西曲瑞克在制备治疗艾滋病的药物中的应用的制作方法

本发明属于药物技术领域，具体涉及西曲瑞克(cetrorelix)及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用。

技术背景

艾滋病，是一种由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)感染引起的一种严重传染病。作为一种可以直接破坏人体免疫系统的慢性传染病，艾滋病已经成为世界上严重威胁人类健康的疾病之一。联合国艾滋病规划署(unaids)的数据显示，截至2011年年末，全球共有3420万人感染了hiv。目前我国艾滋病流行正处于快速增长期，感染人数逾78万(unaids,2011)。因此，对hiv/aids的防治已成为不容忽视的社会问题和重大科研课题。研发新型的抗hiv药物是治疗和防控艾滋病的主要途径。20世纪90年代以来，随着人类对病毒及其感染过程的分子生物学研究的不断深入，以及药物研发技术的不断创新，抗病毒药物有了突飞猛进的发展，尤其是抗hiv的药物。许多大型国际制药公司，如辉瑞、默克、葛兰素史克、罗氏、雅培、百时美施贵宝等，投入大量资源用于抗hiv的药物研发。其中，部分公司已经拥有多种抗hiv药物，并借此获得丰厚的收益和回报。自1987年第一个治疗hiv感染的药物齐多夫定(zidovudine,azt)被美国fda批准上市以来，截止2013年已有33种抗hiv病毒的化学实体药物被美国fda批准上市，其中包括18种逆转录酶抑制剂，11种蛋白酶抑制剂，2种整合酶抑制剂，1种ccr5协同受体拮抗剂和1种膜融合抑制剂(usfda，2013)。这些不断涌现出来的抗hiv新药能够有效地抑制人体内hiv病毒的复制，减缓艾滋病发展进程，大大提高了艾滋病人的平均存活时间。但是，由于这些药物主要靶向逆转录酶、蛋白酶、gp41和整合酶等有限的几个病毒蛋白，病毒通过频繁变异极易适应和逃避药物施加的选择压力。随着这些药物的广泛使用，很容易产生交叉耐药性及严重的毒副作用，使其临床应用受到很大限制。而且目前使用的抗hiv感染药物还存在其他种种弊病,诸如价格昂贵、使用不方便、毒性高,服药繁琐、不能清除体内病毒等。综合以上原因,开发新药势在必行，需要不断地创制出新的、高效的、价廉的抗hiv药物。

药物重定位(drugrepositioning)是快速发现抗癌药物的优选策略。药物重定位，也称为旧药新用，是指利用相关的技术方法对已有的药物进行重新筛选、组合或改造从而发现其未知新用途的过程。相比于从零开始的新药研发，药物重定位基于已有药物的重新开发能够节省大量前期研发投入(如药靶发现、化合物筛选、安全性测试等)。因此，系统地发掘和评价所有上市药物的抗hiv潜力对于新颖抗hiv药物发现和药物重定位用于艾滋病治疗具有重要意义和重大价值。但是通过实验来筛选所有的上市药物是一个艰难的、花费昂贵而又耗时的过程。

因此本发明利用新开发的预测化合物抗hiv活性的方法发现并验证西曲瑞克具有抗hiv活性，可在制备治疗艾滋病的药物中进行应用。目前，现有技术中未见有快速准确地预测和发现已有药物具有抗hiv活性的方法的报道，也未见有西曲瑞克具有抗hiv活性的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于开辟西曲瑞克(cetrorelix)药物的新用途，提供化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用。

如所述的化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用，

其中所述的药物中含有0.5-90％的有效成分西曲瑞克，其余为药物学和药剂学上可接受的，对人和动物无毒的药用辅料或载体。

如所述的化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用，

其中对化合物西曲瑞克进行体外抗hiv活性实验，结果表明化合物西曲瑞克具有显著的抗hiv活性且细胞毒性较低。

如所述的化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用，选用人t淋巴细胞系c8166和hiv-1实验株hiv-1nl4-3对西曲瑞克进行体外的细胞毒性和抗hiv活性检测，其中细胞毒性使用mtt比色法检测，抗hiv活性利用合胞体抑制试验和hiv-1p24抗原定量两者方法进行检测。

