本发明涉及仔猪养殖，具体涉及一种降低哺乳期仔猪腹泻的粪菌组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
肠道是动物与外界环境接触面积最大的免疫器官，由食物残渣及分解产物、酶、免疫球蛋白、细菌（共生菌和致病菌）及代谢产物、病毒等组成的复杂内环境，当各成分平衡状态被打破，机体呈现不健康状态。研究表明，无论是病毒、细菌、原虫还是动物自身机能、饲料与饲养管理、环境应激、药物所致猪腹泻，腹泻时间都响应了肠道菌群的失衡；如猪流行性腹泻、产毒性大肠杆菌K88感染、新生仔猪腹泻综合症的发生等，都导致了动物肠道内菌群结构的失衡。由于哺乳期仔猪胃肠道较短小，消化器官发育程度低，消化机能不完善，肠道微生物极易失衡；加上哺乳期仔猪与断奶后仔猪、中大猪及成年猪的摄食方式存在很大区别，因而哺乳期仔猪的腹泻防治尤为困难。
目前防治哺乳期仔猪腹泻的主要措施是免疫和药物防治，但效果均不理想，且还可能因抗生素滥用引发抗性细菌繁殖、动物源食品药物残留超标以及环境污染等一系列问题。
粪菌移植是从健康动物粪便中分离功能菌群，然后再移植到患病动物消化道，通过重建患病动物的肠道菌群，从而实现对疾病的治疗。肠道微生物系统是哺乳动物体内非常复杂的系统，肠道菌群种类可达一千余种，细菌总数可达100万亿，是动物细胞数量的10倍以上。菌群定制于动物肠道，经过不断的相互作用和相互竞争，形成动态的微生物平衡，参与机体的营养、代谢与免疫调节。CN105029031A公开了一种通过口腔灌服粪菌移植的方式降低断奶仔猪腹泻发病率的方法；研究表明，该方法对哺乳期仔猪的腹泻防治效果较差，而且该方法需要现配现用，受设备、原料、试剂等条件的限制，不利于大面积推广。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种粪菌组合物，该组合物可以明显降低哺乳期仔猪的腹泻发病率。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为体积百分比。
本发明的目的是这样实现的：
一种粪菌组合物，包括粪便终悬液，其特征在于：所述粪便终悬液为健康猪粪便与无菌生理盐水按体积比1:1～15混匀，在2～5℃条件下以200-500转/min离心5-10min；取其上清液在2～5℃条件下以4500-10000转/min离心10-20min；再倾倒上清液后将沉淀中按体积比1:1～3加入无菌生理盐水混匀，在2～5℃条件下以4500-10000转/min离心10-20min制得。
根据本发明的一个实施方案，上述健康猪粪便为成年健康猪新鲜粪便，优选为300日龄以上健康成年猪新鲜粪便。本发明所述健康成年猪优选荣昌猪但不限于荣昌猪。为了延长上述粪菌组合物的保质期，并兼顾哺乳期仔猪摄入上述粪菌组合物的顺应性，上述粪菌组合物还包括保护剂。制备保护剂配方时，是将低、高分子化合物配合使用。其中高分子化合物类保护剂为脱脂奶，低分子量化合物类保护剂选自甘油、乳糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇、侧金盏花醇、海藻糖中的一种或多种混合。
根据本发明的一个实施方案，上述高分子化合物类保护剂为脱脂奶，其浓度为5～20%，加入量为粪便终悬液等体积。
根据本发明的一个实施方案，上述低分子化合物类保护剂中，甘油加入量为粪便终悬液的10～30%。
根据本发明的一个实施方案，上述除甘油外的每种低分子化合物类保护剂的单独加入量为粪便终悬液体积的1%-6%，比如保护剂包含乳糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖，那么乳糖加入量为粪便终悬液体积的1%-6%、半乳糖加入量为粪便终悬液体积的1%-6%、蔗糖加入量为粪便终悬液体积的1%-6%、葡萄糖加入量为粪便终悬液体积的1%-6%。
