用于再生口腔粘膜的生物材料支架的制作方法

发明领域本发明属于组织工程领域，更具体地属于适用于再生、修复和/或替代软组织的生物材料。背景近年来，医学和牙科研究开发了一种名为“组织工程”的新的、大有希望的知识领域。这一创新领域的主要目的是为了被各种因素诸如受伤、烧伤、被获得性疾病诸如癌症或某些先天性异常损伤的人体的实际组织和器官的生物人造再生、修复或更换。组织工程主要基于三个基本组成部分：1)细胞，2)生物材料，3)生物分子、诱导剂或生长因子。在生物材料的情况下，它们用于生物系统的产生并应用于各种医学分支。除了其他特征之外，这些材料由于其与活组织的永久接触而是生物相容的。因此，防止在组织-材料界面中发生不希望的反应并且在生物材料执行其功能的整个时间段内维持生物材料的性质是至关重要的。目前的研究着重于理解材料的物理化学性质、机械性质之间的具体相互作用以及观察细胞行为如细胞因子和生长因子粘附、活化和释放。今天，有大量不同的生物材料，这些生物材料可根据其组成被归类为天然或合成的聚合物、金属或陶瓷生物材料。在组织工程中，因为生物材料作为人造细胞外基质起作用，所以它们必须有利于细胞的生物和机械功能。结果，生物材料可为细胞提供三维空间以形成具有合适结构和功能的新组织。在软组织缺陷中，由于口腔粘膜的复杂结构，该组织修复代表了挑战性和必要的任务。考虑到需要获得有效修复所产生的缺陷的合适覆盖面，因各种外科手术、损伤或其他临床状况导致的口腔粘膜损失是一个真正的问题。目前关于这一需要采用的解决方案包括应用来自不同供体部位和来源的移植物。然而，这些移植物呈现并发症，例如排斥(同种异体移植物、异种移植物)、供体部位发病(自体移植物)、原始组织特征的维持、提供足够的结构性质以允许新的组织发育同时防止周围组织的塌陷、功能受限，并且在美学上不具吸引力。这些影响使得有必要产生在解剖学和美学上与受体部位相似的功能性生物学替代物。现在，许多研究小组集中研究开发提供类似于天然组织的组织学结构的新的生物材料，其在被移植后被有效地整合到所述天然组织中，用功能性组织替代受影响部位的受损组织。这些生物材料的创建目前被认为是解决包括排斥和有限量的组织的这些问题的最佳替代方案。用于口腔粘膜再生的生物材料必须具有机械和结构性质，例如通透性、稳定性、弹性、柔韧性和可塑性，并且必须适应不同的期望形式，即在片材中，作为凝胶或固体三维结构。理想情况下，它们还必须通过促进周围细胞和生长因子归巢于受伤部位来诱导新的组织形成，同时当新的组织重建进展时材料降解。wo03/007873公开了一种冷冻干燥的生物相容多孔基质，其包含在凝血酶、因子xiii和氯化钙的存在下从纤维蛋白原交联的纤维蛋白。该基质可另外包括辅助成分，例如多糖，并且可以用作植入物。发明简述本发明的作者开发了一种新的生物材料，其特征在于具有大孔支架结构，该结构为所述材料提供高强度，其溶胀态易于处理并且具有稳定性、弹性、柔韧性和可塑性，因为它可在施加变形力后恢复其形状。此外，本发明的生物材料已经显示出在其溶胀态下耐受缝合过程而不破裂或破坏，这确保了正确固定到受损组织。生物测试还指出了生物材料与细胞，特别是人成纤维细胞、角质形成细胞、干细胞和与软组织和口腔粘膜修复相关的其它细胞类型的正确相互作用以及缺乏对所述细胞的细胞毒性。此外，本发明的生物材料已经在体内模型中进行了测试。结果证实毒性事件的不存在和合理的随时间降解率。此外，生物材料在植入后的早期阶段提供新生血管形成的明显迹象，并显示与周围组织的充分的相互作用，使其能够定殖本发明的生物材料。该生物材料通过冻干包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶合成。因此，本发明的第一方面涉及用于生产生物材料支架的方法(从现在开始的方法1)，所述方法包括：a)提供包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶；b)使步骤a)的水凝胶经受冻融过程以物理交联所述水凝胶；和c)将进行步骤b)之后获得的物理交联的水凝胶进行冻干。本发明的第二方面涉及通过如上文所定义的方法1可获得的生物材料支架。由本发明方法的步骤b)得到的水凝胶由于应用冻融过程可推论的物理交联而为本发明的生物材料赋予改善的机械性能。该冻融步骤提供具有互穿网络的水凝胶。因此，本发明的另一方面涉及用于制备具有互穿网络的物理交联的水凝胶的方法(从现在开始的方法2)，所述方法包括：a)提供包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶；和b)使步骤a)的水凝胶经受冻融过程。本发明的另一方面涉及通过如上文所定义的方法2可获得的具有互穿网络的物理交联的水凝胶。本发明的另一方面涉及用于医学用途的如上文所定义的生物材料支架。本发明的第四方面涉及用于部分或完全增加、恢复或替代患病或损伤的软组织的功能活性的用途的如上文所定义的生物材料支架。在特定的实施方案中，所述软组织是口腔粘膜。本发明的另一方面涉及包含如上文所定义的生物材料支架的药物组合物。本发明的另一方面涉及包含如上文所定义的生物材料支架的化妆品组合物。本发明还涉及部分或完全增加、恢复或替代患病或损伤的软组织的功能活性的方法，所述方法包括向人或动物施用治疗有效量的如上文所定义的生物材料支架。