如所述的化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用，西曲瑞克对细胞的毒性很小，cc50>200μm；在浓度等于ec50时，西曲瑞克对细胞c8166完全没有毒性。

如所述的化合物西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用，西曲瑞克对hiv-1诱导c8166细胞形成合胞体的抑制作用的ec50为15.284μm，治疗指数ti大于12.3；在hiv-1p24抗原定量结果显示西曲瑞克抑制p24抗原作用的ec50为1.788μm，治疗指数ti大于105.3。

如所述的西曲瑞克及其药学上可接受的盐在制备治疗艾滋病药物中的应用，所述的西曲瑞克的药学上可接受的盐是指与有机酸或无机酸形成的药学上可接受的盐，所述的有机酸为酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丙酸、丁酸、草酸、马来酸、己二酸、藻酸、柠檬酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、甲磺酸、烟酸、2-萘磺酸、扑酸，果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、琥珀酸，所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸。

西曲瑞克(cetrorelix)作为药物时，可直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物中含有0.1-99％的西曲瑞克(cetrorelix)化合物，优选为0.5-90％的有效成分西曲瑞克(cetrorelix)，其余为药物学和药剂学上可接受的，对人和动物无毒的药用辅料或载体。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

与现有技术相比，本发明优益性在于：

为了预测和找出具有抗hiv活性的药物化合物，本发明首次采用如下的技术来进行操作。目前还没有只利用化合物的结构就可以直接预测化合物抗hiv活性的方法。本发明通过利用大量的抗hiv活性数据并整合相对频率权重的分子指纹方法以及机器学习方法(向量机和随机森林)来实现对化合物的抗hiv活性的预测。该技术只需要输入化合物的结构就可以快速而准确的预测出该化合物是否具有抗hiv活性。利用该技术本发明发现西曲瑞克具有显著的抗hiv活性且细胞毒性较低，可以在制备治疗艾滋病的药物中应用。西曲瑞克目前是用于制备防止提前排卵，进而进行采卵和辅助生殖技术治疗的药物。因此，现有技术中还未有任何下述机理和方法的记载。

本发明首先建立了一个称为“anti-hiv-predictor”的抗hiv化合物预测和发掘平台(http://bsb.kiz.ac.cn/anti-hiv-predictor)。该平台的建立过程见图1。该平台整合3种方法(相对频率权重的分子指纹方法rfw_fp、支持向量机方法svm和随机森林方法rf)来预测化合物的抗hiv活性。该平台的roc曲线线下面积大于0.95并且准确率超过93％(图2)。因此该平台可以快速准确地预测指定化合物是否具有抗hiv活性。本发明利用该平台对已经上市的1835个药物进行预测和筛选，以便对这些药物进行药物重定位用于抗hiv治疗。本发明预测出来若干新的抗hiv化合物，这些化合物到目前为止都没做过任何的抗hiv活性实验。因此，本发明对这些化合物进行了一系列的体外抗hiv活性实验。实验结果发现化合物西曲瑞克(cetrorelix)具有显著的抗hiv活性且细胞毒性较低。因此西曲瑞克对艾滋病具有很高的治疗指数。西曲瑞克，一个合成的十肽，是促性腺激素释放激素的拮抗剂。目前，西曲瑞克的适应症为对进行控制性卵巢刺激的患者，防止提前排卵，进而进行采卵和辅助生殖技术治疗。未有抗hiv活性的报道。因此，本发明开辟了西曲瑞克药物的新的用途即作为制备治疗艾滋病药物的应用。

本发明选用人t淋巴细胞系c8166和hiv-1实验株hiv-1nl4-3对西曲瑞克进行体外的细胞毒性和抗hiv活性实验。其中细胞毒性使用mtt比色法检测，抗hiv活性利用合胞体抑制试验和hiv-1p24抗原定量两者方法进行检测。使用不同剂量的西曲瑞克，结果发现该药物具有明显的抗hiv效果，因此可作为制备治疗艾滋病药物的应用。

