本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及疫苗的制剂技术，具体涉及用于猪支原体肺炎活疫苗的耐热保护剂及其制备方法和应用。
背景技术：
猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。
使用疫苗是预防猪支原体肺炎的主要手段，目前已经上市的猪支原体肺炎活疫苗(168株)、猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)和猪支原体肺炎活疫苗(Z株)3种疫苗，均在现场使用中取得了良好的效果。但是，以上3种活疫苗常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等，组方简单，保护性能差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，多需要在-15℃以下保存，使这类活疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失效而造成疫病流行。所以，猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂的研究非常急需，发达国家在20世纪80年代就已开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热冻干保护剂生产冻干疫苗，但由于保护剂的研究和应用属于保密资料，本领域技术人员无法获知准确的配方。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明提供用于猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用，所生产猪支原体肺炎活疫苗，受热后疫苗滴度下降少，疫苗的效力更加稳定，且冻干效率高，耗费成本低。
技术方案：用于猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂，由以下组分中的至少两种按重量百分比计酵母提取物1-5％、水解乳蛋白0.5-3％、β-环糊精1-3％、明胶1-3％、蔗糖2-15％、聚乙烯吡咯烷酮1-8％和海藻糖1-6％，其余为磷酸盐缓冲液组成。
优选的，以整体计，每100mL耐热保护剂中，按重量百分比各组分的含量为配方1：明胶1％，蔗糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余为磷酸盐缓冲液组成；
或，配方2：明胶1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余为磷酸盐缓冲液组成；
或，配方3：明胶1.5％，海藻糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，聚乙烯吡咯烷酮1％，其余为磷酸盐缓冲液组成；
或，配方4：β-环糊精1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余为磷酸盐缓冲液组成。
上述用于猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂的制备方法，包括：按照所述比例称取各组分，混合均匀，高压灭菌而得。
上述用于猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂的应用，所述疫苗为猪支原体肺炎活疫苗168株、猪支原体肺炎活疫苗RM48株或猪支原体肺炎活疫苗Z株。
上述应用包括以下步骤：将猪支原体肺炎菌液与猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂混合均匀，冷冻干燥而到。
上述猪支原体肺炎菌液与猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂按照体积比1:0.1-9混合。
优选的，猪支原体肺炎菌液与猪支原体肺炎活疫苗耐热保护剂按照体积比为1:1混合。
上述冷冻干燥的方式为：-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，28h，干燥-15℃～28℃，17h；或者，-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，18h，干燥-15℃～28℃，14h；-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，14h，干燥-15℃～28℃，6h。
优选的，上述冷冻干燥的方式为-40℃预冻3h；程序控温设定：-50℃30min；-8℃15h；13℃1h10min；28℃6h50min。
有益效果：本发明制备优化了得到的具有优异性能的耐热保护剂，尤其适用于猪支原体肺炎活疫苗(168株)，用其制备的猪支原体性肺炎耐热保护剂活疫苗(168株)安全有效、稳定性高，抗原冻干损失率低，耐热性能良好，保存期长。针对该耐热保护剂匹配了适宜的冻干操作条件，进一步促进了其对抗原的保护效果，并提升了冻干效率。所制备的猪支原体肺炎活疫苗(168株)在37℃放置10日后，抗原含量不下降超过1个滴度；在2～8℃保存30个月后，仍保存冻干后的外形，抗原含量仍≥106CCU每头份；其真空度、剩余水分等各项检验均合格。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1(猪支原体肺炎耐热保护剂活疫苗(168株)的制备及检验)
1.实验材料
1.1毒株：猪支原体肺炎活疫苗(168株)由贵州福斯特生物科技有限公司提供。
1.2材料：KM2培养基及相关实验耗材由贵州福斯特生物科技有限公司提供。
1.3试剂：β-环糊精、明胶、蔗糖、水解乳蛋白、酵母提取物、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等均为分析纯，购自试剂公司。
1.4耐热保护剂的配制
按照以下配方组成配制保护剂，具体如下：
配方1耐热保护剂(重量百分比：％)，各组分的含量为明胶1％，蔗糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余为磷酸盐缓冲液组成。
配方2耐热保护剂(重量百分比：％)，各组分的含量为明胶1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余为磷酸盐缓冲液组成。