本发明的另一方面涉及如上文所定义的生物材料支架在医学中的用途。本发明还涉及如上文所定义的生物材料支架部分或完全增加、恢复或替代患病或损伤的软组织的功能活性的用途。附图简述图1.具有不同琼脂糖浓度的纤维蛋白和琼脂糖凝胶的扫描电子显微镜显微照片：a)0.2％；b)0.4％；c)0.6％。子索引1、2和3分别对应于不同的比例50x、150x和1500x。图2.更详细地显示具有不同琼脂糖组成的材料的结构的扫描电子显微镜显微照片。上行：1.500x。下行：20.000x。a)0.2％琼脂糖；b)0.4％琼脂糖；c)0.6％琼脂糖。图3.获得的本发明的水凝胶的细节：(a)根据本发明方法1的步骤a)；(b)根据本发明方法1或2的步骤a)和b)。图4.溶胀生物材料的细节及其处理。图5.缝合末端后生物材料的细节。图6.在本发明的生物材料(0.2％琼脂糖)中培养的人成纤维细胞的绿/红荧光显微照片。a、b和c：分别培养24、48和72小时后。a、b和c对应于比a、b和c更高的显微照片放大倍数。比例尺对应于200微米。图7.在本发明的生物材料(0.4％琼脂糖)中培养的人成纤维细胞的绿/红荧光显微照片。a、b和c：分别培养24、48和72小时后。a、b和c对应于比a、b和c更高的显微照片放大倍数。比例尺对应于200微米。图8.在本发明的生物材料(0.2％和0.4％琼脂糖)上培养的人成纤维细胞的细胞存活率。这些值表示细胞存活率与对照(100％)相比的百分比。虚线标记了根据iso10993：5的细胞毒性极限。图9.根据本发明的阳性对照(刺激物)、阴性对照(参考存活率)和样品(biom1和biom2)的存活率百分比。虚线表示在这种刺激模型中使用的极限。高于该行的值被认为是非刺激物，而低于该行的值被认为是刺激物。图10.大鼠中材料植入部位的图和不同时间生物材料外植体的图像：a)7天；b)14天；c)30天和d)60天。图11.整个测试时间内生物材料外植体的肉眼图像：a)7天；b)14天；c)30天和d)60天。图12.整个测试时间(7、14、30和60天)外植体的组织学图像。图13.小型猪模型中口腔粘膜缺损的体内概念验证：a)拔牙后口腔粘膜缺损。b)将本发明生物材料植入在粘膜缺损中。c)生物材料植入后用可吸收缝线闭合缺损。d)从动物颌扫描藻酸盐铸造模型(alginatecastmodel)和通过orthoviewer图像分析软件进行图像分析的实例。发明详述本文所用的术语“生物材料”是指天然或合成的生物相容性材料，其适于植入活组织中，并且在患者或受试者中执行、增强或替代天然功能。根据本发明的生物材料特别适用于通过在植入病变部位后再生组织来再生、替换和/或修复软组织缺损或损伤。术语“支架”理解为由通过大分子缔合形成的网络构成的高度多孔的三维结构。大分子之间的这种缔合是由强相互作用或弱相互作用(如共价键)化学地提供的。这种缔合导致化学交联网络。作为方法1的步骤b)的进行的结果，还在物理上提供了大分子之间的缔合，导致物理和化学交联网络。因此，在本发明中，生物材料支架是指具有支架结构的如上文所定义的生物材料。如前所述，用于生产生物材料支架的本发明的方法1包括：a)提供包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶；b)使步骤a)的水凝胶经受冻融过程以物理交联水凝胶；和c)将进行步骤b)之后获得的物理交联的水凝胶进行冻干。本发明方法1的第一步包括提供包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶。术语“水凝胶”在本领域中是众所周知的，并且被理解为具有水作为液相的凝胶，所述液相被捕获在通常称为固相的凝胶中。该固相构成捕获液相并阻止其流动的网络。在本发明方法的第一步中提供的水凝胶包含纤维蛋白网络。术语“纤维蛋白网络”、“纤维蛋白基质”、“纤维蛋白生物基质”、“纤维蛋白基支架(fibrin-basedscaffold)”、“纤维蛋白支架”、“纤维蛋白凝胶”、“纤维蛋白粘合剂(fibrinadhesive)”和“纤维蛋白密封剂(fibrinsealant)”在本领域中通常可互换使用，指在凝血因子和ca++来源的存在下由纤维蛋白原的聚合产物产生的三维网络。这种纤维蛋白基质在损伤后由身体天然地提供，但也可被工程化为组织替代物。因此，在具体实施方案中，通过在至少凝血因子和钙源的存在下聚合含纤维蛋白原的材料获得纤维蛋白网络。在优选的实施方案中，含纤维蛋白原的材料是同种异体或异种来源的。然而，它也可以是自体来源的。纤维蛋白原是存在于血浆中的高分子量蛋白质。因此，用作产生纤维蛋白网络的起始材料的含纤维蛋白原的材料可以是血浆或血浆衍生物，诸如，例如但不限于冷沉淀物(cryoprecipitate)或纤维蛋白原浓缩物。在这种情况下，凝血因子也存在于血浆中，特别地，凝血因子是凝血酶。凝血酶是引起纤维蛋白原分子破裂成低分子量多肽和纤维蛋白单体的蛋白水解酶。所述单体聚合成二聚体并随后通过先前由凝血酶活化的因子xiii的作用和在钙离子的存在下通过共价键而彼此结合。用于制备纤维蛋白网络的纤维蛋白原的浓度可以变化，并且包括范围从1mg/ml至多达约200mg/ml的浓度(水凝胶中的最终浓度)。在优选的实施方案中，以约1至5mg/ml的浓度加入纤维蛋白原。