用于产生由结合丝丝心蛋白微纤维和纳米纤维组成的混合结构的方法、由此获得的混合结构及其作为可植入医疗装置的用途与流程

发明领域

本发明涉及用于产生由相互结合的丝心蛋白微纤维和纳米纤维组成的混合结构的方法，所述混合结构可能在层次上组织成复杂结构，所述复杂结构包括由纳米纤维丝心蛋白和微纤维丝心蛋白的结合(coupling)获得的若干初级结构；本发明还涉及通过该方法获得的混合结构，以及其用作用于组织工程和再生医学领域的广泛应用的可植入医疗装置的用途。

背景技术：

在现代手术中，越来越多地使用支架，支架是具有临时补偿身体部位和组织的受损功能的功能并且然后被受损部位或组织的天然细胞再生长定居以实现该部位或组织的再生的可植入装置。

用于生产支架的材料可以是非常不同的，这取决于预期的应用。例如，由羟基磷灰石和β-磷酸三钙的混合物组成的无机支架通常用于骨组织的临时代替和再生长。然而，聚合物支架是更常见的，优选基于可生物降解和生物相容性的生物聚合物或合成聚合物，预期临时代替非刚性组织。

聚合物支架必须具有针对待在体内执行的功能而优化的一系列表面和体积特性。在感兴趣的特性中，我们可以考虑纳米水平、微观水平和宏观水平的形态特征；物理-机械特性和性能(理想地，这些应尽可能接近待再生的组织的体内特征和性能)；以及化学和生物特性，特别提及生物相容性(即支持粘附和细胞生长的能力、不引起炎症和/或免疫原性反应、不释放有害物质等)和生物可降解性或生物可吸收性(必须与装置在体内的停留时间相当，装置在体内的停留时间又取决于待修复的组织的重建速率)。其它感兴趣的性质可以是孔隙率、对流体的渗透性、当需要时摄取、保持并且然后释放活性剂、生长因子或药物等到植入部位的能力。

用于生产支架的特别有希望的天然聚合物是丝心蛋白，丝心蛋白是在自然界中由鳞翅目(家养物种(domesticspecies)：家蚕(bombyxmori)；野生物种：柞蚕(antheraeapernyi)、蓖麻蚕(philosamiaricini)等)、其他昆虫和蛛形纲产生的丝蛋白。丝心蛋白也可以通过重组dna技术产生。丝心蛋白使用所谓的“精炼(scour)”处理从天然丝中获得，“精炼”处理包括除去覆盖丝心蛋白的丝胶蛋白层；该处理通常在约60℃与120℃之间的温度下通过任选地添加有碱(皂)、酸或酶的水浴进行，如果需要，通过在高压釜中操作进行。如此获得的丝心蛋白呈平均直径为12-14μm、极限强度为约600mpa、断裂伸长率值为25％-30％(值是指家蚕的微纤维)的微纤维的形式。可以使用这些微纤维，利用为在纺织领域的丝应用而开发的并且因此落在本领域技术人员的普通知识内的技术，产生二维结构或三维结构(线、纱、编织物(wovenfabrics)、针织物、无纺布、网状物、编结物(braid)、绳索等)。

对丝心蛋白的兴趣主要是由于其经证实的生物相容性，生物相容性通过支持各种细胞类型的生长和增殖的能力，缺乏免疫原性和炎症反应以及明显的血管发生特性来表达，这在活组织的修复/再生的情况下特别有用。此外，以上提及的物理-机械特性允许生产具有适合于该目的的机械特性(特别是高抗拉伸性、高弯曲度、高压缩应力；良好的弹性；回弹力等)的支架；最后，由丝心蛋白制成的支架在体内具有中长期(从几个月至1-2年，取决于植入部位的生物环境的特征)生物降解性特征，其最适用于其中支架必须确保机械支撑持续很长时间的应用。

由于这些性质，本领域已经提出丝心蛋白用于生产支架。

纤维形式的聚合物的结合通过聚合物的部分溶解和随后聚合物再次沉积在纤维上例如从专利申请de1436311a1是已知的。

专利us8,202,379b1描述了通过用含有离子液体和通常为水、醇或酮的第二液体化合物的混合物处理天然聚合物或合成聚合物的纤维来结合天然聚合物或合成聚合物的纤维。

这些文件仅描述了尺寸和化学、物理和机械特性方面均质(如来源于相同的产生过程和/或制作过程)的纤维的结合。

专利申请wo03/043486a、ep2210971a1和wo2011/031854a1描述了预期用于重建韧带(特别是膝盖的前交叉韧带)的丝心蛋白结构，该丝心蛋白结构由以逐渐增加的水平组装一直到达到应用所需的尺寸和机械性能的纤维结构的层级组成。

专利申请wo2013/012635a2、wo2013/082093a1和wo2012/111309a1描述了基于天然丝心蛋白微纤维的替代性装置，其具有通过针织获得的网状结构，被优化分别用于腹部和骨盆区域中受损组织的修复手术、用于乳房整形手术以及用于实现血管假体。

这些支架通过使用纺织技术从丝心蛋白微纤维(其如所述的具有约12-14μm的直径)产生，其中由至少20根丝心蛋白微纤维组成的基本丝线，通常通过合丝和加捻操作组装在其横向尺寸可以在一毫米的十分之一至一毫米或更大的范围内的层次更高的结构(hierarchicallysuperiorstructure)(“纱线”)中。虽然这样产生的纺织品结构通常具有卓越的柔软性和平滑性特征，并且在宏观水平上它们容易适应它们粘附的表面，在微观水平上它们可以展示坚硬区域以致引起局部刺激/炎症反应；此外，由于它们的高结晶度和韧性，丝心蛋白微纤维能够施加如此大小的摩擦力以致磨损与它们接触的组织的表面；在最坏的情况下，这些问题可能导致植入物的部分失效或完全失效。丝心蛋白微纤维支架的另一个缺点是它们显示不利的表面/体积比，使得适合于自体定植的总面积涉及相对高装载量的待放置在植入部位中的材料，其结果是由于待被有机体处置的降解产物的局部积累，生理和代谢活性的潜在超负荷。最后，丝心蛋白微纤维在某些情况下的自然降解时间与新组织形成速率相比可能太长，并且因此干扰新组织的生长。

为了避免这些缺点，已经提出使用纳米纤维形式的丝心蛋白，即具有小于1微米，通常为几十到多至几百纳米的直径。

这些纳米纤维可以通过已知的方法制备，其中天然丝心蛋白首先溶解在合适的溶剂中，并且然后用诸如力纺丝(force-spinning)或静电纺丝的方法再生。在这些方法中，丝心蛋白溶液通过称为喷丝头的毛细管，产生纳米尺寸的液体长丝，其朝向收集器加速；在力纺丝的情况下，加速是由离心力引起的(由于喷丝头以几千rpm的速度旋转)，而在静电纺丝的情况下，加速是由喷丝头的喷嘴和歧管之间的电位差引起的，其加载液体从而导致产生溶液射流；由于聚合物的粘弹性特性，射流经历拉伸(drawing)过程，伴随着溶剂的同时蒸发，拉伸过程导致产生纳米纤维，该纳米纤维积聚在收集器上。