优选的，上述保护剂为脱脂奶和甘油，其中脱脂奶加入量为粪便终悬液等体积，其中脱脂奶的浓度为10～15%；甘油加入量为粪便终悬液体积10～20%。上述保护剂还包括半乳糖和蔗糖，其中半乳糖添加量为粪菌终悬液的1%-2%，蔗糖添加量为粪菌终悬液的2%-4%。
为了进一步增加哺乳期仔猪摄入上述粪菌组合物的顺应性，根据本发明的一个实施方案，上述粪菌组合物可以为颗粒剂、粉剂、冻干粉状制剂、微胶囊制剂、缓控释制剂、片剂或混悬剂。
优选的，上述粪菌组合物可以为冻干粉状制剂或微胶囊制剂。
根据本发明的第二方面，本发明的目的在于提供一种上述粪菌组合物的制备方法。
根据本发明的一个实施方案，上述粪菌组合物中加入保护剂制得。
根据本发明的一个实施方案，上述粪菌冻干粉状制剂的制备方法，采用如下步骤：
1）粪便终悬液的制备：
健康猪粪便与无菌生理盐水按体积比1:1～15混匀，在2～5℃条件下以200-500转/min离心5-10min；取其上清液在2～5℃条件下以4500-10000转/min离心10-20min；再倾倒上清液后将沉淀中按体积比1:1～3加入无菌生理盐水混匀，在2～5℃条件下以4500-10000转/min离心10-20min制得；
2）加入保护剂：
在粪便终悬液中加入包括浓度为5～20%粪便终悬液等体积的脱脂奶，粪便终悬液体积10～30%的甘油，以及2～4%蔗糖、1～2%半乳糖在内的保护剂，混合均匀；
3）冷冻干燥：
将混合保护剂的粪便终悬液分装于冻干瓶，在-20℃～-80℃下真空冻干获得粪菌粉剂；
4）与食用饲料混合：
在超净台内，将粪菌粉剂与食品级淀粉（如马铃薯粉、玉米粉等）按体积比1：2～3充分混合形成粪菌冻干粉状制剂，真空密封包装、室温遮光保存。
上述冻干时间优选12h以上，本领域技术人员根据瓶中菌液量适当延长或缩短。
根据本发明的一个实施方案，上述粪菌微胶囊制剂的制备方法，采用如下步骤：
1）粪便终悬液的制备：
健康猪粪便与无菌生理盐水按体积比1:1～15混匀，在2～5℃条件下以200-500转/min离心5-10min；取其上清液在2～5℃条件下以4500-10000转/min离心10-20min；再倾倒上清液后将沉淀中按体积比1:1～3加入无菌生理盐水混匀，在2～5℃条件下以4500-10000转/min离心10-20min制得；
2）加入保护剂：
在粪便终悬液中加入包括浓度为5～20%粪便终悬液等体积的脱脂奶，粪便终悬液体积10～30%的甘油，以及其他低分子化合物类保护剂（乳糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇、侧金盏花醇、海藻糖中的一种或多种混合），其加入量（每种其他保护剂）均为粪便终悬液体积的1%～6%，混合均匀；
3）微胶囊化制粒处理：
加入质量浓度为2%-3%的稳定剂对混合附加剂的粪便终悬液进行微胶囊化制粒处理得到微胶囊颗粒；所述稳定剂为海藻酸钠、壳聚糖、明胶、淀粉中的一种或几种组合；
4）真空干燥：
将微胶囊颗粒与淀粉（如马铃薯粉、玉米粉等）混合，使微胶囊颗粒表面均匀包覆淀粉，然后分装于冻干瓶在-20℃～-80℃下真空冻干获得粪菌微胶囊制剂。
上述微胶囊化制粒的直径为0.5mm～0.8mm为宜，制粒方式可采用本领域技术人员所熟知的锐孔-凝固浴法、乳化交联法或喷雾干燥法，微囊化中稳定剂的用量由本领域技术人员根据实际情况确定。
上述真空干燥后得到的粪菌微胶囊制剂需要密封于室温保存，在饲喂时，每份粪菌微胶囊制剂与2～3份淀粉（如马铃薯粉、玉米粉等）、8～12份乳猪料充分搅拌后饲喂仔猪。
根据本发明的第三方面，本发明的目的在于提供一种上述粪菌组合物在预防或治疗仔猪腹泻方面的用途，尤其是在预防或治疗哺乳期仔猪腹泻方面的用途。