此外，纤维蛋白原可与任何适当浓度的凝血因子组合。优选地，凝血因子是凝血酶。以范围从约0.1iu/ml至约300iu/ml的不同浓度加入凝血酶。优选地，凝血酶与纤维蛋白原的比例范围从约0.001至约100，更优选地从约0.01至约10，甚至更优选地从约0.1至约1。在具体实施方案中，水凝胶包含最终浓度为从约1至约100mg/ml的纤维蛋白原和最终浓度为从约0.5iu/ml至约250iu/ml的凝血酶。在具体实施方案中，含纤维蛋白原的材料的聚合也在其它凝血因子的存在下进行。术语“凝血因子”是指存在于血浆中并参与使得能够凝结的链式反应的组分，通常是蛋白质。用于本发明的合适的凝血因子包括但不限于因子iii(组织因子或促凝血酶原激酶)；因子iv；因子v(促凝血球蛋白原(proaccelerin)或不稳定因子)；因子vi、因子vii(稳定因子或前转化素(proconvertin))；因子viii：(抗血友病因子a或血管性假血友病因子(vonwillebrandfactor))；因子ix(抗血友病b或克雷司马因子(christmasfactor))、因子x(stuart-prower因子)、因子xi(血浆促凝血酶原激酶前体(plasmathromboplastinantecedent))：因子xii(hageman因子)、因子xiii(纤维蛋白稳定因子)、血管性假血友病因子、高分子量激肽原(hmwk或fitzgerald因子)等。因此，在使用血浆或血浆衍生物作为含纤维蛋白原的材料的情况下，在其中含有纤维蛋白原聚合所需的全部分子，且通过加入钙源可由血浆形成纤维蛋白网络。在优选的实施方案中，钙源是钙盐，例如但不限于氯化钙、葡萄糖酸钙或其组合。钙盐的浓度应足以诱导纤维蛋白原的聚合。在更优选的实施方案中，钙盐是氯化钙。在更优选的实施方案中，氯化钙的浓度为0.1至3g/l。然而，也可使用更低或更高的浓度。在具体实施方案中，首先将含纤维蛋白原的材料在水或盐水溶液如pbs中稀释。纤维蛋白聚合物可通过称为纤维蛋白溶解的过程而降解。在纤维蛋白溶解期间，纤溶酶原被组织纤溶酶原激活剂(tpa)转化为活性酶纤溶酶。纤溶酶通过其结合位点结合至纤维蛋白表面，导致纤维蛋白的降解。为了防止水凝胶的纤维蛋白溶解，纤维蛋白原的聚合可在抗纤维蛋白溶解剂例如但不限于ε-氨基己酸、氨甲环酸或抑肽酶的存在下进行。在优选的实施方案中，抗纤维蛋白溶解剂是氨甲环酸。氨甲环酸是氨基酸赖氨酸的合成衍生物，对纤溶酶原中的赖氨酸结合位点具有高亲和力，能够阻断这些位点并阻止纤溶酶原激活剂与纤维蛋白表面的结合，发挥抗纤维蛋白溶解作用。氨甲环酸优于动物来源的其它抗纤维蛋白溶解剂，因为它不传播疾病。在优选的实施方案中，水凝胶中氨甲环酸的浓度为0.5至2g/l，优选为1至2g/l。然而，也可使用更低或更高的浓度。纤维蛋白网络是非常通用的，因此它们已被用于开发不同的人造组织。然而，这些的临床应用受到限制，主要是由于一致性低、处理困难和脆性大的事实。为此，本发明方法的步骤(a)中提供的水凝胶还包含多糖网络。通常，多糖用于提供组织的强度和一致性(consistency)，并且应该溶于其中。本文所用的术语“多糖网络”是指由多糖的物理胶凝产生的三维网络。多糖网络通常形成物理凝胶，即不由组分之间的化学键，而是由低能量键(范德华力、氢键、极性键、离子键等)稳定的凝胶。多糖可以是能够形成凝胶的任何多糖，优选通过温度变化，并且可选自由以下组成的组：琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、壳聚糖、魔芋(konjac)、卡德兰胶(curdlan)、角叉菜胶、果胶、结冷胶和藻酸盐。本领域技术人员将理解，这种胶凝的多糖有利地包括一种多糖，但是本发明还包括两种或更多种多糖的混合物。在本方法的有利实施方案中，多糖是琼脂糖。本领域技术人员将理解，多糖胶凝和多糖网络形成的合适条件将取决于其性质。因此，在使用琼脂糖作为多糖的优选情况下，将温度降低到低于琼脂糖浓度的胶凝温度是足够的。该温度可由本领域技术人员从将样品中琼脂糖浓度的胶凝温度相关联的表中容易地确定(例如，可在http://www.lonzabio.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/lonza_benchguides_sourcebook_appendix_b_-_agarose_physical_chemistry.pdf获得的表在其它实施方案中，本发明考虑使用修饰的琼脂糖，包括但不限于甲基琼脂糖、羟乙基琼脂糖、羟丙基琼脂糖、烯丙基琼脂糖、乙酰基琼脂糖等。在优选的实施方案中，琼脂糖是低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖是市售可获得的，例如超纯(r)琼脂糖(invitrogen)、nusieve(r)gtg(r)琼脂糖(lopza)、lm琼脂糖和lmsieve琼脂糖(pronadisa)、琼脂糖servapremium(serva)等。在多糖网络由琼脂糖形成的情况下，多糖网络的形成在10-37℃，优选15-25℃，最优选20-25℃的混合物的温度下进行。在优选的实施方案中，多糖网络由琼脂糖形成。在另一个优选的实施方案中，水凝胶中琼脂糖的浓度为约0.05％-1％，优选为0.2％-0.6％。