最近的研究已经证明了用丝心蛋白纳米纤维制成的支架的优异性能。

文章“invivoregenerationofelasticlaminaonfibroinbiodegradablevascularscaffold”，i.cattaneo等人，int.j.artif.organs36(2013)166表明，植入大鼠主动脉的腹部部分的静电纺丝丝心蛋白的管状支架允许形成从形态和功能的角度完全类似于天然的血管组织的血管组织。文章“decellularizedsilkfibroinscaffoldprimedwithadiposemesenchymalstromalcellsimproveswoundhealingindiabeticmice”,s.e.navone等人，stemcellresearch&therapy，5(2014)7，示出了通过与脂肪组织的间充质细胞接触而预活化的静电纺丝丝心蛋白斑块通过涉及由该材料直接刺激血管生成过程的生物机制在糖尿病小鼠中诱导伤口愈合的有效性。

还已经描述了通过丝心蛋白微纤维和纳米纤维结合而制备支架。

专利申请cn101879330a描述了一种被提议为具有三层管状结构的血管假体和/或神经再生的引导件的装置，其中内层是由再生的丝心蛋白制成的多孔沉积物，中间层是呈网形式的丝心蛋白的编织微纤维的管状结构，并且外层由通过静电纺丝制成的纳米纤维丝心蛋白结构组成。该文件中描述的装置的生产过程是复杂的。内层最初采用标准编织方法制成管状，将如此得到的层浸泡在丝心蛋白溶液中，并且将所得中间产物在40-60℃下干燥。将该第一中间产物装到用于静电纺丝的收集器针上，并且通过该技术将一层纳米纤维-微纤维丝心蛋白沉积在以上提及的所述第一中间产物的外表面上；然后将由此获得的复合材料浸入甲醇或乙醇中持续1-4小时。最后，将该第一复合材料引入模具中，并且通过从丝心蛋白溶液中沉积而在其内管表面上产生多孔层；通过在-80℃与-10℃之间的温度下处理获得最内层的孔隙率。三层的该复合材料借助于在溶剂中或丝心蛋白溶液中浸泡期间在三层的该复合材料的表面上形成的丝心蛋白膜结合在一起。然而，根据该文件的方法产生的丝心蛋白膜一旦干燥和结晶就非常脆，以致于在它们被拉伸、弯曲、压缩等机械应力推动时立即断裂；这可能导致不同层之间的形态不连续性和机械不连续性的产生，形态不连续性和机械不连续性可以容易地导致几何和性能特征的损失，例如从机械角度来看较弱层的屈服和/或倒塌(特别是纳米纤维层)。

专利申请cn102499800a描述了一种可以用作用于修复小血管的支架或假体的装置，在这种情况下也由具有三层的混合结构组成；内层和中间层由通过丝心蛋白/聚己内酯混合物的静电纺丝获得的纳米纤维结构制成，而外层由用编结机产生的管状结构的丝心蛋白微纤维组成。单独制造并将一层作为套筒安装在另一层之上的三层通过一系列环形针而被保持在一起。该装置部分地具有与前一个装置相同的缺点；此外，使用彼此以间隔开的针来实现结合的事实留下对各种组件的部分移动自由；在从机械和生物学角度的加压工作条件，例如在体内植入进程中可发生的加压工作条件的情况下，这可产生如此大的局部应力以致干扰进程中的再生过程，特别是如果材料被暴露于生理液体流时。

本发明的目的是提供由丝心蛋白微纤维和纳米纤维制成的混合复合材料，其允许生产没有现有技术的缺点的用于医疗应用的支架。

发明概述

用本发明实现了该目的，本发明在其第一方面涉及用于产生由相互结合的丝心蛋白的微纤维和纳米纤维制成的混合结构的方法，该方法包括以下步骤：

a)制备由微纤维丝心蛋白制成的一个或更多个部分；

b)制备由纳米纤维丝心蛋白制成的一个或更多个部分；

c)单独地或在结合后使用用于丝心蛋白的溶剂和/或使用包含溶解在溶剂中的丝心蛋白的溶液处理纳米纤维丝心蛋白的所述一个或更多个部分和微纤维丝心蛋白的所述一个或更多个部分；

c’)如果在步骤c)中，所述纳米纤维部分和所述微纤维部分已经单独地使用用于丝心蛋白的溶剂和/或使用包含溶解在溶剂中的丝心蛋白的溶液处理，则结合所述部分；

d)通过在10℃与150℃之间的温度下热处理持续1分钟与24小时之间的时间，将在步骤c)或步骤c’)中获得的混合微纤维/纳米纤维结构固结(consolidation)；

e)通过用水或水-醇混合物洗涤或通过在10℃与100℃之间的温度下可能地在真空下蒸发除去所述溶剂，

其中步骤c)中使用的溶剂选自：甲酸、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇、三氟乙酸、六氟丙酮、n-甲基吗啉n-氧化物、离子液体、氯化钙-乙醇-水混合物、硝酸钙-甲醇-水混合物、锂盐的水溶液以及这些溶剂中的混合物和/或这些溶剂与水的混合物。

本发明的方法还可以包括以下另外的步骤：

f)结合根据步骤a)至e)获得的两个或更多个微纤维/纳米纤维混合结构以形成更高的层次结构(superiorhierarchicalstructure)；

g)通过重复以上提及的步骤c)至e)的相同步骤，将由此获得的更高的层次结构固结。

在其第二方面，本发明涉及使用用所述方法获得的混合结构的可植入医疗装置。

附图简述

现在将在下文中参考附图详细描述本发明，附图中：

-图1示意性地示出了用于执行根据本发明的结合纳米纤维和微纤维部分的操作的装置；

-图2和3示出了根据本发明产生的混合结构的样品的使用扫描电子显微镜(sem)获得的显微照片；

-图4显示了在根据现有技术产生的混合结构的样品上获得的类似于图2和3中的显微照片的显微照片；

-图5示出了与单独的丝心蛋白微纤维或单独的丝心蛋白纳米纤维样品相比，根据本发明产生的混合结构的ir光谱；

-图6示出了与根据本发明产生的混合结构相关的以及与单独的丝心蛋白微纤维或单独的丝心蛋白纳米纤维相关的差示扫描量热法(dsc)的图；

-图7示出了根据本发明产生的混合结构的样品和单独的丝心蛋白微纤维或单独的丝心蛋白纳米纤维的样品的负荷/伸长率图；

-图8示出了根据现有技术产生的混合结构的样品的负荷/伸长率图；

-图9示意性地示出了用于对混合结构的层进行剥离试验的设备；

-图10示出了本发明和现有技术的混合结构的层的分离试验中获得的施加的力/剥离行程的图；

-图11示出了表示用本发明的混合结构制成的医疗装置上的细胞生长的图；和

-图12示出了与由单独的微纤维制成的片状样品、由单独的纳米纤维制成的片状样品以及由本发明的丝心蛋白制成的混合结构制成的片状样品的遗传毒性测量相关的直方图。

发明详述

在本说明书和以下权利要求书中，术语“部分”意指由丝心蛋白的均质纤维即仅微纤维或仅纳米纤维形成的主体，而术语“混合结构”意指通过结合由纳米纤维形成的至少一个部分和由微纤维形成的至少一个部分而形成的主体。

