多肽露那辛在抗动脉粥样硬化药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及多肽露那辛(lunasin)在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术：

动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是指在动脉及其分支的动脉壁内膜及内膜下脂质沉积，单核/巨噬细胞浸润并摄取脂质形成泡沫细胞，同时伴有中层平滑肌细胞增殖并向内膜下迁移，使内膜增厚，形成黄色或灰黄色状如粥样物质的斑块。

血管内皮细胞(vec)结构与功能完整，是机体维持血管张力，调节止血与抗血栓形成功能平衡的重要环节，而慢性或反复血管内皮细胞(vascularendothelialcell，vec))损伤则是as发生的始动因素。在吸烟、高脂、氧化应激等因素刺激下，血管内皮细胞(vec)受到损伤，就会发生血管内皮功能障碍(dysfunction)，从而引发as等心脑血管疾病。

as可始发儿童期并持续进展，通常在中老年出现症状。在发达国家，as性心血管疾病是造成病残或病死的重要病因，然而，近年来随着国内人民生活水平的提高和饮食结构的改变，as发病在我国亦呈不断上升趋势，其防治研究越来越受关注，因此研究新的有效的抗动脉粥样硬化药物具有重要的应用价值。

露那辛(lunasin)是一种最初从大豆中分离得到的活性肽，由43个氨基酸残基组成，其序列为：skwqhqqdscrkqlqgvnltpcekhimekiqgrgddddddddd(seqidno：1)，分子量为5kda(s.odani，jbiolchem262(1987)10502-10505.)。已有研究表明，lunasin具有抗肿瘤活性，在体外可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖(e.j.mcconnell，oncotarget6(2015)4649-4662.)，抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭(q.jiang，oncolrep36(2016)253-262.)，在体内可抑制小鼠皮肤癌和乳腺癌的发生(c.c.hsieh，jfoodsci75(2010)h311-316.)。

本发明首次发现并通过动物实验证明多肽露那辛(lunasin)具有抗动脉粥样硬化的药理活性，可用于制备抗动脉粥样硬化的药物。

技术实现要素：

本发明公开了多肽露那辛(lunasin)在制备防治动脉粥样硬化药物方面的新用途。

此外，本发明还涉及多肽露那辛(lunasin)在制备预防和治疗动脉粥样硬化所致疾病的药物中的应用。其中，所属疾病为心血管疾病，例如心绞痛、心肌梗死、外周血管疾病、高血压或糖尿病血管病变等。

本发明通过体内动物实验证明多肽露那辛具有抗动脉粥样硬化的药理活性。本发明给予apoe^-/-小鼠高脂饲料6周以使其发生动脉粥样硬化，随后采用腹腔注射0.5μmol/kg·d露那辛4周后，结果发现多肽露那辛可显著抑制apoe^-/-高脂动脉粥样硬化模型小鼠动脉管壁粥样硬化斑块的形成并增强粥样斑块稳定性。

附图说明

图1：小鼠整体主动脉油红“o”染色结果。图1-1：小鼠主动脉油红“o”染色。a：正常对照组(c57bl/6+ns)；b：阴性药物组(c57bl/6+0.5μmol/kglunasin)；c：模型组(apoe^-/-+ns)；d：lunasin药物组(apoe^-/-+0.5μmol/kglunasin)。图1-2：主动脉斑块面积统计结果。^####表示模型组与正常对照组比较，p＜0.0001；^***表示lunasin药物组与模型组比较，p＜0.001(n＝3，means±sem)。

图2：组织切片采用movat五色套染检测结果。

图3：巨噬细胞免疫荧光检测结果。a.正常对照组(c57bl/6+ns)；b.阴性药物组(c57bl/6+0.5μmol/kglunasin)；c.模型组(apoe^-/-+ns)；d.lunasin药物组(apoe^-/-+0.5μmol/kglunasin)。

具体实施方式

实施例1动脉粥样硬化动物模型的建立及给药处理

20只6周龄apoe^-/-小鼠及12只c57bl/6小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2012-0001。动物喂养于spf级动物房，维持室温25℃，湿度40％-70％，明暗各12h，小鼠自由进食饮水。小鼠给予基础饲料适应性喂养1周后，apoe^-/-小鼠给予高脂饲料(researchdiets，d12108c)，c57bl/6小鼠给予基础饲料，喂养6周后，apoe^-/-小鼠及c57bl/6各取4只，麻醉处死后，取主动脉根部用movat五色套染法染色检测造模是否成功。确认造模成功后，apoe^-/-小鼠随机分为模型组(生理盐水)、给药组(0.5μmol/kglunasin)，c57bl/6小鼠随机分为正常对照组(生理盐水)和阴性药物组(0.5μmol/kglunasin)。多肽露那辛(lunasin)药物采用本实验室建立的基因工程方法(setrerrahmane，s.applbiochembiotechnol174(2014)，612-622)制备得到。采用腹腔注射方式给药，1次/天，给药剂量为0.5μmol/kg，连续给药4周后，小鼠麻醉后处死，分离主动脉弓至髂总动脉分叉处的整条动脉进行油红“o”染色，同时取主动脉根部进行组织切片和movat五色套染及巨噬细胞免疫荧光实验。

实施例2小鼠整体主动脉油红“o”染色：

实验结束后小鼠麻醉后，小心解剖分离出完整主动脉，经4％多聚甲醛固定后，流水冲洗10min，剥去外膜的结缔组织，双蒸水浸泡3min后，油红“o”工作液中染色2h，70％乙醇浸泡标本至斑块呈现红色，底色呈现白色为止。蒸馏水冲洗后浸入甲醛中长期固定保存。