研究发现，粪菌冻干粉状制剂对0～14日龄仔猪（21～28日龄早期断奶法）以及0～21日龄仔猪（35日龄断奶法）的哺乳期仔猪防治腹泻效果更好，更优选为首次接种/使用时间从3日龄开始；而粪菌微胶囊制剂对于14日龄后的哺乳期仔猪以及日粮转变过渡期的仔猪防治腹泻效果更好。
有益效果：
本发明提供一种以成年健康猪新鲜粪便为粪源，经特定低温条件三次离心制得粪菌终悬液，辅以添加高分子量化合物类保护剂脱脂奶粉和低分子量化合物类保护剂（甘油、乳糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇、侧金盏花醇、海藻糖），制得的粪菌组合物，含有丰富的芽孢杆菌、乳酸菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等菌种，且活菌数维持在108CFU/g以上，定制于动物肠道，经过不断的相互作用和相互竞争，可以很好的形成动态的微生物平衡，参与机体的营养、代谢与免疫调节。本发明通过特定原辅料及工艺的配合，发挥协同作用，有效的延长了粪菌组合物的有效期，并改善了粪菌组合物的口感，提高了哺乳期仔猪摄入顺应性。本发明使用粪菌终悬液与特定含量的保护剂，辅以特定的工艺，制得粪菌冻干粉状制剂，并与食品级淀粉（马铃薯淀粉、玉米粉等）混合、真空密封、遮光保存，在保证粪菌移植效果的基础上，进一步改善了粪菌组合物的口感，增强了幼龄仔猪的摄食顺应性，尤其是对0-14日龄仔猪（21-28日龄早期断奶法）以及0-21日龄仔猪（35日龄断奶法）的仔猪防治腹泻有更为明显的效果。本发明使用粪菌终悬液与特定含量的保护剂，结合特定材料进行微胶囊处理，制备工艺具有良好流变特性、易加工制作特性和成模性能，并与食品级淀粉（马铃薯淀粉、玉米粉等）混合后进行真空冻干处理，在加工储藏时不仅能良好封囊并保持芯材的活性，在保证粪菌移植效果的基础上，有效地屏蔽了粪菌悬液的不适气味；通过微胶囊化处理，提高了产品的保存期限，且提高了粪菌组合物的耐逆性，保护粪菌组合物中有效微生物在通过仔猪上消化道时，免受胃酸、消化酶的影响，尽可能多地定植到肠道内增殖并发挥益生作用；尤其是对于14日龄后的猪以及日粮转变过渡期的仔猪防治腹泻效果十分明显。本发明粪菌组合物制备方法简单，制备的产品保质期长，克服了现有技术粪菌移植需要现用现配的缺陷，适合工业化生产。
附图说明
图1是实施例4中使用粪菌粉剂饲喂未断奶仔猪平均活体重统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。
实施例1
供体猪及粪便的筛选方法
300日龄以上的成年猪（性别不限），备选个体无临床腹泻病症和其他重大猪病的临床症状。粪便采集前30天内无抗生素使用、具备清晰的免疫/用药记录。供体猪的筛选方法：利用血清学、抗体检测等手段，参照GB/T22914-2008《SPF猪病原的控制与监测》排除猪常见/烈性传染病原。
表1.供体猪的筛选方法
供体粪便的筛选：参考GB29921-2013《食品中致病菌限量》标准对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌5种致病菌进行检测。
异常毒性检测：参照《中华人民共和国药典》通则1141，对供体粪便进行异常毒性检查。取SPF级小鼠5只（同性别），体重均匀（约18-22g）。每只小鼠灌胃供体粪液0.5mL，观察7天。期间，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，则判定样品符合规定。如不符合上述要求，应另取体重19-21g的SPF级小鼠10只复试1次，判定标准同前。
符合上述三种筛选条件的成年猪粪便作为该粪菌组合物的原料。
实施例2
粪菌冻干粉剂的制备步骤为：
粪便悬液的获取：