因此，本发明方法的步骤(a)中提供的水凝胶通过进行纤维蛋白原向纤维蛋白的交联反应和诱导多糖的胶凝而获得。本领域技术人员将理解，两种反应可同时进行或以任何顺序进行，即，纤维蛋白原聚合成纤维蛋白可首先进行，然后是多糖的胶凝，或多糖的胶凝可首先进行，然后是纤维蛋白原聚合成纤维蛋白网络。在具体的实施方案中，首先通过将含纤维蛋白原的材料置于足以形成纤维蛋白网络的条件下形成纤维蛋白网络，然后通过使第一网络与含有多糖的溶液接触并将该混合物置于足以形成多糖网络的条件下形成多糖网络。在通过琼脂糖形成多糖网络的特定情况下，可通过将混合物置于低于琼脂糖熔点的温度下来实现琼脂糖网络的形成。这种温度可由技术人员通过参照所使用的特定琼脂糖类型的熔化曲线来确定而无需进一步的实验。然而，在优选的实施方案中，包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶通过首先混合含纤维蛋白原的材料、凝血因子、缓冲盐溶液(优选pbs)和任选的抗纤维蛋白溶解剂来形成。向该混合物同时加入多糖和钙源，使得在将所得混合物经受足以使所述多糖胶凝的条件下，例如在低于多糖的熔点的温度下，使得纤维蛋白网络和多糖网络同时形成。在更优选的实施方案中，含纤维蛋白原的材料是血浆，凝血因子是血浆中包含的凝血酶，多糖是琼脂糖，且钙源是氯化钙。本发明方法1的第二步(步骤b)包括使步骤a)的水凝胶经受冻融过程。这种冻融过程诱导水凝胶的物理交联，其结果是水凝胶改善其机械性能，特别是提供具有更高强度、也易于处理的水凝胶。冻融技术包括水凝胶的至少一个冻融循环，但优选通过使用一系列冻融循环实现水凝胶的物理交联。作为水凝胶的冷冻、任选冷冻状态下储存和随后的融化的结果，形成冷冻凝胶(cryogel)。该冷冻凝胶的特征在于具有大孔结构。在冷冻期间，形成溶剂(水)的主体(mainbulk)的结晶。融化后，形成冷冻凝胶或冷冻结构。随着水向冰的转化增加聚合物浓度的聚合物链的强制排列可提供形成并排缔合(其然后在融化时保持完整)作为凝胶的接合区的机制。物理交联凝胶的三维结构主要由聚合物网络的接合区中的多个链间氢键稳定。通过改变低温处理的方式，如温度和冷冻持续时间、融化速率、再冷冻循环次数，可能调节和调整最终凝胶的性质及其宏观和微观结构。特别地，冷冻凝胶的稳定性和机械性能随着冷冻时间和冻融循环的增加而增加。在具体实施方案中，将本发明方法步骤a)中获得的水凝胶在包括-30℃至-15℃，更优选约-20℃的温度下冷冻至少6小时，更优选至少12小时以进行冷冻步骤。随后，将冷冻的水凝胶在室温，通常在20和25℃之间，融化2至6小时，更优选约3小时。虽然仅一个冻融循环足以为水凝胶提供物理交联，但建议进行几次冻融循环，优选2至5个循环。在具体实施方案中，本发明的方法1还包括洗涤由本发明方法1的步骤b)得到的物理交联的水凝胶。进行冻融过程后由步骤b)产生的水凝胶可简单地用水洗涤，以除去不形成所得材料的三维结构的一部分的任何化合物或物质。例如，在使用血浆作为含纤维蛋白原的材料的情况下，该洗涤步骤导致去除存在于血浆中的不被物理或化学地与生物材料的结构缔合的那些物质。洗涤步骤后，所得水凝胶白色无臭。本发明方法1的步骤c)是指冻干由步骤b)得到的物理交联的水凝胶，以获得本发明的生物材料支架。从药物的角度来看，使生物材料以冻干形式可获得是重要的，因为这提高了其在储存过程中的稳定性。此外，冻干允许为生物材料提供受控的孔隙率、高强度、易于在其溶胀态下处理并具有稳定性、弹性、柔韧性和可塑性，因为它可在施加变形力后恢复其形状。此外，本发明的生物材料已经显示出在其溶胀态下经受缝合过程而不破裂或破坏，这确保了对受损组织的正确固定。水凝胶可通过本领域技术人员已知的任何方法冻干，例如在浓度为5％的冷冻保护剂如葡萄糖、蔗糖或海藻糖的存在下。事实上，本发明的生物材料具有另外的优点，即可将其冻干并重新悬浮而不改变其特征。然而，用于冻干的冷冻方法影响生物材料的孔径。以逐渐冷冻诸如-1℃/分钟的冻干物中的孔径较大，且快速冷冻(例如直接从室温至-80℃)的冻干物中的孔径较小。对于用于冻干的相同的冷冻方法，看出具有较高琼脂糖浓度例如0.4％和0.6％的凝胶，具有更相似的结构，而具有较低琼脂糖浓度例如0.2％的冻干物具有明显较大的孔径。对于相同的琼脂糖浓度和不同的冷冻方法，看出冻干中缓慢的逐渐冷冻为生物材料提供了均匀孔隙分布和更好的视觉外观。事实上，每单位面积的孔隙比例是不同的，对应于1：2的比例(慢速冷冻：快速冷冻)。这转化为以下事实：与逐渐冷冻的冻干物相比，快速冷冻的冻干物每单位面积具有两倍的每单位面积的孔隙。因此，快速冷冻的冻干物中的孔隙较小。因此，在优选的实施方案中，冻干过程通过使水凝胶以0.5℃/分钟至5℃/分钟的逐渐冷冻速率进行。所得到的冻干生物材料还可随后进行灭菌过程而不影响其稳定性。所述方法包括例如将γ辐射应用于冻干产物。灭菌方法是本领域技术人员公知的，并且是为了能够在需要灭菌产物的应用中使用生物材料(如本发明的情况中)而进行的。本文描述的方法提供了显示相对于用于再生软组织的其它生物材料，特别是相对于按照诸如wo2011/023843和wo2013/072409中描述的那些的方法获得的紧密的生物材料的有利性质的生物材料。