本发明人已经发现，通过根据下文描述的方法组合丝心蛋白纳米纤维和微纤维，可以形成混合结构，混合结构被提供有适于生产可植入医疗装置的机械特性。

可用于本发明目的的纳米纤维具有在20nm和1.5μm之间，并且优选在0.4μm和1μm之间的直径。而微纤维通常具有约10μm与15μm之间的直径；微纤维还可以结合成含有甚至多达500根单个丝质长丝的多纤维纱。在本文的其余部分，还使用测量单位旦，旦是纺织技术特有的，被定义为9000米纤维或纱的以克计的重量。

在其第一方面，本发明涉及通过结合一个或更多个丝心蛋白微纤维部分和一个或更多个丝心蛋白纳米纤维部分的微纤维/纳米纤维混合结构的产生方法。

该方法的步骤a)在于制备一个或更多个微纤维丝心蛋白部分。丝心蛋白微纤维部分赋予最终医疗装置以形状和机械强度；作为该方法的第一步骤，因此必需制备具有基本上对应于所需装置的形状和尺寸的形状和尺寸的丝心蛋白微纤维部分。微纤维丝心蛋白用作产生该部分的起始材料，呈具有10旦与400旦之间，并且优选15旦与100旦之间的支数的丝纱形式。丝纱可以在精炼后使用，或可以使用生丝并且在产生所述部分后精炼丝纱。微纤维丝心蛋白可以例如通过化学反应和/或酶促反应而被添加有生物活性剂，所述生物活性剂包括生长因子、药物、细胞、抗生素、抗病毒剂、酶、维生素等。该添加可以在步骤a)之前，在步骤c)至g)中任一个的过程中或步骤c)至g)之后进行。该部分可以由通过纺织工业中已知的任何技术获得的一种或更多种要素(element)形成，所述技术例如纬向-经向编织(获得正交织物)，无纺布(nonwovenfabric)生产技术、针织、编结或称为“缠绕成型”的技术，称为“缠绕成型”的技术在于根据可变交织图案，围绕旋转锭子缠绕纱线，这导致获得中空圆柱形结构。

该方法的步骤b)在于制备一个或更多个纳米纤维丝心蛋白部分。

可以通过丝心蛋白溶液的力纺丝或优选通过丝心蛋白溶液的静电纺丝获得可用于本发明目的的纳米纤维丝心蛋白部分。

通过将丝心蛋白溶解在选自以下的溶剂中来制备初始溶液：甲酸、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇、三氟乙酸或离子液体诸如1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓、1-乙基-3-甲基甘氨酸咪唑鎓、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-2,3-二甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基溴化咪唑鎓以及这些溶剂中的混合物和/或这些溶剂与水的混合物；用于本发明目的的优选的离子液体是1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓和1-乙基-3-甲基甘氨酸咪唑鎓。

初始溶液具有在甲酸中的1％w/v与30％w/v之间，优选6％w/v与10％w/v之间的丝心蛋白浓度；或者可选择地，在所指示的其它溶剂中的5％w/v与40％w/v之间，优选10％w/v与30％w/v之间丝心蛋白浓度；重量/体积(％w/v)百分比浓度表示溶解在100ml溶液中的丝心蛋白的克数。

生产纳米纤维丝心蛋白部分的优选方法是静电纺丝，其一般执行方法是本领域技术人员已知的：为了获得适合于本发明目的的纳米纤维丝心蛋白，使用在5kv与100kv之间，优选在15kv与35kv之间的喷丝头的喷嘴和收集器之间的电位差，在5cm与60cm之间，优选在10cm与20cm之间的所述喷嘴和收集器之间的距离对溶液进行静电纺丝。喷丝头的喷嘴可以具有在0.01mm与10mm之间，优选地在0.1mm与1mm之间的直径。

在力纺丝和静电纺丝的情况下，初始溶液可以被添加有生物活性剂，所述生物活性剂包括生长因子、药物、细胞、抗生素、抗病毒剂、酶、维生素等，这些生物活性剂因此被整合在医疗装置中，且然后可以在植入部位处从医疗装置中释放，以便促进所述装置所预期用于的身体区域的再生过程。纳米纤维丝心蛋白可以例如通过化学反应和/或酶促反应而被添加有生物活性剂，所述生物活性剂包括生长因子、药物、细胞、抗生素、抗病毒剂、酶、维生素等。该添加可以在步骤c)至g)中任一个的过程中或步骤c)至g)中任一个之后进行。

仅为了说明清楚的目的，之前的步骤已被命名为a)和b)，但这并不意味着执行的时间顺序；纳米纤维部分和微纤维部分被单独地产生，并且两个步骤可以以任何顺序进行。

在其制备之后，在该方法的步骤c)中，用溶剂或含有另外的丝心蛋白的溶液处理微纤维丝心蛋白部分和纳米纤维丝心蛋白部分。在该步骤中，纤维的表面部分转到凝胶相，在本纤维周围形成膜。用所述溶剂或溶液的处理可以在所述单独的部分上进行，或者在使它们彼此接触之后进行。

在用单独的溶剂处理的情况下，这选自：可以是1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基氯化咪唑鎓，1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓、1-乙基3-甲基甘氨酸咪唑鎓、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-2,3-二甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基溴化咪唑鎓或它们的纯的混合物或它们与水的混合物的离子液体；甲酸；三氟乙酸；1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇；六氟丙酮；氯化钙-乙醇-水混合物；硝酸钙-甲醇-水混合物；n-甲基吗啉n-氧化物；或锂盐(溴化锂、硫氰酸锂)的水溶液。用于该处理的优选溶剂是纯的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓、1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓或1-乙基-3-甲基甘氨酸咪唑鎓或它们与水的具有5％w/w与50％w/w之间，并且优选10％w/w与25％w/w之间的水含量的混合物；用于本发明目的的另一种优选的溶剂是甲酸。

可以根据不同的方法进行纳米纤维丝心蛋白部分和微纤维丝心蛋白部分的溶剂的暴露(单独的或已经彼此接触)，所述方法诸如例如：

-在溶剂中浸泡持续1秒与240分钟之间，优选30秒与30分钟之间的时间；

-通过倾倒、涂覆、雾化、电喷雾或静电纺丝将溶剂以0.001ml/cm²与0.5ml/cm²之间，优选0.01ml/cm²与0.1ml/cm²之间的量沉积溶剂；这些量是指这些部分的表观表面，即从部分本身的长度和宽度的简单乘积推导出的表观表面(高度对部分的表面的贡献通常是可以忽略的)，而不是指单个纤维的整个表面；

-暴露于溶剂的蒸汽中，持续1秒与120分钟之间，优选30秒与30分钟之间的时间。

微纤维和溶剂之间进行接触的温度在40℃与80℃之间，优选在50℃与70℃之间变化；还可以在低于40℃的温度下操作，但是在这种情况下，处理执行时间变得非常长并且不适用于工业生产。对于纳米纤维，与溶剂进行接触的温度可在室温与70℃之间，优选在40与60℃之间变化。