将健康成年猪的新鲜粪便1份，加入4℃无菌生理盐水9份，匀浆机振荡混匀；当粪便悬液充分振荡混匀后，用低速离心机在4℃下以300转/分钟离心5分钟，小心收集其上清液；将收集的上清液在以4600转/分钟在4℃下离心15分钟，并倾倒去上清液；离心收集到的沉淀按照1:1比例，再次加入4℃无菌生理盐水，以4600转/分钟在4℃下离心15分钟，并倾倒去上清液，获得粪便终悬液。
粪菌浓度=（湿粪重/最终粪悬液体积）×100%（单位：g/mL）
保护剂的加入：
在粪便终悬液中加入体积比为10%的灭菌甘油（V/V），混匀后放-80℃低温保存，加入与粪便终悬液等体积的浓度为10%的灭菌脱脂奶，再加入粪菌终悬液2%的半乳糖以及粪菌终悬液的3%的蔗糖。
冷冻干燥：
将混合保护剂的粪便终悬液分装于冻干瓶，在-80℃下速冻获得粪菌冻干粉状产品；然后在超净台内将所有冻干瓶中粉剂与马铃薯粉（食品级）按体积比1：2充分混合，将混合后产品密封、室温保存。
实施例3
实施例2制备的粪菌冻干粉剂稳定性实验
粪菌冻干粉剂在常温下密封、避光保存0个月、3个月后，分别取样检测粉剂中芽孢杆菌、乳酸菌、乳酸杆菌、双歧杆菌以及嗜热链球菌含量。芽孢杆菌采用LB平板稀释涂布法检测。乳酸菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌采用国标GB4789.35-2010方法检测。随机抽取5个批次，计算检测结果的平均值，结果见表2：
表2
结论：实施例2制备的粪菌冻干粉剂常温避光保存3个月后，其活菌数维持在107CFU/g以上，表明本发明具有良好的稳定性。
实施例4
实施例2制备的粪菌冻干粉剂在新生仔猪饲养中的应用试验
（一）材料与方法
1、试验产品：实施例1的粪菌粉剂，总活菌数在1亿个/g以上。
2、试验仔猪：试验组1：2胎次荣昌母猪1号所生的15头仔猪；试验组2:两胎次荣昌母猪2号所生的7头仔猪；对照组：两胎次荣昌母猪3号所生的8头仔猪。
3、试验猪场：陶然居种猪场（荣昌区石河镇）
4、试验方法：试验周期为两个月。该试验遵循陶然居猪场日常饲养管理和免疫制度。试验组1按每头2.5g量/天从开食日龄（7日龄）伴喂到乳猪料，连续三天；试验组2从注射补铁剂日龄（3日龄）起按每头2.5mL量口服注射（加少量灭菌生理盐水稀释后便于灌服），连续三天；对照组不加试验产品。记录从出生到2月龄内，各组仔猪腹泻发生率、死亡率，并对第7日龄、14日龄、21日龄、28日龄称重，计算平均体重。
（二）试验结果
1、对促进生长的影响
结果表明，对照组1中新生仔猪平均体重为1540±154.03g；试验组1中新生仔猪平均体重为1206.67±109.125g，与对照组仔猪平均体重差异达到显著水平（P=0.04<0.05）；试验组2中新生仔猪平均体重为883.33±106.93g，与对照组仔猪平均体重差异达到极显著（P=0.004<0.01）；到28日龄时，试验组1仔猪平均体重为6006.67±79.74g，高于对照组仔猪平均体重且差异达到显著水平（4488.33±1668.66g，P=0.01<0.05）；试验组2仔猪平均体重为4725±448.44g，也高于对照组平均体重（P>0.05）。
试验组1为7日龄接种；试验组2为3日龄接种；对照组未接种粪菌粉剂。通过粪菌粉剂饲喂幼年仔猪群发现，试验组2中有2头仔猪在8日龄左右出现轻微拉稀，但2天后自行好转（未使用药物等治疗手段），全窝的腹泻发生率为13.33%；试验组1中3头仔猪在8日龄左右也出现拉稀，3天后好转（未使用药物等治疗手段），全窝的腹泻发生率为42.85%；对照组中仔猪群从5日龄出现拉稀，肌注乙酰甲喹后3天腹泻减轻，但在10日龄左右腹泻加剧，注射右旋糖酐铁+乙酰甲喹+头孢（2mL/头），直到28日龄时仍有仔猪拉稀问题发生，全窝的腹泻发生率为100%。