小鼠整体主动脉油红“o”染后，主动脉内斑块呈红色，结果如图1所示：野生型c57bl/6正常对照组小鼠(1-1a)和阴性药物组小鼠(1-1b)主动脉壁光滑、平整、有弹性，与周围组织无粘连，几乎无阳性as染色斑块。模型组apoe^-/-小鼠主动脉壁粗糙，弹性欠佳，可见较多突向管腔，且主动脉红色斑块面积与正常组比较显著增多(p＜0.0001)，而lunasin药物组apoe^-/-小鼠主动脉内红色斑块显著减少(p＜0.001)。结果表明apoe^-/-小鼠给予高脂饲料喂养6周后可形成明显动脉粥样硬化斑块，腹腔注射0.5μmol/kglunasin可显著抑制其动脉斑块的形成。

实施例3组织切片及movat五色套染检测

紧贴主动脉根部离断心脏，立即放入4％多聚甲醛中固定48h后，从心耳下冠状面剖切心脏，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度4μm。切片常规脱蜡复水后采用russell改良movat五色套染法染色并用zeiss显微镜观察拍照。具体操作步骤如下：

1、取适量bouin固定液放入微波炉中，中度加热30～60s(入片时为50℃)，立即放入切片处理10min。流水冲洗10min。

2、海波溶液处理5min，蒸馏水冲洗3min×3次。

3、1％阿利新蓝染色液中染色20min，流水冲洗2～5min。

4、用微波炉强火45～60℃预热碱性乙醇溶液后，将切片放入碱性乙醇溶液中处理10min。流水冲洗5min。

5、切片入预先配制好的试剂weigert苏木素染色液中，避光染色60min。流水冲洗3次，蒸馏水冲洗3min×3次

6、切片入预先配制好的试剂(e)-藏红品红染色液中，避光染色1min。蒸馏水冲洗2～3次，每次3～5min。

7、将切片入5％磷钨酸溶液中处理5min，直接转入弱酸分化液中处理5min。蒸馏水冲洗2～3次，每次3～5min。

8、脱水：95％乙醇1min，100％乙醇2次，每次1min。

9、将切片入藏红花染色液中，染色5min。

10、脱水：无水乙醇2次，每次1min。二甲苯透明，中性树胶封片。

movat五色套染后，细胞核和弹力纤维呈黑色，胶原蛋白和网状纤维呈黄色，蛋白聚糖呈蓝绿色，类纤维素、纤维素呈深红色，心肌平滑肌呈红色，泡沫细胞呈紫色。

结果如图2所示：正常组小鼠和阴性药物组小鼠可见主动脉内膜厚度均一，表面光滑。模型组apoe^-/-小鼠主动脉根部经movat五色套染后，可见主动脉瓣膜芽瓣增宽延长，内膜增厚显著，可看到明显动脉粥样硬化斑块，表面有大量紫色泡沫细胞覆盖，胆固醇酯及胆固醇结晶明显增多，纤维帽较薄，脂质侵蚀，钙化，黄色胶原成分明显减少，内膜表面凸凹不平，显示出易损斑块特征。lunasin药物治疗后，与模型组比较，可显著抑制内膜的增厚，胆固醇酯及胆固醇结晶亦明显减少，黄色胶原蛋白和黑色弹力纤维成分明显增多，内膜表面相对平整，斑块稳定性增加。

由此证明，lunasin可显著抑制高脂饮食所致的apoe^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成，并增强了斑块的稳定性，对动脉粥样硬化的发展具有显著的抑制作用。

实施例4巨噬细胞(mcp-1)免疫荧光检测

按实施例3所述方法进行组织切片，并进行以下巨噬细胞(mcp-1)免疫荧光检测实验。

1、组织切片后，60℃烤1h；

2、依次脱蜡：二甲苯i15min，二甲苯ii15min，无水乙醇5min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，pbs5min；

3、脱蜡后的切片置于柠檬酸缓冲液中，加热煮沸20min，自然冷却后，pbs洗3次，5min/次；

4、3％h2o2室温10min，pbs洗3次，5min/次；

5、10％山羊血清封闭，室温30min；

6、弃封闭液，滴加mcp-1一抗(1∶200)，4℃孵育过夜；

7、37℃复温45min，pbs洗3次，5min/次；

8、滴加alexafluor488标记的羊抗兔二抗(1∶500)，37℃避光孵育60min；

9、pbs洗3次，5min/次；

10、滴加dapi，染色10min，晾干，加甘油封片。倒置荧光显微镜下观察拍照。

结果如图3所示结果：正常对照组c57bl/6小鼠和阴性药物组c57bl/6小鼠主动脉根部内膜无增厚，亦未见绿色荧光巨噬细胞浸润(图3a-b)；模型组apoe^-/-小鼠主动脉根部内膜明显增厚，有明显斑块沉积，并且斑块表面有大量绿色荧光的巨噬细胞浸润(图3c)；给予lunasin治疗后，可显著抑制apoe^-/-小鼠主动脉根部内膜的增厚，并且斑块表面呈绿色荧光的巨噬细胞亦有显著减少(图3d)。

综上所述，模型组apoe^-/-小鼠主动脉根部内壁有斑块沉积，并且有大量巨噬细胞浸润，lunasin治疗4周后，可显著减少巨噬细胞浸润，抑制动脉粥样斑块的形成。