特别地，生物材料表现出具有适当的互连或交联的高度多孔结构，以确保营养供应和细胞废物消除。此外，所得生物材料可容易地溶胀，能够以其干重的10至30倍之间的比例(取决于其初始组成)吸收液体。在其溶胀状态下，它是高度耐久的，具有记忆力(在向其施加变形力之后恢复其形状)，并且可以容易地管理，也便于外科手术操作，从而有助于缝合到受体床和体内植入。因此，溶胀材料可被压缩和折叠而不失去其特性，在变形后恢复其初始形状。此外，由于来自冻融步骤的物理交联，生物材料的机械性能得到改善。本发明的另一方面涉及用于制备具有互穿网络的物理交联的水凝胶的方法(本发明方法2)，所述方法包括：a)提供包含纤维蛋白网络和多糖网络的水凝胶；和b)使步骤a)的水凝胶经受冻融过程。方法2的步骤a)和b)可按照与本说明书中之前对于本发明的方法1的情况提到的那些相同的程序进行。如前所述，在进行本发明的方法2之后，所得的水凝胶是具有互穿网络的物理交联的水凝胶。物理交联为水凝胶提供改进的机械性能。本发明的生物材料如上文所定义的本发明的方法1允许产生具有改进的性质并且可用于再生口腔粘膜的生物材料。因此，在另一方面，本发明涉及通过如上文所定义的方法1可获得的生物材料。另一方面，本发明涉及包含纤维蛋白网络和多糖网络的多孔生物材料支架。本发明的生物材料支架是高度多孔的，具有合适的聚合物链互连以确保营养供应和细胞废物消除。在具体实施方案中，本发明的生物材料支架具有范围从1至500微米、优选50至200微米、更优选50至100微米的孔径。本发明的生物材料支架的内部结构通过扫描电子显微术(sem)进行了分析。图1-2对应于在不同比例详细显示使用不同多糖浓度的生物材料支架的内部结构的显微照片。通常，观察到具有孔隙之间的低互连的卵形多孔结构。孔隙在整个材料上看起来似乎没有明确的方向，尽管它们确实是通过微区定向的。如前所述，本发明的生物材料支架可容易地溶胀，能够以其干重的10至30倍之间的比例(取决于其初始组成)吸收液体。在其溶胀状态下，它是高度耐久的，具有记忆力(在向其施加变形力之后恢复其形状)，并且可以容易地管理，也便于外科手术操作，从而有助于缝合到受体床和体内植入。因此，溶胀材料可被压缩和折叠而不失去其特性，在变形后恢复其初始形状。在优选的实施方案中，多孔生物材料支架通过首先在多糖的存在下在足以使多糖胶凝的条件下交联含有纤维蛋白原的材料获得。在又另一个优选的实施方案中，含纤维蛋白原的材料的交联在至少凝血因子、钙源和任选的抗纤维蛋白溶解剂的存在下进行。在优选的实施方案中，在胶凝之后，在进行冻干步骤之前，将所得水凝胶进行如上所述的冻融方法。在另一个优选的实施方案中，多孔生物材料支架通过将含纤维蛋白原的材料、凝血因子、缓冲盐水溶液(优选pbs)和任选地抗纤维蛋白溶解剂与多糖和钙源混合而产生的混合物经受足以使多糖胶凝的条件，例如在低于多糖熔点的温度下同时形成纤维蛋白网络和多糖网络来获得。在胶凝之后，在进行冻干步骤之前，将所得水凝胶进行如上所述的冻融方法。由其中水凝胶经受冻融过程的这些优选实施方案产生的生物材料支架的特征还在于，由于作为已经进行了冻融过程的结果起始水凝胶物理交联的事实，其表现出改进的强度。在两种优选实施方案中，含纤维蛋白原的材料优选为血浆。同样在两种优选实施方案中，凝血因子优选为凝血酶。在又另一个优选的实施方案中，钙源是钙盐，且最优选是氯化钙。在又另一个优选的实施方案中，抗纤维蛋白溶解剂是氨甲环酸。在另一个优选的实施方案中，多糖是琼脂糖。在仍更优选的实施方案中，琼脂糖是低熔点琼脂糖。在又另一个优选的实施方案中，生物材料中琼脂糖的浓度为约0.05％-1％，更优选为0.2％-0.6％。如本文件提供的实施例所示，本发明的多孔生物材料支架的特征在于具有是高度耐久的，易于处理，并且具有记忆力，因其在施加变形力之后恢复其形状。此外，本发明的生物材料已经显示出在其溶胀态下耐受缝合而不破裂，这确保了对受损组织的正确固定。生物测试还指出了生物材料与细胞，特别是人成纤维细胞的正确相互作用以及缺乏对所述细胞的细胞毒性。根据本发明的多孔生物材料支架可任选地含有一种或更多种活性成分，例如一种或更多种生长因子(例如，以按基质组合物的重量计0.0000001％至1％或5％的量)，以促进口腔粘膜再生。合适的活性成分的实例包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、睾酮、神经节苷脂gm-i、过氧化氢酶、胰岛素样生长因子-i(igf-i)、血小板衍生生长因子(pdgf)、神经元生长因子半乳凝素-1及其组合。参见例如hansson等人的美国专利第6,506,727号和horie等人的美国专利第6,890.531号。如本文所用，“生长因子”包括促进粘膜组织的再生、生长和存活的分子。在本发明的一些实施方案中使用的生长因子可以是天然存在于角蛋白提取物中的那些，或者可以是以添加到角蛋白提取物或形成的角蛋白基质中的添加剂的形式。生长因子的实例包括但不限于血小板衍生生长因子(pdgf)、促红细胞生成素(epo)、血小板生成素(tpo)、肌生成抑制蛋白(gdf-8)、生长分化因子-9(gdf9)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf或fgf2)、表皮生长因子(egf)、肝细胞生长因子(hgf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。