是必需的。此外，此类不相干材料间的界面可导致层离和复合物的失败。再者，pcl的初始疏水性令其难以分散于水性溶液中，因为纤维优先聚集在一起并形成从悬浮液中沉降的凝块。等离子体处理和后续的使用羧酸基团和氨基进行的官能化，极大增加了纤维的亲水性并允许分散。仅在纤维表面上马来酰亚胺基与透明质酸分子上巯基之间出现界面结合时，出现机械性质的急剧增加。这一共价强度结合在压缩或拉伸过程中将载荷更有效地转移至纤维，导致更硬、更强健的材料。而且，该复合物显示弹性模量随着马来酰亚胺基密度增加而增加的强烈倾向，强调其在强化机制上的首要性，以及该增强的可调特性。
本研究中，认为通过各种因素调节纤维-水凝胶复合物的机械性质是可能的，该因素包括纤维的总表面积、纤维表面上官能性马来酰亚胺基的密度、及载荷于水凝胶内的纤维的量。首先，具有较小直径的纤维的复合物显示比具有较大直径的纤维的复合物更高的压缩模量和剪切储存模量(图7a和图8c)。同样，在文献中，使用戊二醛进行等离子体活化的单一超高分子量聚乙烯(uhmwpe)纤维(～25μm)，显示其在聚乙烯醇水凝胶中的界面剪切强度比uhmwpe纤维束中的界面剪切强度60增加约2.36倍[actabiomaterialia2014,10,3581-3589]。因此，减少纤维直径并因此增加纤维比表面积可有效改善复合物的机械性质，这是可能的。但是，每一纤维组具有略微不同的纤维上mal表面密度(约10至15nmol/mg)，因此，不能最后确定这仅是纤维表面积的效果。因此，其次，使用直径相同但纤维上mal表面密度不同的纤维来加工复合物(图8)。复合物的压缩模量和剪切储存模量随着纤维上mal表面密度的增加而增加。证实，通过使用paa步骤(纤维上羧基)但不采用进一步的mal接合步骤进行改性的纤维，通过不具界面结合的复合物仅显示其压缩模量的略微提升(图7)。通过在凝胶化之前使用半胱氨酸淬灭纤维上的mal基团，额外证实了界面结合的重要性。半胱氨酸接合至马来酰亚胺基，并阻止纤维与水凝胶之间的界面结合，由于纤维被同样处理为界面结合基团，这刚好令我们分离界面结合的效果。有趣的是，具有mal被淬灭的纤维的复合物的机械性质被剧烈削弱(图7a和图8b)，且当ha的浓度为10mg/ml时，mal被淬灭的纤维组显示比单独使用ha水凝胶组更低的压缩模量(图7)。可能mal被淬灭的纤维通过纤维与水凝胶界面处的早期层离而弱化了整体复合物，如先前研究中所见[actabiomaterialia2014,10,3581-3589]。又，与由一种组分构成的或在凝胶化过程中无任何相异物质的纯水凝胶相比，不具官能团的纤维可能作为抑制凝胶化的相异物质而起作用[jmcb2015,doi:10.1039/c3tb21830a,journalofbiomedicalmaterialsresearchparta2010,95(2),564-573]。此外，通过具有不同mal表面密度的复合物，验证了剪切储存模量与界面结合密度之间的关系(图8c)。这些研究提供了强有力的证据证明，水凝胶的机械性质将通过界面结合而得以增强和调节。第三，复合物的剪切储存模量随着纤维与水凝胶的重量比的增加而得以提升(图9)。从而证实，该重量比是可用来调整纤维-水凝胶复合物的机械性质的另一变量。但是在这里证实，随着纤维载荷的增加，在重量比大于0.6时，该剪切储存模量的增加开始趋于平缓，甚至略微下降。这一饱和效应的一种可能性可为，通过如何令过量的具有mal的纤维与更多的ha巯基反应，防止它们与用于凝胶化的pegda反应，从而减小复合物界面结合的密度。考虑到使用等摩尔量的ha-sh与pegda的各官能团以及使用过量的ha-sh或da来降低剪切储存模量，获得了ha水凝胶的最高剪切储存模量(图14a)，随着纤维的量的增加，纤维上过量的mal将会中断复合物内sh至da的结合。