在两部分结合之前对两部分单独处理的情况下，可以用单独的溶剂处理两部分之一，且另一种用丝心蛋白在溶剂(不必与用单独的溶剂处理中的溶剂相同)中的溶液处理。

还可以用单独的溶剂处理一种部分或用单独的溶剂连续处理两种部分，以引起纤维的初始胶凝，并且然后用丝心蛋白的溶液处理，以给予溶解的聚合物的另一等分试样，并促进随后的部分的结合。

为了最佳地执行本发明的方法，在以上提及的范围内，纤维和溶剂之间的接触时间应随着温度的升高和纱线的尺寸减小或待处理的部分的尺寸减小而缩短。例如，对于相同厚度的微纤维，与溶剂的合适的接触时间在70℃与80℃之间的温度下将在约30秒与3分钟之间，并且对于在40℃与50℃之间的温度将在约15分钟与1小时之间。关于纳米纤维，这些接触时间的范围在70℃下在30秒与1分钟之间，并且在40℃与50℃之间的温度下在约5分钟与30分钟之间。

具有相同温度的接触时间还取决于部分的表观密度而变化，表观密度即部分的每单位体积的纤维的量，特别是在由微纤维制成的部分的情况下；仍然保持在以上提及的一般范围内，用于织物的合适的接触时间减少，例如从绉绸转到斜纹织物、从斜纹织物转到透明硬纱和从透明硬纱转到无纺布的接触时间减少。

考虑到这些一般指导原则，本领域技术人员能够选择适合于获得可用的微纤维部分和纳米纤维部分的有效结合的最佳操作条件。

在用丝心蛋白溶液处理的情况下，用与以上对于用单独的溶剂处理提及的相同溶剂制备溶液。优选地，该溶液基于具有在5％w/v与40％w/v之间，优选10％w/v与30％w/v之间的丝心蛋白浓度的纯的或与水混合的(水含量在5％w/w与50％w/w之间，优选在10％w/w与25％w/w之间)1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-丁基-3-甲基氯化咪唑鎓、1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓或1-乙基-3-甲基甘氨酸咪唑鎓；或基于具有在1％w/v与30％w/v之间，优选6％w/v与10％w/v之间的丝心蛋白浓度的甲酸。

丝心蛋白溶液与纳米纤维丝心蛋白部分和微纤维丝心蛋白部分之间的接触可以通过浸泡在溶剂中或将溶剂沉积在所述部分上(已经彼此接触或仍然分开)使用以上在用单独的溶剂处理的情况下报告的相同的方法、时间选择和数量而发生。

如果所述部分在使用溶剂或溶液的所述处理之前尚未彼此接触，则在步骤c’)中将它们彼此接触，获得微纤维/纳米纤维混合结构。

在平面几何装置的情况下，纳米纤维部分和微纤维部分根据所需的数量和顺序堆叠(放置)在彼此之上。在管状医疗装置的情况下，纳米纤维部分和微纤维部分根据所需的数量和顺序“安装”在彼此之上。在除管状之外的三维混合结构的情况下，使纳米纤维部分和微纤维部分根据所需的数量和顺序粘合至彼此。

在步骤c)和c’)中，可以添加形成有生物活性剂的混合结构，将这些生物活性剂分散在所用的溶剂和/或溶液中，所述生物活性剂包括生长因子、药物、细胞、抗生素、抗病毒剂、酶、维生素等。以此方式，生物活性剂与混合结构的组分部分接触，并且可以并入混合结构的组分部分中，并且因此可以并入其中使用所述混合结构的可植入医疗装置中。

在该方法的步骤d)中，然后使由此获得的混合结构经历热处理，以加强两个或更多个丝心蛋白部分的结合，其中纳米纤维丝心蛋白中的至少一个和微纤维丝心蛋白中的至少一个。该处理在10℃与150℃之间的温度下在仍浸渍有溶剂的混合结构上进行；优选地，当在前一步骤中使用离子液体时，处理温度在80℃与120℃之间，且当在前一步骤中使用甲酸或其它溶剂时，处理温度在20℃与50℃之间。处理的持续时间在1分钟与24小时之间。

优选地，在步骤d)期间，使一组待结合的部分经历通常在0.5kg/cm²和5kg/cm²之间优选在0.1kg/cm²和1kg/cm²之间的值的压缩，以提高分布过程对步骤c)中形成的胶凝丝心蛋白的两种类型的纤维的效率。

该操作可以例如通过诸如图1所示的设备的设备来进行。该设备包括在底部的加热元件10，板11安置在所述加热元件10上；在其上部部分，该装置包括第二板12。两个板必须由刚性、导热和不粘材料制成。加热元件必须允许将温度精确控制在以上提及的处理温度范围内，准确度为±0.5℃，如果±0.1℃则更好，以便允许以必要的准确度管理胶凝过程。根据上述优选的操作方法，在加热步骤期间，使用使两个板彼此靠近以致不在丝心蛋白部分之间也不在所述部分和板之间留下任何空的空间的重量和/或闭合系统，在顶板上施加轻微压力(由图中指向下方的箭头所示，并且由指示“p”所示)。最后，该装置优选地锁定在从外部可接近的隔热室中，以便防止可能损害胶凝过程的有效性的热损失。待结合的丝心蛋白的两个部分的最佳布置如图所示，微纤维部分14对与离子液体结合的热的影响较不敏感，与靠近加热元件的板11接触，而纳米纤维部分13与顶板12接触。这种构造(微纤维部分更靠近加热元件且纳米纤维部分更远离加热元件)在根据方法的步骤f)和g)获得的层次更高的混合结构的情况下当部分的堆叠顺序允许时也是优选的。

在管状部分的情况下，结合例如使用由圆筒组成的设备进行，该圆筒可以是实心的或中空的，由刚性、导热和不粘材料制成，并且具有略大于待结合的部分的直径的直径(直径差异优选在0.05mm与3mm之间)。锭子必须连接到适合于调节其温度在10℃与150℃之间的系统，并且它可以容纳在隔热室中；该室可以被恒温控制，并允许温度控制在相同的范围内。在这种操作模式中，在利用丝心蛋白部分的弹性的两种情况下，所述部分中的一个安装在锭子上，并且然后将另一个部分安装在第一个部分上。锭子和部分之间的尺寸差异产生最外侧部分对最内侧部分的径向压力，促进了相同部分的粘着和结合。该操作模式中的优选配置由所生产的装置的最终目的决定；因此，通过实例的方式，为了制造用于血管修复/再生的医疗装置，纳米纤维部分将安装成与锭子接触，而微纤维部分将安装在纳米纤维部分上。

在该方法的步骤e)中，通过用水或水-醇混合物洗涤或通过蒸发除去溶剂。洗涤在10℃与100℃之间，优选20℃与50℃之间的温度下进行持续在2分钟与180分钟之间，优选在10分钟与60分钟之间的时间；在使用水-醇混合物的情况下，优选的醇是甲醇和乙醇，且水的浓度在5％v/v与50％v/v之间，且优选在10％v/v与30％v/v之间。如果通过蒸发除去溶剂，则这在10℃与100℃之间的温度下可能地在真空下，优选在15℃与55℃之间进行，持续在10分钟与168小时之间，且优选在30分钟与72小时之间的时间。