附图说明

图1显示：抗hiv化合物预测和发掘平台“anti-hiv-predictor”的建立过程和在药物重定位中的应用；

图2显示：抗hiv化合物预测和发掘平台“anti-hiv-predictor”的预测性能；

图3显示：西曲瑞克对c8166的毒性作用(方块曲线)和对hiv-1p24的抑制作用(圆点曲线)。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1

检测西曲瑞克(cetrorelix)的抗hiv作用：

1、实验目的：测试西曲瑞克(cetrorelix)的抗hiv作用

2、实验材料

2.1.测定药物和化合物

待测样品西曲瑞克购自大连美仑生物技术有限公司。阳性对照化合物叠氮胸苷(3’-azido-3’-deoxythymidine，azt)购自sigma公司。待测样品根据溶解性溶解于rpmi-1640完全培养基或dmso中，溶解于dmso中的样品储液浓度为50mm，溶解于rpmi-1640完全培养基的样品储液浓度为10mm、5mm或2mm(根据溶解度确定)，储存条件为：-20℃；azt溶解于rpmi-1640完全培养基中，0.22μm滤膜过滤除菌，贮存液浓度为6mg/ml，分装后-20℃保存。

2.2.试剂和溶液

2.2.1.试剂

hepes(n-2(2-hydroxyothyl)piperazine-n'-(2-ethanesufonicacid)、mtt(3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)、dmf(n,n’-dimethylformamine)、青霉素(penicillin)、硫酸链霉素(streptomycinsulfate)、谷氨酰胺(glutamine)均购自sigma公司；2－巯基乙醇(2－me，2-mercaptoethanol)为bio-rad公司产品。rpmi－1640和胎牛血清为invitrogen公司产品。

2.2.2.培养基

rpmi-1640完全培养基，含有10％胎牛血清,2mm谷氨酰胺，10mmhepes，50μm2-巯基乙醇，100,000iu青霉素，100μg/ml链霉素。

2.3.细胞和病毒

人t淋巴细胞系c8166、hiv-1实验株hiv-1ⅲb由英国medicalresearchcouncil,aidsreagentproject惠赠。hiv-1实验株hiv-1nl4-3由nih惠赠。所有细胞和病毒均以含10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备hiv-1ⅲb和hiv-1nl4-3，滴定并计算出病毒的tcid50。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。

3、hiv-1感染性滴定

hiv-1nl4-3按johnson&byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将hiv-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入c8166细胞50μl，每孔终体积为200μl。37℃,5％co2培养。第3天补加新鲜rpmi-1640完全培养基100μl，第7天在倒置显微镜下观察每孔中hiv-1诱导的细胞病变效应(cytopathiceffect,cpe),以每孔是否有合胞体(syncytium)的形成确定；按reed&muench方法计算病毒的tcid50(50％tissuecultureinfectiondose)。

4、对c8166细胞的毒性实验

4×10⁵/mlc8166细胞悬液100μl与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔,37℃,5％co2培养3天，采用mtt比色法检测细胞毒性。elx800酶标仪测定od值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。计算得到cc50值(50％cytotoxicconcentration)，即对50％的正常t淋巴细胞系c8166产生毒性时的药物浓度。

5、对hiv-1nl4-3致细胞病变(cpe)的抑制实验

将8×10⁵/mlc8166细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的hiv-1nl4-3稀释上清，1300tcid50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。azt为阳性药物对照。37℃,5％co2培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。ec50(50％effectiveconcentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。

6、对hiv-1nl4-3急性感染c8166细胞中病毒复制的抑制实验

将4×10⁵个/ml的c8166细胞与hiv-1nl4-3(moi＝0.04)在37℃下感染2小时，用pbs离心洗涤2次，去除游离的病毒离子，取100μl细胞接种到含有100μl不同稀释度待测化合物的96孔板上，37℃，5％co2培养3天。培养上清离心后收集，用终浓度0.5％tritonx-100裂解灭活。检测药物对hiv-1复制的抑制作用采用捕捉p24抗原elisa方法。