存在组成生长因子的大家族的许多结构和进化上相关的蛋白。此外，根据本发明的多孔生物材料支架可任选地包含一种或更多种免疫调节或生物活性化合物。如本文所用，“免疫抑制剂或免疫调节剂”是广泛地(generally)或特异性抑制或调节哺乳动物免疫应答的剂。如本文所用，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(csf)、干扰素(ifn)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原(prorelaxin)、卵泡刺激激素(fsh)、甲状腺刺激激素(tsh)、促黄体激素(lh)、肝细胞生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘泌乳素、ob蛋白、转化生长因子(tgf)、tgf-α、tgf-β、胰岛素样生长因子(igf)、促红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子(tnf)、tnf-α、tnf-β、缪勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、白介素(il)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、si因子、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、il-25、lif、kit-配体、flt-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮细胞抑制素(endostatin)、lt等。在另一个具体实施方案中，生物材料支架还包含骨传导性物质，例如碳酸钙、二膦酸盐、羟基磷灰石或胶原蛋白。当将生物材料支架用于硬组织重建时，该物质的掺入与引导骨再生特别相关。在本发明的具体实施方案中，生物材料支架还包括被掺入到支架的三维结构或其表面中的细胞。细胞的掺入增强了在高度损伤的、或者不具有来自患者的原位细胞贡献的可能性的那些组织中生物材料的再生活性和组织修复过程，因为该生物材料含有与损伤组织中存在的细胞相同类型的健康细胞。优选地，被掺入在水凝胶中的细胞选自由以下组成的组：成纤维细胞、角质形成细胞、肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞、未分化的间充质干细胞或分化成另一细胞株的间充质干细胞和/或未分化的造血干细胞或分化成另一细胞株的造血干细胞、眼细胞、角膜细胞、视网膜细胞、上皮细胞、来自白细胞(leucocitary)系统的细胞、来自造血系统的细胞、软骨细胞、成软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、神经元或来自外周和中枢神经系统的其它细胞、来自白血系统(whitebloodsystem)的细胞和巨噬细胞。治疗用途本发明的另一方面涉及用于医学的如上文所定义的多孔生物材料支架。另一方面，本发明涉及用于部分或完全增加、恢复或替代人和动物中软组织的功能活性的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架。在优选的实施方案中，本发明涉及用于部分或完全增加、恢复或替代由于选自包括以下的列表的功能障碍、损伤或疾病而导致的患病或损伤的软组织的功能活性的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架：伤口、溃疡、烧伤、良性或恶性赘生物、感染、瘀伤、创伤、苛性化(caustication)、先天性畸形、物质流失(substanceloss)、口腔粘膜或牙周病。在更优选的实施方案中，本发明涉及用于部分或完全增加、恢复或替代口腔粘膜的功能活性的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架。更具体地，多孔生物材料支架用于治疗牙龈炎、牙周炎和用于修复牙周韧带。在另一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗或愈合伤口、烧伤、溃疡、烫伤、瘘或其它慢性或坏死性伤口的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架。在另一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗肌肉骨骼损伤的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架。在另一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗心血管疾病的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架。在另一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗眼科疾病如角膜损伤或视网膜损伤的用途的如上文所定义的多孔生物材料支架。