该方法的步骤c)和d)导致构成相邻部分的纤维材料的部分表面溶解/胶凝。下一个步骤e)的溶剂除去导致胶凝的丝心蛋白级分的凝结；在结构之间的接触区域中发生的丝心蛋白从凝胶状态至固体(凝结)状态的转变，导致在微纤维和纳米纤维之间形成“接合点”-结合点和融合点。这形成由熔接在一起并构成单一部分的微纤维和纳米纤维组成的混合结构。

一旦已经如上所述产生了微纤维/纳米纤维混合结构，则可以通过进行以上提及的可选的步骤f)和g)将该混合结构结合到另一个相似的结构或若干个相似的结构以形成层次上组织的复杂结构。

本发明的第二方面涉及使用用迄今为止描述的方法获得的混合结构的可植入医疗装置。

本发明的可植入医疗装置主要用作用于使用再生医学方法修复人和动物组织和器官的支架。在靶标组织和器官中，我们可以提及周围神经系统(周围神经)、血管系统(静脉、动脉、血管通路的动静脉瘘)、心血管系统(冠状动脉和心肌)的组织、中枢神经系统(脊髓)、皮肤及其层、内脏的包容(containment)和保护组织(硬脑膜、心包膜、胸膜、腹膜，...)、肌肉骨骼系统的组织(腱、韧带、肌肉)和用于包容疝气和脱垂的装置，以及其它。

装置的形状和尺寸取决于靶标组织或器官；以下列出了预期用于以上提及的一些目的并且使用本发明的混合结构可实现的装置的粗略的形状和尺寸，但是其他可能的用途(以及相关装置的形状和尺寸)对于本领域技术人员将是明显的：

-在外周血管的情况下，内径在2mm与8mm之间并且壁厚度在0.2mm与4mm之间的管状装置；

-在外周神经的情况下，内径在1mm与6mm之间并且壁厚度在0.2mm与1mm之间的管状装置；

-在腱和韧带的情况下，外径在2mm与15mm之间的实心圆柱形装置；

-在皮肤及其层的情况下，厚度在0.1mm与5mm之间的平面装置；

-内脏的包容(containment)和保护组织诸如硬脑膜、心包膜、胸膜、腹膜的情况下，厚度在0.05mm与2mm之间的平面装置；

-在用于包容疝气和脱垂的装置的情况下，厚度在0.05mm与2mm之间的平面装置。

本发明将通过以下实施例进一步说明。

实施例1

该实施例描述了微纤维丝心蛋白长丝和从这些长丝获得的部分(纤维、织物)的产生。

使家蚕的蚕茧经历纺丝以产生生丝纱。在合丝和加捻后，在压力下在120℃下用水精炼纱30分钟，以除去丝胶。对于织物的产生，将原纱首先按所需的织纹编织，且然后将如此获得的织物在95℃-98℃下在表面活性剂存在下精炼持续1小时，以除去丝胶。为了产生无纺布，将蚕茧切割并浸泡以除去丝胶。将如此获得的短纤维丝(称为“绢丝”)经历梳理。梳理的面纱(veil)通过针刺固结成无纺布。

用如此得到的长丝产生以下：

-精炼的丝纱(3纱纬；支数17.1×3旦)；

-具有以下特征的精炼丝织物：织物：绉绸；经向纱线数/cm：58(支数：15.3×3旦)；纬向纱线数/cm：39(支数：15.3×3旦)；每单位面积的质量：55g/m²；厚度0.12mm；

-具有以下特征的精炼丝织物：织物：透明硬纱；经向纱线数cm：53(支数：20.7旦)；纬向纱线数/cm：39(支数：23.4旦)；每单位面积的质量：30g/m²；厚度0.09mm；

-具有以下特征的精炼丝织物：编织：斜纹织物；经向纱线数/cm：55(支数：15.3×3旦)；纬向纱线数/cm：43(支数：15.3×4旦)；每单位面积的质量：60g/m²；厚度0.09mm；

-具有以下特征的精炼丝的无纺布(tnt)：纤维长度：20-27mm；每单位面积的质量：33g/m²。

这些样品用于以下实施例的测试。

实施例2

该实施例描述了纳米纤维丝心蛋白部分的产生。

在高压釜中在120℃下用蒸馏水精炼家蚕的蚕茧持续30min，以除去丝胶。

在室温下彻底冲洗和干燥后，在60℃下将1g丝心蛋白微纤维溶解在10ml饱和的libr溶液(约9.3m)中持续3小时。用等体积的蒸馏水稀释后，将丝心蛋白溶液用蒸馏水渗析3天以除去盐。将所得的丝心蛋白溶液用水稀释至67ml，得到1.5％w/v的丝心蛋白水溶液。将分成15ml等分试样的该溶液倒入直径为5cm的模具中，并允许在室温下蒸发，得到具有50μm的平均厚度的丝心蛋白膜。

刚好在静电纺丝过程之前，在室温下将2g膜溶于25ml甲酸中，得到聚合物浓度等于8％w/v的溶液。

为了产生纳米纤维丝心蛋白部分，将丝心蛋白的甲酸溶液用ptfe毛细管装载入附接注射器泵(grasebymedical，ms2000)的聚丙烯注射器中。静电纺丝系统包括能够产生高达25kv的两个高压电源(f.u.g.elektronikgmbh，hcn35-12500)。阳极连接到喷丝头，所述喷丝头包括内径为0.5mm，能够在横向于收集器的方向移动的毛细钢管。阴极连接到收集器，所述收集器包括20cmx8cm(1×d)的旋转圆筒；纳米丝心蛋白部分以这种方式以中空圆柱体的形式获得，然后将其纵向切割并铺设(layout)以形成大致平坦的部分。使用以下实验参数产生静电纺丝的丝心蛋白部分的几个样品：丝心蛋白浓度＝按重量计8％；电压＝24kv；流速＝3ml/h；喷丝头/收集器距离＝10cm；收获时间＝6小时。在静电纺丝结束时，丝心蛋白部分与收集器分离，在室温下用水-醇溶液处理持续30分钟并风干。这些部分具有50μm的平均厚度。

实施例3

本实施例中描述的测试旨在确定可以保留在纳米纤维丝心蛋白或微纤维丝心蛋白的不同部分中的离子液体的量。

评估实施例1中提及的四种微纤维丝心蛋白织物(透明硬纱、绉绸、斜纹织物和无纺布)的性质和实施例2的纳米纤维丝心蛋白部分的性质。

用于测试的离子液体是1-乙基-3-甲基乙酸咪唑鎓。

根据两种浸渍方法，通过将样品浸泡在液体中，随后通过重力排出液滴，并随后用刷子进行表面沉积，进行试验。在两种情况下，评估在浸渍后和挤压后紧接着保留的液体的量，测量为相对于样品重量的按重量计百分比；通过用0.5kg/cm²的力将通过浸泡获得的样品压缩持续60分钟，并且用0.1kg/cm²的力将通过表面沉积获得的样品压缩持续2分钟来进行挤压。获得的结果在表1中示出。