7、elisa检测p24抗原

1μl/板抗鼠igg-fc抗体4℃铺板过夜；5％脱脂奶粉4℃封板过夜；加入100μl/孔鼠抗p24单抗(利用liugj等人建立的方法制备，liugj,wangjp,xiaojc,etal.preparationandcharacterizationofthreemonoclonalantibodiesagainsthiv-1p24capsidprotein[j].cellmolimmunol,2007,4(3):203-208.)，37℃，1小时；加入100μl/孔裂解感染细胞培养上清，37℃，2小时；加入100μl/孔1：100稀释的兔抗p24多抗(利用liugj等人建立的方法制备，liugj,wangjp,xiaojc,etal.preparationandcharacterizationofthreemonoclonalantibodiesagainsthiv-1p24capsidprotein[j].cellmolimmunol,2007,4(3):203-208.)，37℃，1小时；加入100μl/孔1：20000稀释的羊抗兔igg-hrp(sigma)，37℃，1小时；加入opd底物反应液。10分钟后，2m硫酸终止反应。elx800elisa仪测定od值，测定波长490nm，参考波长630nm。计算出药物对hiv-1复制表达p24抗原的抑制率和ec50，即抑制50％hiv-1p24抗原表达的药物浓度。

8、计算公式

根据实验结果绘制剂量反应曲线，按reed&muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(ec50)，50％抑制细胞生长浓度(cc50)及抗hiv-1活性的治疗指数ti值(therapeuticindex)为：ti＝cc50/ec50。

1）、细胞生长存活率(％)＝实验孔od值/对照孔od值×100

2）、hiv-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

3）、hiv-1p24抗原表达的抑制率(％)＝(1-实验孔od值/对照孔od值)×100

9、实验结果和评价

9.1.西曲瑞克对c8166细胞的毒性实验结果

表1列出了西曲瑞克的cc50，本发明的附图3(方块曲线所示)显示了不同浓度的西曲瑞克对细胞c8166的毒性作用。实验结果表明西曲瑞克对细胞的毒性很小，cc50>200μm(cc50越大表示毒性越小)。在浓度等于ec50时，西曲瑞克对细胞c8166完全没有毒性(附图3)。

9.2.西曲瑞克对hiv-1nl4-3病毒株的抗hiv活性实验结果

表1列出了西曲瑞克的ec50，本发明的附图3(圆点曲线所示)显示了不同浓度的西曲瑞克对hiv-1nl4-3病毒株的抑制作用。西曲瑞克对hiv-1诱导c8166细胞形成合胞体的抑制作用的ec50为15.284μm，治疗指数ti大于12.3。在hiv-1p24抗原定量结果显示西曲瑞克抑制p24抗原作用的ec50为1.788μm，治疗指数ti大于105.3。

以上实验结果表明西曲瑞克的细胞毒性较小或无，具有显著的抗hiv活性和较高的治疗指数，可作为制备治疗艾滋病药物的应用。

表1.西曲瑞克对hiv-1nl4-3病毒株的抑制作用及对c8166细胞的毒性作用

实施例2：

化合物西曲瑞克，加入30％的醋酸溶液，ph＝4，过滤，干燥，制成醋酸盐化合物。

实施例3：

化合物西曲瑞克，加入4％的盐酸溶液，ph＝4，过滤，干燥，制成盐酸盐化合物。

实施例4：

化合物西曲瑞克，加入4％的酒石酸溶液，ph＝4，过滤，干燥，制成酒石酸盐化合物。

实施例5：

化合物西曲瑞克，加入4％的柠檬酸溶液，ph＝4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐化合物。

实施例6：

片剂：化合物西曲瑞克，或实施例2-5所得的盐10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例7：

安瓿剂：化合物西曲瑞克，或实施例2-5所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例8：

注射用冻干剂：化合物西曲瑞克，或实施例2-5所得的盐10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性炭吸附30min除热原，过滤除去活性炭，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1n盐酸调节ph为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例9：

胶囊剂：化合物西曲瑞克，或实施例2-5所得的盐10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。