上述实施例提示，仔猪肠道微生物早期定植“窗口期”在出生后7日龄内；且在该“窗口期”定植本粪菌冻干粉状制剂，可训练哺乳期仔猪免疫系统发育和生长性能发育，提高了哺乳期仔猪存活率和平均活体重，有效地降低了哺乳期仔猪腹泻问题的发生与持续时间。
实施例5
粪菌冻干粉状制剂的制备步骤为：
粪便悬液的获取：
将健康成年猪的新鲜粪便1份，加入无菌生理盐水15份，振荡混匀；当粪便悬液充分振荡混匀后，用低速离心机在5℃下以500转/分钟离心5分钟，小心收集其上清液；将收集的上清液在以8000转/分钟在4℃下离心10分钟，并倾倒去上清液；离心收集到的沉淀按照1:3比例，再次加入4℃无菌生理盐水，在以6000转/分钟在4℃下离心15分钟，并倾倒去上清液，获得粪便终悬液。
粪菌浓度=（湿粪重/最终粪悬液体积）×100%（单位：g/mL）
附加剂的加入：
在粪便终悬液中加入体积比为30%的灭菌甘油（V/V），混匀后放-80℃低温保存，加入与粪便终悬液等体积的浓度为10%的灭菌脱脂奶，再加入粪菌终悬液2%的半乳糖以及粪菌终悬液的2%的蔗糖，粪菌终悬液的2%葡萄糖。
冷冻干燥：
将混合附加剂的粪便终悬液分装于冻干瓶，在-60℃下速冻获得粪菌冻干粉状制剂；然后在超净台内将所有冻干瓶中粉剂与玉米粉（食品级）按体积比1：3充分混合，将混合后产品密封、室温保存。
实施例6
粪菌微胶囊制剂的制备：
1）粪便终悬液的制备：
健康猪粪便与无菌生理盐水按体积比1:9混匀，在5℃条件下以400转/min离心8min；取其上清液在5℃条件下以5000转/min离心12min；再倾倒上清液后将沉淀中按体积比1:2加入无菌生理盐水混匀，在4℃条件下以4500转/min离心10min制得；
2）加入保护剂：
在粪便终悬液中加入浓度为10%粪便终悬液等体积的脱脂奶，粪便终悬液体积20%的甘油，以及粪菌终悬液3%的半乳糖以及粪菌终悬液的2%的蔗糖，粪菌终悬液的2%的海藻糖，混合均匀；
3）微胶囊化制粒处理：
加入质量浓度为2%的稳定剂对混合保护剂的粪便终悬液进行微胶囊化制粒处理得到微胶囊颗粒；所述稳定剂为海藻酸钠；
4）真空干燥：
将微胶囊颗粒与食用饲料马铃薯粉混合，使微胶囊颗粒表面均匀包覆马铃薯粉末，然后分装于冻干瓶在-50℃下真空冻干获得粪菌微胶囊制剂。
实施例7
微胶囊制剂的制备：
1）粪便终悬液的制备：
健康猪粪便与无菌生理盐水按体积比1:5混匀，在3℃条件下以200转/min离心10min；取其上清液在5℃条件下以4500转/min离心20min；再倾倒上清液后将沉淀中按体积比1:1加入无菌生理盐水混匀，在5℃条件下以4500转/min离心20min制得；
2）加入保护剂：
在粪便终悬液中加入浓度为12%粪便终悬液等体积的脱脂奶，粪便终悬液体积30%的甘油，以及粪菌终悬液2%的半乳糖以及粪菌终悬液的3%的蔗糖，粪菌终悬液的4%的麦芽糊精，混合均匀；
3）微胶囊化制粒处理：
加入质量浓度为2%的稳定剂对混合保护剂的粪便终悬液进行微胶囊化制粒处理得到微胶囊颗粒；所述稳定剂为明胶；
4）真空干燥：
将微胶囊颗粒与食用饲料马铃薯粉混合，使微胶囊颗粒表面均匀包覆马铃薯粉末，然后分装于冻干瓶在-20℃下速冻获得粪菌微胶囊制剂。
本发明制备的粪菌组合物，其活菌数在107CFU/g以上，密封避光、常温保存3个月后，其活菌数维持在107CFU/g以上，具有良好的稳定性。
用本发明制备的粪菌组合物防治仔猪腹泻，具有促进新生仔猪生长、提高哺乳期仔猪断奶日龄平均体重，降低哺乳期仔猪腹泻发生率的作用。
在实验过程中还发现，粪菌冻干粉状制剂对0-14日龄仔猪（21-28日龄早期断奶法）以及0-21日龄仔猪（35日龄断奶法）的仔猪防治腹泻效果更好，而首次接种/使用时间从3日龄开始为宜；而粪菌微胶囊制剂对于14日龄后的猪以及日粮转变过渡期的仔猪防治腹泻效果更好。