表1

实施例4

根据本发明的纳米纤维部分和微纤维部分的结合。

将具有3x5cm的尺寸的实施例1的透明硬纱织物的样品、和绉绸织物的一个样品、以及实施例2的纳米纤维部分的样品用离子液体使用表面涂覆并且如实施例3中挤压来处理。

然后用由此浸渍的材料生产透明硬纱/纳米纤维部分混合结构和绉绸/纳米纤维部分混合结构，将结合的材料引入图1中示意的设备中。

每一对材料被引入所述设备中，其中微纤维层(透明硬纱或绉绸)在底部与加热板直接接触；向顶板施加轻微压力(0.1kg/cm²)。将该设备放置在恒温室中以防止热损失，并将底板的温度升高至55℃持续5分钟。在这段时间结束时，将设备从恒温室中取出并允许冷却至室温(在约10分钟内)，然后用注射器将浓度为80％w/w的在水中的乙醇的混合物注射在两个板之间。

然后打开板，并将混合结构转移到相同的水-醇混合物的浴中，以除去所有微量的残余离子液体；混合结构留在该浴中持续24小时。

在这段时间结束时，将混合结构在蒸馏水中冲洗以除去醇并放置在若干层纸巾之间，这些纸巾定期更换，直到结构完全干燥(耗费约12小时)。

实施例5

本发明的纳米纤维和微纤维混合结构的化学表征。

评估单独的丝心蛋白微纤维部分和丝心蛋白纳米纤维部分以及实施例4中得到的混合结构的氨基酸组成。

将三种样品中每一种的约25mg材料在105℃下在真空下用hcl6n水解持续24小时。用自动离子交换氨基酸分析仪分析由此得到的水解产物溶液。分析结果在表2中示出。

表2

实施例6(比较)

根据现有技术的纳米纤维部分和微纤维部分的结合。

为了比较目的，根据文献cn101879330a的程序产生由结合的丝心蛋白纳米纤维和丝心蛋白微纤维组成的四个样品。

使用与实施例4相同的起始材料，按照以下程序产生两种混合结构：

-使纳米纤维部分和微纤维织物(透明硬纱或绉绸)与按重量计4％的丝心蛋白水溶液接触并用该水溶液浸渍；

-所得的结合体系在60℃下处理持续30分钟，并且随后浸入80％w/w甲醇的水-醇溶液中持续15分钟；

-然后在温度和湿度(20℃，65％相对湿度)的受控条件下，使这两个结合体系在室温下经历干燥。

由此得到的混合结构的两个样品在下文中称为“sf膜”。

实施例7(比较)

根据现有技术的纳米纤维部分和微纤维部分的结合。

重复实施例6的程序，唯一的区别在于使丝心蛋白部分与按重量计4％的丝心蛋白水溶液接触并用该水溶液浸渍之后，该体系通过在-20℃下冷冻并随后冷冻干燥来固结。

由此得到的混合结构的两个样品在下文中称为“sf凝胶”。

实施例8

本发明和现有技术的纳米纤维和微纤维混合结构的形态表征。

使用扫描电子显微镜(sem，型号mira3,tescan)观察实施例4中产生的透明硬纱/纳米纤维部分混合结构。为了比较，还在结合之前观察透明硬纱织物的样品和纳米纤维部分的样品。选择透明硬纱织物是因为经纱和纬纱的开放布置留有一些间隙，通过该间隙可以表征与微纤维部分相邻的一侧(结合侧)上的纳米纤维部分的表面。

为了该目的，从混合结构中取出0.5×0.5mm的样品，用双面胶带定位在用于sem的铝样品支架上，并通过溅射涂覆有金-钯。检查了暴露于空气中的两侧，微纤维的两侧和纳米纤维的两侧。

图2中示出了样品的显微照片。

图2-a和图2-b分别显示结合前的微纤维透明硬纱织物和纳米纤维部分；后者具有通过静电纺丝获得的基材(substrate)的典型特征，其中丝心蛋白纳米纤维具有500-600nm的平均直径，不规则地铺设(作为无纺布)并且具有非常细的孔隙率。在结合之后，微纤维部分(图2-c)显示了组分纱线的轻微压平，这可能是由于在结合过程的各个步骤中施加的压力；然而，经纱和纬纱仍然保持它们的最初结构，并且它们由其制成的单个微纤维仍然是良好可见的。

在织物的孔中(图2-d和2-e)，可以看到结合的纳米纤维部分的表面，其保持在低放大率下可见的典型的粗糙度；在一些区域(图2-e)，有更多迹象可以看到部分胶凝的区域，该部分胶凝的区域连接微纤维和纳米纤维并将它们保持为紧密接触。

图2-f示出了结合后暴露于空气的纳米纤维部分的表面。尽管存在纳米纤维的融合区域，但保留对未经处理的天然部分所观察到的典型形态。

图3-a和3-f(特别是图3-f)示出了凝胶薄层的存在，凝胶薄层涂覆微纤维和纳米纤维两者，用纤维间的连接部将它们连接。凝胶层是非常薄且表面的，通过单个微纤维的表面和另外纳米纤维的表面显示，其形态仅在表面上略微变形，同时在材料的剩余部分中基本保持。

最后，图3-b示出了沿着切割边缘的混合结构的周边区域，使用切割边缘采集经历sem观察的样品。该图像示出了本发明的结合方法是有效的，并且即使经历变形和压缩，两个结合部分也不分离，如通常在经历用剪刀或解剖刀切割的区域中发生的那样。

为了比较，在sem下检查根据比较实施例6的程序产生的现有技术的样品(透明硬纱“sf膜”样品)。该样品的图像显示在图4-a和4-b中，且它们显示膜存在微纤维表面上，被压碎并且仅粘附到后者上，并且不能用作与纳米纤维部分的有效的粘合剂。

实施例9

本发明的混合结构的化学-物理表征。

实施例4中产生的透明硬纱/纳米纤维混合结构还通过傅里叶变换红外(ftir)光谱法表征，以验证该结合方法是否引起微纤维组分和纳米纤维组分的物理-化学、结构和构象性质的变化。

使用atr(衰减总反射)模式的nexusthermonicolet光谱仪，其具有装配有sezn晶胞的smartperformer配件。在4000-700cm^-1的波数范围内记录ftir光谱，以4cm^-1的分辨率累积64次扫描。每个光谱是三次测量结果的平均值(图5)。

从聚合物的组成和结构的观点来看，光谱区1900-700cm^-1表示丝心蛋白指纹。最显著的构象敏感带被称为来源于肽键的振动模式的多重性的酰胺i(1615-1690cm^-1)、酰胺ii(1509cm^-1)和酰胺iii(1230-1260cm^-1)。酰胺i主要是由于co键的伸缩振动，以及cn键的贡献；酰胺ii是由于nh键的弯曲(主要的)，以及cn键的伸缩的贡献；酰胺iii是由于nh弯曲和cn伸缩振动。

图5-a示出了处理前的微纤维的光谱(曲线(a))和本发明的混合结构的光谱(曲线(b))的重叠；类似地，图5-b示出了处理前的纳米纤维的光谱(曲线(a))和本发明的混合结构的光谱(曲线(b))的重叠。

基于光谱中酰胺i带、酰胺ii带和酰胺iii带的位置和强度，可以推断，在结合处理之前的微纤维和纳米纤维二者都具有典型的-片层分子构象，这是天然的(微纤维)或再生的(膜、纳米纤维等)晶体丝心蛋白材料特有的。

