用于防治阿尔茨海默病的口服制品的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于防治阿尔茨海默病的保健品及其制备方法。

背景技术：

随着人类社会物质、经济水平的改善，人类社会逐步进入老年性社会。伴随而来的是阿尔茨海默病等神经退行性疾病发病率逐年上升。目前认为，神经细胞内氧化还原状态的改变及超氧化物积聚是导致神经细胞凋亡及退化的主要原因。

大豆，是豆类中营养价值最高的品种，在百种天然的食品中，它名列榜首，含有大量的不饱和脂肪酸，多种微量元素、维生素及优质蛋白质。大豆肽是指大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物，它由大豆蛋白水解后的许多种肽分子混合物所组成，产品中还含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆肽含有人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸为限制氨基酸外，其它氨其酸，均超过或接近WHO推荐标准，因此大豆肽具有较高的营养价值。中国是大豆生产大国，但有关大豆肽功能活性研究及机制探讨远远落后于西方发达国家。开发大豆肽相关产品及深入研究大豆肽功能活性机制任重道远。

大豆肽通常是由3～6个氨基酸组成，其分子量分布以低于1000Da为主，主要出峰位置在分子量300～700 Da范围内。大豆肽的蛋白质含量为85%左右，其氨基酸组成几乎完全与大豆蛋白质一样，必需氨基酸的平衡良好，含量也丰富。

从pH与溶解性看，大豆蛋白质在pH4.5等电点附近，会形成沉淀。但大豆肽保持溶解状态，并具有抑制蛋白质形成凝胶、较强的吸湿性和保湿性、调整蛋白质食品的硬度、改善口感和易消化吸收等特性。由此可见，大豆肽很适合于生产速溶饮品和高蛋白质食品。

过去的科学认为，蛋白质经消化道酶促水解后，主要以氨基酸的形式吸收。近两年的科学研究认为，人体吸收蛋白质的主要形式不是以氨基酸的形式吸收的，而是以多肽的形式吸收的，这是人体吸收蛋白质机制的重大突破。

科学试验证明大豆肽是一种活性多肽，具有独特的生理功能，在食品工业上作为功能因子具有十分广泛的用途和较广阔的开发应用前景。大豆肽作为一种健康的食品已经被广泛的研究。综合目前文献研究表明，大豆肽具有下列功能：（1）降低活性氧产生具有抗氧化、抗衰老功能；（2）提高人体免疫力；（3）提高肝的代谢能力；（4）基因合成促进剂；（5）具有降血压和血脂作用；（6）具有降低血糖作用；（7）具有降胆固醇的功能；（8）抑制肿瘤增殖作用。

近年来研究发现大豆肽具有抗氧化作用，其在老年痴呆等神经退行性疾病中的防治作用也逐渐引起科学界的重视。Katayama S等研究发现定期给老年痴呆小鼠及正常衰老小鼠喂养大豆肽，能显著提高小鼠的认知能力。Xi YD等研究表明大豆肽能减缓Aβ_1-42对大鼠的氧化损伤作用。但口服大豆肽是否能改善神经细胞凋亡、神经纤维缠结、突触功能等目前还未见文献报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺少大豆肽是否能改善神经细胞凋亡、神经纤维缠结、突触功能的研究的技术问题，提供一种用于防治阿尔茨海默病的口服制品。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种用于防治阿尔茨海默病的口服制品，该防治阿尔茨海默病的制品的活性成分包括大豆肽，所述大豆肽由复合蛋白酶对大豆水解获得。

进一步的，所述大豆肽的平均分子量为1000～2000道尔顿。

进一步的，所述大豆肽中分子量在3000～5000道尔顿的肽段的质量份数为3%～3.5％；分子量在2000～3000道尔顿的肽段的质量份数为3%～3.5％；分子量在1000～2000道尔顿的肽段的质量份数为10.5%～12％；分子量在500～1000道尔顿的肽段的质量份数为26%～28.5％；分子量在300～500道尔顿的肽段的质量份数为26.5%～28％；分子量在180～300道尔顿的肽段的质量份数为21%～22％；分子量在低于180道尔顿的肽段的质量份数为4～5.2％,各肽段的质量份数之和为100%。