通常，植入的生物材料必须抵抗组织缺损再生过程中的无数内部和外部应力。尽管该应力并不严重也不连续，仍在重复条件及高频率(10hz)下实施抗应力测试，以模拟该应力(图10和图8)。在重复压缩应变过程中，ha水凝胶和纤维-ha水凝胶复合物均抵抗而未对其机械强度造成任何损害或降低。注意，具有界面结合的复合物在10hz频率维持其剪切储存模量，而ha水凝胶和不具界面结合的复合物在10hz的剪切储存模量被削弱。这一趋势表明，与所分散纤维的界面结合对于该复合物机械性质的增强是关键。此外，纤维-ha复合物在进行冻干和后续再水化后维持其维度和杨氏模量，而单独的ha凝胶在相同过程下基本萎缩(图6c和图10)。这一在脱水和再水化后对形状、体积和硬度的维持，是这一技术用于临床的重要特征，盖因具有复合物的冻干形式将会令该商品更容易消毒和储存。
对于软组织修复，理想的植入支架将会立即填充缺损空洞，但也将用作身体自身细胞在该支架内生长、增殖和分化为适宜组织表型的基底，最终以正常的健康组织替换该人造支架。因此，相关细胞将能迁移入水凝胶或复合物支架内以确定相关细胞类型在该支架内迁移的潜力极其重要，将hasc球状体种植在ha水凝胶和纤维-ha水凝胶复合物内，并评估它们的细胞迁移。因为ha水凝胶太软而无法作为用于细胞迁移的牵引力，hasc不会在单独的ha水凝胶内迁移(图11a)[biomaterials2015,42,134-143]。有趣的是，尽管复合物的剪切储存模量与ha水凝胶类似，但hasc能显着地迁移远离复合物内的球状体(图11)。一个假设为，与脂肪组织的原生ecm的原纤维组分类似，复合物内的纤维可能提供粘附位点以引导细胞迁移。先前已经表明，对准的和随机的纤维将是多种细胞类型的细胞粘附、增殖、分化、和迁移的关节因素[biomaterials2005,26,2537-2547/2006,27,6043-6051/2009,30,556-564/2010,31,9031-9039,actabiomaterialia2013,9,7727-7736]。尤其观察到，细胞将纤维认作引导基质，盖因它们的细胞骨架与下方纤维对准并追随下方纤维[biomaterials2006,30,6043-6051/2009,30,556-564]。但是，复合物内纤维的直径并不影响迁移中的细胞，因为无论在具有1000-nm或286-nm纳米纤维的复合物中，它们都坚定地迁移(图19)。
在小型测试和体外细胞培养中可见的孔隙率效果和细胞迁移效果转化为该复合物体内测试过程中的深刻差异。配置为模拟脂肪的2kpa硬度且不具纤维的水凝胶具有的孔隙率太低而无法进行细胞浸润。该细胞响应将水凝胶与厚层胶原隔离，从而缺乏异体响应中典型的浸润或重塑。但是，纳米纤维-水凝胶复合物具有足够孔隙率，以促进细胞向内生长、血管化、和细胞重塑而无异体响应。这提供如下预期：终将以身体自身组织永久性填充身体内的大体积缺损。使用可注射制剂的结果甚至更明确，其可形成与宿主组织的更紧界面，且显示坚定的脂肪生成的迹象。
结论：
官能化纳米纤维在水凝胶内的分散，形成具有两种组分的组合强度的复合物结构。纳米纤维与水凝胶组分之间的界面结合，对于制作强健的、同时维持高孔隙率和孔尺寸以促进组织和细胞向内生长的复合物是关键。通过改变纤维直径、纤维载荷水平、马来酰亚胺密度水平、和水凝胶组分的载荷水平，可轻易调节所得复合物的性质。这允许在目标整体硬度下实现更低交联和更高孔隙率，增加细胞浸润和后续的组织重塑。该纤维本身也可通过提供类似于原生ecm中可见者的粘附位点，而直接改善细胞迁移。可调节所得复合植入物以匹配原生脂肪组织的硬度，仍维持用于细胞浸润和重塑的渗透性。这一新颖的复合物强度足以立即填充任何形状的大体积缺损。随后，该复合物用作令身体自身细胞浸润入该复合物中、形成血管且分化为细胞如脂肪细胞的宽容性支架,。该支架将在组织重塑过程中缓慢降解，直至初始的缺损孔洞被正常的健康组织完全替代。该复合机构具有极大的重建潜能和美容外科潜能。
等効者
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