结合后的光谱轮廓与相应的未处理的样品的光谱轮廓精确地重叠，表明材料的结构特征被保留。

使用酰胺iii带的两个组分来计算材料在结合方法之前和之后的结晶度指数。结晶度指数获得自1260cm^-1处带的强度与1230cm^-1处带的强度之间的比率(ci＝i1260/i1230)。对于微纤维，该指数在结合后保持基本不变，从0.52变化到0.51，而对于纳米纤维，该指数降低了约8％，从0.60至0.55。这种行为与在胶凝过程中的纳米纤维部分的一部分的转化一致，并且随后的凝结比先前存在的凝结采取了较不有序的结构，变为具有粘合性质的过渡相，如通过实施例8中显微照片示出的。

实施例10

本发明的混合结构的结构表征。

通过差示扫描量热法(dsc)进一步表征实施例4中产生的透明硬纱/纳米纤维部分混合结构。

使用量热计200qtainstruments，记录在氮气流下以10℃/min的加热速率从室温到500℃的曲线；将重约5mg的每个样品一式两份引入铝坩埚中并分析。测试结果在图6中示出，图6示出了单独的微纤维(曲线(a))、单独的纳米纤维(曲线(b))和本发明的混合结构(曲线(c))的热分析图。

可以看出，所有曲线都显示在低于100℃的t下的第一个吸热，这可以归因于材料中含有的水分的蒸发。

在微纤维的情况下，随后是峰在313℃的第二个非常强的吸热，这归因于晶体形式的丝心蛋白和具有β片层构象的定向纤维的热降解。

处理前纳米纤维的热分析图(曲线(b))具有相似的轮廓，但是其中第二吸热在较低的温度(282℃)下，表明结晶相的取向度低得多且晶体尺寸比微纤维的情况下不规则得多。

混合结构样品的热线图(曲线(c))示出了两个组分部分的特征性转变：纳米纤维在282℃下的降解峰保持不变，而微纤维的降解峰移动到308℃，可能是由于存在于本发明的结合材料中的非常接近的相互接触的区域中的分子间相互作用。

实施例11

本发明和现有技术的混合结构的机械表征。

对实施例4的样品进行拉伸试验，实施例4的样品由纳米纤维部分(50μm厚度)和作为微纤维组分的透明硬纱编织织物(90μm厚度)的结合组成；为了比较，还测量了单独的纳米纤维部分的条带和微纤维织物的条带的性质。

根据标准unieniso5084:1998方法测量结合之前和之后的样品的厚度。得到的值用于计算应力和模量的机械参数。使用instron测力机型号4501，以10mm的标距长度和10mm/min横杆速率，对具有20×10mm(长度×宽度)的尺寸的部分本身的条带和混合结构测量机械性能。测量在20℃和65％相对湿度下在标准气氛中进行。应力、变形和模量的值由负荷-伸长率曲线计算，且它们代表每个样品的十个测量值的平均值。

获得的结果示于图7中的图形中并且总结在表3中。

微纤维部分(图7-a)的负荷-伸长率曲线通过构成织物结构的纱线的初始的拉伸步骤来表征。一旦被拉伸，如通过负荷值的逐渐增加所示出的，归因于对抗本身增加的抗伸长性的纱线的弹性的固有特性，出现附加的伸长。最后，断裂发生在约50％的伸长率之后。该部分的显着特征是高韧性、同样高的伸长率和相对较低的初始模量。

相反，纳米纤维部分(图7-b)具有正好相反的机械拉伸响应：低韧性和伸长率值、非常高的初始模量。

本发明的混合结构(图7-c)显示了机械行为，该机械行为不简单地是体系的单个组分的加和的结果，而是该机械行为显示出与加和性的偏差，这说明了两个组分部分之间的非常严格且特异的相互作用。事实上，混合结构通过对施加的负荷的非常高的初始阻力来表征。这种阻力归因于两个部分之间在它们的界面处的紧密的相互作用。随着负荷的增加，负荷-伸长率曲线变成锯齿状的，这归因于微纤维部分和纳米纤维部分之间的接触点的相继断裂。该相延伸到20-25％的伸长率值，显著高于纳米纤维部分本身的拉伸不超过6-7％的伸长率值。负荷的进一步增加带出微纤维部分的贡献，然后在45％和50％之间的伸长率断裂，这个值非常类似于部分本身的值。

在测试过程中测量的机械值，还包括应力和模量，在图7-d中示出，并总结在表3中。

表3

实施例12(比较)

为了比较，对现有技术的样品(如实施例7中所描述产生的具有透明硬纱织物的“sf凝胶”样品)重复实施例11的测试。

还按照相同的程序并且在冷冻和冷冻干燥之前将水溶液倒入模具中来产生一片单独的多孔丝心蛋白。

使这些样品的20mm×10mm条带在相同条件下经历与前述实施例相同的测试。

对于多孔片(a)和微纤维/纳米纤维混合结构(b)，结果分别在图8中示出。

多孔片(图8-a)具有非常差的机械性能：负荷强度的平均值为1.1±0.2n，比纳米纤维部分(11.2±1.8n：见图7-b)低约10倍；曲线形状的可变性是由于用上述方法获得的丝心蛋白的多孔材料的质地的异质性。

使用多孔丝心蛋白结合的微纤维/纳米纤维混合结构(b)的负荷-伸长率曲线(图8-b)的特征在于存在两个峰，一个在低变形值处，而另一个在高变形值处。低变形处的峰对应于纳米纤维组分的断裂，如断裂值处的负荷和伸长率(分别为15±2n和5.5±0.2％)所示。

高变形处的峰对应于微纤维基材的断裂(负荷：40±3n；断裂伸长率：29±3％)。

实施例13

本发明和现有技术的混合结构的粘合强度的测量。

从透明硬纱和绉绸织物制备的实施例4的本发明的两个样品以及如实施例6和7中分别描述产生的现有技术的“sf膜”和“sf凝胶”材料中的每一种的两个样品(透明硬纱和绉绸)经历被设计成测量混合结构的两个微纤维组分和纳米纤维组分之间的粘合强度的机械测试。使用instron测力机型号4501，根据标准unieniso13937-2:2000方法进行测试。

具体地，从样品中的每个取出10×40mm矩形条带。在样品的一端，将两个翼部(flap)，一个翼部对应于纳米纤维部分，且一个翼部对应于微纤维部分，通过约10mm的拉伸精细地分离；将这两个翼部锁定在测力机的柄中，如图9中所示。然后启动顶部(可移动)柄，使其以2mm/min的横杆速率远离底部(固定)柄移动，并且对于至少20-30mm的拉伸，连续记录引起微纤维(下部)部分与纳米纤维(上部)部分分离所需要的力(以cn测量)。对每个样品进行至少5次测试，并且对单个结果进行平均。典型的“剥离负荷/行程”曲线在图10-a中示出。从实验数据的处理获得的结果示于表4中和图10-b的条形图中。

表4

实施例14

体外细胞毒性和遗传毒性研究。

考虑到产生用于植入人体和动物体内的支架的应用，评估本发明的复合材料的体外生物学性质。

使用两种人细胞模型，人成纤维细胞(mgm18004e)和人内皮细胞(huvec)进行测试。

将人成纤维细胞培养在含有通过热处理灭活的20％牛胎儿血清(gibco)、200mml-谷氨酰胺(euroclone)、青霉素和链霉素(euroclone)的具有高葡萄糖含量的dmem培养基(gibco)中。