优选的，所述大豆肽中分子量在3000～5000道尔顿的肽段的质量份数为3.15％；分子量在2000～3000道尔顿的肽段的质量份数为3.31％；分子量在1000～2000道尔顿的肽段的质量份数为11.20％；分子量在500～1000道尔顿的肽段的质量份数为27.76％；分子量在300～500道尔顿的肽段的质量份数为27.58％；分子量在180～300道尔顿的肽段的质量份数为21.8％；分子量在低于180道尔顿的肽段的质量份数为5.2％。

本发明的用于防治阿尔茨海默病的口服制品，作用于阿尔茨海默病细胞模型（PC12细胞），能显著降低Aß_25-35对PC12细胞的毒性，可以降低Aß_25-35对PC12诱导凋亡的作用，有效改善老年小鼠记忆认知功能，延缓小鼠老年痴呆进展。我们的发明对进一步了解大豆肽的功能活性，开发大豆肽相关的功能产品提供理论依据，为大豆深加工开拓了新思路。本发明用于防治阿尔茨海默病的口服制品在可以为病人、老年人或体质弱的人补充氮源，快速恢复体力，提高免疫力。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的实施例1的大豆肽在改善Aß25-35对PC12细胞的细胞毒性作用；

图2是本发明的实施例1的大豆肽对PC12细胞的保护作用的细胞核染色检测图；

图3是本发明的水迷宫实验的轨迹图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种用于防治阿尔茨海默病的口服制品，该防治阿尔茨海默病的制品的活性成分包括大豆肽，该大豆肽由复合蛋白酶对大豆水解获得。大豆肽的平均分子量为1500道尔顿。大豆肽中分子量在3000～5000道尔顿的肽段的质量份数为3.15％；分子量在2000～3000道尔顿的肽段的质量份数为3.31％；分子量在1000～2000道尔顿的肽段的质量份数为11.20％；分子量在500～1000道尔顿的肽段的质量份数为27.76％；分子量在300～500道尔顿的肽段的质量份数为27.58％；分子量在180～300道尔顿的肽段的质量份数为21.8％；分子量在低于180道尔顿的肽段的质量份数为5.2％。

实施例2

一种用于防治阿尔茨海默病的口服制品，该防治阿尔茨海默病的制品的活性成分包括大豆肽，该大豆肽由复合蛋白酶对大豆水解获得。大豆肽的平均分子量为1000道尔顿。大豆肽中分子量在3000～5000道尔顿的肽段的质量份数为3％；分子量在2000～3000道尔顿的肽段的质量份数为3％；分子量在1000～2000道尔顿的肽段的质量份数为10.5%；分子量在500～1000道尔顿的肽段的质量份数为28.5%；分子量在300～500道尔顿的肽段的质量份数为28%；分子量在180～300道尔顿的肽段的质量份数为22％；分子量在低于180道尔顿的肽段的质量份数为5.0％。

实施例3

一种用于防治阿尔茨海默病的口服制品，该防治阿尔茨海默病的制品的活性成分包括大豆肽，该大豆肽由复合蛋白酶对大豆水解获得。大豆肽的平均分子量为2000道尔顿。大豆肽中分子量在3000～5000道尔顿的肽段的质量份数为3.5％；分子量在2000～3000道尔顿的肽段的质量份数为3.5％；分子量在1000～2000道尔顿的肽段的质量份数为12%；分子量在500～1000道尔顿的肽段的质量份数为28.5%；分子量在300～500道尔顿的肽段的质量份数为27.5%；分子量在180～300道尔顿的肽段的质量份数为21％；分子量在低于180道尔顿的肽段的质量份数为4％。