在另一个具体实施方案中，如上文所定义的多孔生物材料支架用于修复骨关节系统，更具体地用于修复椎间盘疾病或软骨，以及用于治疗骨关节炎、关节周围炎或关节病。在另一个具体实施方案中，如上文所定义的多孔生物材料支架用于硬组织再生，特别是用于牙周组织的再生。本发明的另一方面涉及如上文所定义的生物材料支架在医学中的用途。本发明还涉及如上文所定义的生物材料支架部分或完全增加、恢复或替代如上文所定义的患病或损伤的软组织的功能活性的用途。本发明的另一方面涉及包含本发明的多孔生物材料支架的药物组合物。在优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的多孔生物材料支架以及药学上可接受的载体。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的多孔生物材料支架以及活性成分。在优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的多孔生物材料支架，以及活性成分与药学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性成分”是指在诊断、治愈减轻、治疗或预防疾病中潜在地提供药理活性或另一不同作用或影响人体或动物身体的结构或功能的任何组分。本发明的药物组合物可以以分离的方式或与其它药物化合物或组合物一起用于治疗方法。本发明的另一方面涉及包含本发明的多孔生物材料支架的化妆品组合物。化妆品组合物包括任何组合物，其包含本发明的多孔生物材料支架，并且其为用于其局部施用的凝胶、霜剂(cream)、软膏(ointment)或香膏(balm)的形式。所述组合物的特征在于，即使当它们没有任何化妆活性分子缔合时，它们也具有润肤、保护性和再生性质。在本发明的变化形式中，化妆品组合物也可以掺入活性分子，尽管它们不具有任何治疗作用，但它们具有作为化妆剂的特性。在可被掺入抗氧化剂组合物的活性分子中，可提及润肤剂、防腐剂、香料物质、抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、去头皮屑剂、脱色素剂(depigmenter)、抗脂溢剂、染料、防晒剂、uv光吸收剂、酶、芳香物质等。化妆品组合物还可包含避免组合物的ph降低到低于5的值的ph控制剂，例如缓冲剂，以及避免组合物中重要结构变化的防腐剂。本领域技术人员可确定可以使用哪些另外的组分和它们是否是必需的，其中许多组分在化妆品组合物中是常用的。现在将通过参考以下实施例进一步描述本发明，这些实施例仅为了说明的目的而提供，而不应被解释为限制本发明。实施例实施例1.生物材料支架的制备制备含有人血浆(76ml)、pbs1x(16.5ml)和amchafibrin(1.5ml)的混合物的溶液。将琼脂糖4％(5ml)和氯化钙10％(1ml)同时加入到所述溶液中。相对于所得混合物的总体积，以v/v测量比例。将所得混合物充分混合并加入到模具中。将混合物静置至胶凝。图3(a)显示了在进行冻干之前所得到的水凝胶。形成的水凝胶用水轻轻洗涤并冻干。为此目的，将水凝胶在-80℃下冷冻，然后在0.024毫巴和-48℃下将水升华。实施例2.生物材料支架的制备及其物理表征制备含有人血浆(76ml)、pbs1x(16.5ml)和amchafibrin(1.5ml)的混合物的溶液。将琼脂糖4％(5ml)和氯化钙10％(1ml)同时加入到所述溶液中。相对于所得混合物的总体积，以v/v测量比例。将所得混合物充分混合并加入到模具中。将混合物静置至胶凝。然后使所形成的水凝胶通过在-20℃下将水凝胶冷冻12小时，随后将冷冻的水凝胶在室温下融化3小时经受冻融过程。图3(b)显示了在进行冻干之前所得到的水凝胶。之后，将所得的水凝胶用水轻轻洗涤并冻干。为此目的，将水凝胶在-80℃下冷冻，然后在0.024毫巴和-48℃下将水升华。遵循相同的程序，但将琼脂糖浓度改变为0.2％、0.4％和0.6％。图1详细显示了对于不同多糖浓度，生物材料支架的内部结构。1,500x和20,000x的放大倍数(图2)允许更详细地观察填充结构的孔隙的纤维蛋白网络以及最可能用形成所述孔隙的壁的琼脂糖覆盖的纤维蛋白纤维。通常，观察到具有孔隙之间的低互连的卵形多孔结构。孔隙在整个材料上看起来似乎没有明确的方向，尽管它们确实是通过微区定向的。具有更高琼脂糖浓度(例如0.4％和0.6％)的凝胶具有更相似的结构，而较低的琼脂糖浓度导致具有显著较大孔径的凝胶。该材料也被评估了可管理性。在实验室进行基本的处理测试，目视评价性能。当它溶胀时，生物材料是耐久的，具有记忆力(在向其施加变形力之后恢复其形状)并且可容易地被管理(参见图4)。另外，进行缝合测试以预测外科手术中生物材料的行为。观察到生物材料耐受所述缝合而不破裂，确保正确固定到组织(参见图5)。为了评价生物材料可吸收和储存的液体的量和体积，将具有不同琼脂糖组成的样品浸没在水中。结果表明，根据其初始组成，生物材料可吸收其干重的10至30倍。生物材料基本上在最初的24小时内溶胀，这一溶胀此后稍稍增加。实施例3.生物材料的生物学表征。存活/死亡将人成纤维细胞在如实施例2中描述制备的、琼脂糖浓度为0.2％的生物材料中培养24、48和72小时。