将人内皮细胞培养在含有青霉素和链霉素(euroclone)的ebm-2(用于内皮细胞的基础培养基2,lonza)培养基中。

分析测试被设计为评估作为生物材料的潜在细胞毒性和遗传毒性的标记物的细胞增殖程度和dna破坏程度。

测试测量与细胞增殖直接相关的细胞的代谢活性。将细胞以6000个细胞/cm²的初始密度接种在96孔板中。将单独的培养基和单独的细胞用作空白。测试以技术三份和生物两份进行。将细胞在培养箱中在37℃下，在5％co2存在下培养24、72和120小时。在第3天更换培养基。在温育期结束时，将固定体积的alamar(总体积的10％)加入到孔中。另外的18小时的温育期后，将培养基转移至另一个平板，并用多盘读数器(biotech)记录570nm和600nm处的吸光度值。结果表示为具有单独的细胞的样品和与本发明的生物材料接触的样品之间的百分比差。

dna破坏测试通过检测h2ax组蛋白中磷酸化ser139的存在来评估生物材料的可能的遗传毒性。通过由免疫荧光导致的dna双链中的中断的存在引起磷酸化。将细胞以6000个细胞/cm²的初始密度接种，持续24小时；以3000个细胞/cm²的初始密度接种，持续120小时；以1500个细胞/cm²的初始密度接种，持续120小时。在第3天更换培养基。将用200mmh2o2处理持续16小时的细胞用作阳性对照。在实验结束时，将细胞用4％多聚甲醛(sigma-aldrich)固定，随后用含有0.1％bsa(牛血清白蛋白)和0.25％tritonx-100的磷酸盐缓冲溶液(pbs)透化。通过用封闭缓冲液(pbs中的0.1％bsa)温育来封闭非特异性反应位点。随后，将抗-γh2ax抗体温育持续1小时，并通过第二山羊抗体alexa555抗小鼠igg显示。将细胞核用hoechest33342标记。用leicadmi4000b荧光显微镜(leicamicrosystems)以20x检查板。通过观察对于每个生物重复和对于每个实验条件的3-5个独立的视野来测定dna破坏的阳性细胞的平均数目。

图11示出了细胞生长曲线，表示为对照生长的百分比。在24小时时，人成纤维细胞显示类似于接种到对照孔(聚苯乙烯底物)中的细胞的增殖程度的增殖程度。在72小时时，在与三种sf片(微纤维、纳米纤维和微纤维/纳米纤维混合物)接触的细胞的生长曲线中观察到略微下降，这在120小时时立即恢复。可以推断出，人成纤维细胞增殖的速率不受三种不同sf片的存在干扰。

与三种sf生物材料接触的人内皮细胞显示与对照相比增殖程度的降低。值得注意的是，对于使用人成纤维细胞的测试，三种sf生物材料在长达72小时的细胞增殖方面显示出几乎相同的趋势。然而，使用纳米纤维片的人内皮细胞在120小时时，它们显示出曲线的进一步下降，而混合微纤维/纳米纤维片在测量的与细胞增殖直接相关的细胞代谢活性方面有所增加。

人成纤维细胞的遗传毒性测试结果(图12)显示在72小时温育后h2ax的磷酸化程度增加。这一结果符合alamar增殖测试的趋势，这表明在相同温育时间内细胞的代谢活性略有下降，可能归因于在sf生物材料上培养的细胞的适应期。在24小时和120小时，与在聚苯乙烯上培养的对照细胞相比，在三种sf生物材料上培养的人成纤维细胞显示出显著较低的磷酸化水平，表明三种sf片与对照底物相比对这些细胞的遗传毒性更低。如用alamar测试已经观察到的那样，人内皮细胞与人成纤维细胞行为不同：只有微纤维底物在24小时和120小时诱导h2ax的磷酸化形式的增加，表明该sf贴片与对照底物相比的略高的遗传毒性效应。另一方面，纳米纤维片以及最重要地微纤维/纳米纤维混合片显示在较小程度上的dna破坏，表明在对这种类型的人细胞的遗传毒性方面更好的生物相容性。

评论结果

如由上述测试证明的，本发明的复合材料不仅具有部分复制单独的纳米纤维和微纤维的性质的性质，而且还具有由两种类型的纤维的结合产生的新特征(测力测试，ftir和dsc)。

化学分析结果表明，混合结构具有与起始微纤维部分和纳米纤维部分基本相同的氨基酸组成，该氨基酸组成的特征在于存在大量的仅4个氨基酸(甘氨酸+丙氨酸+丝氨酸+酪氨酸＝89％摩尔)，而所有其它氨基酸以少量(约11％总摩尔)存在。可以推断出，结合过程不改变丝心蛋白的化学结构，和因此即使在结合后，聚合物的生物趋化性也保持不变。

此外，与现有技术的材料相比，本发明的材料在机械测试中显示出更好的粘附和更一致的行为。

特别地，本发明的混合结构的sem图像(图2和图3)显示了部分之间的良好粘附和在相同两部分的纤维之间存在连续聚合物膜，而最接近的现有技术(专利申请cn101879330a，图4)的结构的相似图像示出了应该保证部分之间的粘附、被片段化并粘附至这些部分中的仅一个上的聚合物膜。

拉伸测试表明，本发明的复合材料在约10％与25％之间的伸长率范围内具有独特的特征，这特别是由于两种类型的纤维之间的相互作用。相反，现有技术的结合材料显示出是纳米纤维组分和微纤维组分的行为的纯加和的行为(图8-b)，表明借助于多孔材料结合在一起的微纤维组分和纳米纤维组分表现为单独的相，每个组分保持其固有的性质，而不显示出由结合技术引起的任何改变/改进；相反，通过根据最接近的现有技术产生混合结构，获得了微纤维组分的拉伸性质的恶化，从约63n和48％的负荷和断裂伸长率值分别改变为40n和30％的值。

类似地，两层的混合结构的测力剥离测试证实了在本发明的情况下在纳米纤维部分和微纤维部分之间的粘合强度比现有技术的情况下高得多(图10)。

因此，现有技术的方法不能保证用本发明的方法获得的最终混合结构的两个部分之间的相同的连续性特征：在根据现有技术制造的装置的情况下，这可能导致不同层之间产生形态不连续性和机械不连续性，导致性能和几何特征的损失，直到从机械的角度来看，较弱(例如纳米纤维)层的屈服和/或倒塌。在从机械和生物的角度加压使用的条件下，例如在体内植入进展中可能发生的那些，构成现有技术的混合结构的两个或更多个聚合物相的不同行为可以产生这样大小的局部应力，以致干扰正在进行的再生过程，特别是如果材料暴露于生理液体流中。

本发明的混合结构显示出比微纤维丝心蛋白和纳米纤维丝心蛋白的单独部分更好的体外生物学行为，从生物学行为的观点来看，这进一步增强单独地采用的微纤维部分和纳米纤维部分的已经良好的性能水平：单独的微丝心蛋白(microfibroin)的支架性能已经例如在文章“denovoengineeringofreticularconnectivetissueinvivobysilkfibroinnonwovenmaterials”,dalpra等人,biomaterials(2005)261987中描述。