实施例1-3的大豆肽，经国家教育部江南大学分析测试中心检验符合大豆肽国际标准。我们以PC12 细胞构建阿尔茨海默病的细胞模型，检测大豆肽在改善Aß_25-35对PC12细胞诱导凋亡的作用；以BALB/c小鼠自然衰老到18个月龄建立衰老动物模型，研究大豆肽在减缓阿尔茨海默病发病及病程进展中的作用，探讨大豆肽在调节神经细胞氧化还原状态、神经细胞凋亡、改善记忆与认知功能方面的机制。经研究发现，我们生产的大豆肽能显著降低Aß_25-35对PC12细胞的细胞毒性；降低PC12细胞凋亡；改善阿尔茨海默病小鼠记忆及认知功能。

一、大豆肽在改善Aß25-35诱导PC12细胞凋亡中的作用的研究

1. MTT实验检测大豆肽在改善Aß_25-35对PC12细胞的细胞毒性作用

对数生长期PC12细胞接种到96孔板中（每孔5×10³）， 24h 后开始加入Aß_25-35（10 µM）及实施例1的大豆肽，继续培养24h-96h；每孔加入20 µL MTT试剂（5毫克/毫升）溶液，并于37℃温育4 h；每孔加入150 µL的DMSO溶解甲臜晶体，震荡溶解后检测490nm处的光密度，结果如图1所示。

图1表明：加大豆肽处理组与Aß25-35处理组比较，OD492值显著增高，说明细胞多于Aß25-35处理组，从而得出施例1的大豆肽显著降低Aß25-35对PC12细胞的细胞毒性的结论。

2. 细胞核染色检测大豆肽对PC12细胞的保护作用

对数生长期PC12细胞按1×10⁴个/mL浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上；24 h 后开始加入10 µM Aß_25-35及施例1的大豆肽处理48 h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整Hoechst 33342/ PI染液浓度至终浓度5 µg /mL，37 ℃避光染色15 min；弃去染液，加入4 %多聚甲醛4 ℃固定5 min；在荧光显微镜下观察拍摄，结果见图2。

图2中的亮点即为凋亡细胞，而大豆肽处理后亮点细胞数显著少于Aß_25-35处理组，可见大豆肽显著降低PC12细胞凋亡率。

二、本发明制品在改善BALB/c自然衰老小鼠记忆和认知方面的效果验证

BALB/c小鼠80只，购自河南省实验动物中心，其中雌鼠60只(未生育)，雄鼠20只，体重20~30 g，标准环境饲养，其中食物购自河南省实验动物中心，饮水为自制单蒸水。

待小鼠生长到18个月，因疾病及预实验损失20只小鼠。从第18个月开始进行进食大豆肽干预，具体分组如下: 8周龄小鼠；18月老年鼠；18月老年鼠+施例1的大豆肽干预组；18月老年鼠+实施例2大豆肽干预组；18月老年鼠+实施例3大豆肽干预组。大豆肽干预组每只小鼠每天灌胃一次，每次400微升不同浓度大豆肽液体；对照组灌入等体积单蒸水。连续干预2个月开始进行水迷宫实验及后续实验。

为检测大豆肽是否对小鼠记忆及认知能力有改善作用，我们采用MT-200 Morris（成都泰盟科技有限公司）水迷宫实验对小鼠进行行为学检测。具体程序包括：①获得性训练（历时5天）：每天4次，将小鼠于平台所在象限对侧象限面壁下水，记录60 s内探寻平台所用时间（逃逸潜伏期），若探寻时间超过60 s，则该鼠逃逸潜伏期按60 s计算，同时引导小鼠到达平台并停留510 s；②探查性检验（1天）：撤去平台，观察小鼠60 s内在目标象限（平台所在象限）停留时间。整个实验过程保持室内灯光、物品摆放等一致，以排除环境干扰。

统计分析：应用SPSS 13.0 软件进行统计学处理，计量资料采用配对t检验及单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05具有统计学意义。

轨迹图结果显示，20月龄的小鼠（老年鼠）记忆认知能力显著低于8周龄小鼠（年轻鼠），而喂食大豆肽溶液后能显著改善小鼠记忆认知功能。在附图3中，线路越长说明小鼠需要的时间越长，记忆力越差。由图3可知，实施例1-实施例3的大豆肽都可以很好的实现小鼠记忆认知功能改善，并且以实施例1的大豆肽效果最好。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。