配方3耐热保护剂(重量百分比：％)，各组分的含量为明胶1.5％，海藻糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，聚乙烯吡咯烷酮1％，其余为磷酸盐缓冲液组成。
配方4耐热保护剂(重量百分比：％)，各组分的含量为β-环糊精1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余为磷酸盐缓冲液组成。
对照组配方常规保护剂(根据现行版《中国兽药典》附录配制)，各组分的含量明胶1.5％，蔗糖12.5％，其余为纯水。
根据配方设计，将各组分完全溶解混合均匀后，于121℃灭菌15分钟，即得。
2.疫苗的制备
2.1配苗与分装
上述5个配方的耐热保护剂的应用，是将配制好的耐热保护剂与猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌液半成品(细菌含量≥108CCU/mL)按照1:1比例相混合，分装至西林瓶中，每瓶分装量2mL，疫苗规格10头份/瓶。
2.2疫苗的冻干
将分装好的疫苗按照如下程序进行冻干：-40℃预冻3h；程序控温设定：-50℃30min；-8℃15h；13℃1h10min；28℃6h50min。
3.疫苗的检验
3.1安全性检验以下二者均符合才能合格
(1)小鼠安检
每个配方疫苗任取5瓶加生理盐水10倍稀释混合后，接种18～22g清洁级小鼠5只，每只皮下接种5头份，观察10日，应全部健活。如个别死亡，可重检一次。重检应全部健活。
(2)猪安检
用5～15日龄健康易感猪3头，各右侧肺内注射疫苗10头份，观察25日。记录如下重要的症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤和死亡，注射后第1～25日的每日上午检测直肠温度。根据猪安检实验临床症状评判标准，猪安检实验全部累计总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分2～5分，可重检1次。重检累计总分不大于2判为安全。
猪安检试验临床症状判定标准如下：
记录如下症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡和直肠温度等。发病猪临床症状评判标准见表1。
猪安检试验中，每头试验猪症状全部累计，总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分2～5，可重检1次，重检累计总分大于2判为安全。
表1猪支原体肺炎发病猪临床评判标准
3.2耐热性能的检验
分别将冻干的猪支原体肺炎耐热保护剂活苗(168株)5个组别分别置于37℃放置不同时间10日后，取出后分别进行耐热前后疫苗物理性状、剩余水分、纯粹检验、鉴别检验、真空度测定和效率检验。
(1)物理性状、纯粹检验、鉴别检验、剩余水分和真空度测定按照现行版《中国兽药典》进行，结果均应符合规定。
(2)效力检验采用CCU含量测定方法将猪肺炎支原体待测培养物用KM2培养基进行10倍连续稀释，即1.8mLKM2培养基接种0.2mL样品，依次1：10递减连续稀释成10-1、10-2……10-8、10-9、10-10、10-11、10-12，另设KM2培养基对照3管，共15管，同批作3个重复，置37℃培养，每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化直至第10日，并对培养物涂片，染色，镜检，检查有无典型猪肺炎支原体菌体形态。稀释培养后，菌体生长、变色的最高稀释度为待检培养物CCU含量。
3.3保存期试验
按照耐热保护剂配方1～5，试制的疫苗放置在2℃～8℃保存6、12、18、24和30个月后月测定CCU，观察疫苗保存期内的稳定性。
4.结果与分析
4.1安全性检验及物理性状、剩余水分、纯粹检验、鉴别检验、和真空度测定的差异，按照不同配方1～4和对照组试制的疫苗按照现行版《中国兽药典》见表1
表1不同配方的安全性检验及物理性状、剩余水分、纯粹检验、鉴别检验、和真空度测定
4.2耐热冻干保护剂的筛选根据猪支原体肺炎活疫苗(168株)的特点，选择不同的保护剂基质设计5组耐热冻干保护剂，各组保护剂的配比配方1～4和对照组。在抗原含量相同的情况下，与设定好的保护剂进行混合后冻干，比较冻干前后的效价差异及耐老化试验后及保存期效力含量上的差异。结果如表2。
表2不同配方的冻干前后效力检验、耐老化实验及保存期测定
从表1、表2的结果显示，不同耐热保护剂配方1～5生产的猪支原体肺炎活疫苗(168株)在安全性检验及物理性状、剩余水分、纯粹检验、鉴别检验、和真空度测定上没有明显差异，符合现行版《中国兽药典》的要求。在耐热性能上配方3要优于其他配方，在保存期的效价上，配方3要优于其他配方组，能够在2℃～8℃维持107CCU每头份高效价。同时，配方1～4要在耐热性能及保存期上要远远优于对照组常规配方，效力检验上能够达到现行版《中国兽药典》的要求。
实施例2(合格产品冻干保护剂冻干曲线的优化)
1、实验方法
根据所用冻干机器(型号：LY0-05；生产厂家：东富龙科技股份有限公司)的性能特点、实施例1所筛选的耐热保护剂配方3及冻干的生物学特性及生化指标等因素，初步设定了3组冻干曲线，以最佳的适宜生产的冻干曲线；按照实施例1制备猪支原体肺炎耐热保护剂活疫苗(168株)，冻干曲线分别为：
(1)-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，28h，干燥-15℃～28℃，17h；
(2)-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，18h，干燥-15℃～28℃，14h；
(3)-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，14h，干燥-15℃～28℃，6h。
2、实验结果
保护剂配方3冻干曲线优化结果见表3。
表3优化后保护剂配方冻干曲线优化结果
从表3可以看出，第3组冻干曲线制备的活疫苗在37℃耐热后的CCU含量不下降，比其他2组冻干曲线制备的疫苗更有优势。
综上，本发明耐热保护剂及使用该保护剂的猪支原体肺炎活疫苗(168株)的制备可用于大规模生产，并且能够在37℃耐热保存10天抗原含量不下降，同时在2℃～8℃保存不同30个月，效价不降低，并且安全，稳定性高。