进行存活/死亡测定以评价细胞存活率。该测定允许通过比色法区分活细胞与死细胞。活细胞由于其酯酶活性而发出绿色荧光。然而死细胞缺乏这种活性并且不发出绿色荧光。为了观察死细胞的存在，该试剂盒含有乙啡啶同二聚体，这是一种只能穿透具有受破坏的膜的细胞的化合物。图6和7显示了在不同时间评价的材料的荧光结果。细胞广泛侵入三维结构，且随着时间的推移，培养中的细胞增多。在任何情况下未观察到死细胞(红色)。该结果解释为生物材料与人成纤维细胞的正相互作用。细胞毒性根据iso10993-5标准(医疗器械的生物学评价.第5部分：体外细胞毒性测定)评价按照实施例2制备的生物材料的细胞毒性。在96孔板中，以4000个细胞/孔的接种密度用成纤维细胞fa0506007以3代进行测定。在测定中使用具有0.2％和0.4％琼脂糖的两种不同组合物的一式三份。培养24小时后的细胞毒性结果显示，没有一种材料对于评价的细胞是细胞毒性的(参见图8)。血液相容性还根据iso10993-4：2002标准(医疗器械的生物学评估.第4部分：与血液相互作用的测试的选择)评价血液相容性。溶血效应的定量被认为是由于血液中高血浆血红蛋白水平的特异性确定，并且确定与生物材料接触的红细胞膜的脆性。刺激测试为了分析生物材料是刺激物的可能性，分析了根据实施例2的两种组合物(0.2％和0.4％琼脂糖)。在两种情况下，材料一式三份进行分析。对于分析的任何组合物，生物材料都不是刺激物(参见图9)。实施例3.体内原理验证在第一种方法中，将根据实施例2合成的生物材料皮下植入大鼠模型中，以在潜在的毒性事件和可降解性方面评价周围组织对植入的生物材料的反应。根据伦理委员会规定的圈养和管理，本研究采用了8周龄以上的wistarag大鼠。在每个动物中，在下背两侧进行两个切口，并通过其中一个切口皮下引入1cm2的生物材料(参见图10)，将另一个作为对照(生理盐水溶液)。在生物材料植入后7、14、30和60天，处死大鼠，获得生物材料和周围组织用于组织学评价。在经历的任何时间在相邻组织中都没有观察到宏观外部炎症、红斑或水肿的迹象。在第7天和第14天观察到新血管形成的迹象。在植入30天后观察到本发明的生物材料的显著吸收，其逐渐持续至在第60天测定结束。表2.整个测试时间(60天)本发明生物材料的尺寸进展植入物大小进展的分析显示本发明的生物材料的尺寸最初略微增加，这可能是由于本发明的生物材料吸收组织液的能力，在第7天和第14天之间恢复其初始尺寸。从那时起，随着时间的推移，其尺寸逐渐减小，表明其随着时间的再吸收能力，没有任何周围的组织反应。无论如何，没有观察到可见的生物材料塌陷，由此基质继续显示出三维结构。组织学评价显示，与对照病变相比，初始阶段(7天)的生物材料被典型的纤维化被膜和免疫细胞募集所包围，这在植入外源性材料时的所有情况下均发生。在30天的结果已经显示了该初始反应的完全分辨，同时新血管网络的形成继续，并且可以观察到与本发明的生物材料接触的规则细胞外基质。图11显示整个测试时间(7、14、30和60天)生物材料外植体的肉眼图像，而图12显示了在整个所述测试时间内的外植体的组织学图像。实施例4.体内概念验证通过评估生物材料植入在小型猪口腔粘膜缺陷模型中后的牙龈体积增加来进行生物材料功能性。根据欧洲管理实验动物护理和处理的规定，并由universitatautònomadebarcelona动物护理和使用委员会批准，在小型猪中进行研究。选择一只体重为35kg的雄性小型猪，并在所有研究期间保持软饮食。在下颌的每一侧进行切牙3和前磨牙2的拔牙。在两个月的愈合期后，获得了下颌两侧的藻酸盐压迹和3d扫描，并为了生物材料植入进行了新的手术。四个侧切口和信封瓣(1,5x2cm)起源于每个拔牙的外侧牙龈粘膜，并用生物材料(1x1cm)填充。另外，在两侧，在p1和犬牙之间的天然空间中进行了另一个切口。用可吸收的单丝线缝合完全闭合切口。在生物材料植入后的第15、45和90天，进行3d藻酸盐压迹，最后将动物镇静和安乐死。获得每个牙龈粘膜区的活组织检查(2x1cm)，并将2mm的连续切片常规固定在10％中性缓冲福尔马林中，石蜡包埋和苏木精和伊红染色。沿实验进行组织愈合的宏观评价和食物摄取的控制。此外，通过藻酸盐压迹制作了主模型，使用允许不同时间模型叠加、纵向和横向截面选择以及主差异检测的图像分析软件(来自3shapes/l的orthoviewer2014)进行铸造模型扫描和处理。计算平均值和标准差，并分析体积差异。在小型猪的研究中没有观察到生物材料毒性或任何不良事件的迹象。活组织检查显示良好的皮肤和表皮组织，并且没有观察到由于生物材料应用引起的宿主反应或炎症。其产生完全的上皮再生,并存在多层、成熟和queratinisated上皮。粘膜下层显示良好组织的结缔组织，具有包括厚、致密且组织良好的纤维的成熟的胶原。生物材料几乎完全消失了。如表3所示，铸造模型体积分析显示植入生物材料后损伤的体积增加。表3.由生物材料植入口腔粘膜缺陷引起的牙龈粘膜体积增加。区域最终体积增加(mm)切口11,07切口20,88切口31,98切口41,37平均值±sd1,33±0,5生物材料植入产生了重要的牙龈体积增量，其非常类似于当应用自体上皮下层结缔组织移植物(来自患者自身组织的供体部位的移植物)时获得的体积增加。当前第1页12