本发明涉及小黑豆乳清多肽粉的制备方法，具体是一种具有抗肿瘤作用的小黑豆乳清多肽粉的制备方法。
背景技术：
小黑豆是大豆的一个品种，特点是乳清蛋白含量高，脂肪含量低，豆皮中富含黑色的花青素。豆制品加工企业生产小黑豆浓缩蛋白和豆制品过程中，会产生大量的黑豆乳清水，其中主要含有乳清蛋白、灰分、低聚糖和青素。以前，小黑豆乳清水一直被当作废水排放，造成了严重的环境污染。随着世界各国对大豆乳清研究的不断深入，如何利用黑豆乳清水中的活性物质成为研究热点之一。研究表明，大豆乳清水中，绝大都是乳清蛋白的分子量在8000道尔顿(DA)，目前已有用小黑豆乳清蛋白制备抗肿瘤乳清多肽的文献报道。如王菲在“酶解小黑豆乳清多肽抗肿瘤作用的研究”(文献1)中，报道木瓜蛋白酶、537酸性蛋白酶、Prote AX蛋白酶三种蛋白酶水解物对癌细胞H22均有抑制作用，其中Prote AX蛋白酶制备的小黑豆乳清多汰浓度为40mg/mL时，抑瘤效果最好，对H22肿瘤细胞的生长抑制率达51.36％，但该文未研究该乳清多肽的抗肠胃道蛋白酶消化的性质。不能确定是否能开发为口服型抗肿瘤多肽产品。
技术实现要素：
针对以上小黑豆抗肿瘤多肽研究中的不足，本发明的目的在于提供一种能抵御肠胃道蛋白酶消化的、具有抗肿瘤作用的小黑豆乳清多肽制备方法。
本发明提供的具有抗肿瘤作用的小黑豆抗肿瘤乳清多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)小黑豆乳清多肽液的制备将经过处理得到的乳清蛋白溶液用6000Da的超滤膜超滤，得到大豆乳清蛋白浓缩液。在此浓缩液中，按照蛋白质量加入5000U/g的3.350酸性蛋白酶；在PH2.5-4.0和40-50℃下水解30min-50min；然后再加入菠萝蛋白酶4000U/g，于PH5.0-6.5和45-55℃的条件下水解10min-20min；将第二次水解液加热到90℃灭酶10min以上，离心取上清液，真空浓缩到粗蛋白含量16-18％，得到有抗肿瘤作用的小黑豆浓缩乳清多肽液。
(2)小黑豆乳清多肽粉的制备按照质量比，在浓缩小黑豆乳清多肽液中加入多肽 液2至3倍的多孔淀粉，搅拌均匀；吸水平衡约50min后，按照质量百分数，在多肽液与多孔淀粉的混合体中加和5-8％海藻酸钠粉，搅拌均匀后，室温下静置1小时，然后在50-60℃干燥到水分10％以下，得到多肽吸附干燥物。
(3)将多肽吸附干燥物粉碎后，先过60目的筛，取筛下物；筛下物再用100目的筛筛分，取筛上物，得到颗粒适宜的小黑豆乳清多肽粉为有抗肿瘤作用的小黑豆乳清多肽粉。
与现有技术相比，本发明的特点为：①小黑豆乳清多肽是经过3.350酸性蛋白酶和菠萝蛋白酶对乳清蛋白的双酶水解，比文献1所报道的单酶水解多肽的体外抑制肿瘤功效明显提高，对肿瘤细胞H22的抑制率提高了14％以上；对肿瘤细胞S180的抑制率提高了28％以上。②该乳清多肽用本发明的方法包埋处理后，可抵御肠胃蛋白酶消化。该多肽比未包埋处理的单酶水解多肽的体内抗肿瘤效果大大提高。可以开发为口服型抗肿瘤多肽产品。
具体实施方式
实施例1
将经过处理得到的小黑豆乳清溶液用6000Da的超滤膜超滤，得到小黑豆乳清蛋白浓缩液。在浓缩液中加入5000U/g的3.350酸性蛋白酶，在PH2.5和42℃下水解50min；然后再加入菠萝蛋白酶4000U/g，于PH5.0和45℃下水解20min；将第二次水解液加热到90℃灭酶10min，离心取上清液，真空浓缩到粗蛋白含量18％，得到小黑豆浓缩乳清多肽液。取以上小黑豆乳清多肽与其他三种单酶水解的小黑豆多肽进行以下体外抗肿瘤试验。
表1 MTT法测定不同酶解小黑豆多肽对H22癌细胞增殖的抑制率％
分别选取对数生长期的H22肿瘤细胞、S180肿瘤细胞，调整细胞密度至5×105/ml，在 96孔培养板中，加入环磷酰和不同浓度的酶得到的乳消多肽，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加10μl四甲基偶氮唑盐溶液(MTT溶液，5mg/ml)，继续孵育4h后每孔加200μl二甲基亚砜(DMSO)溶解MTT沉淀，用振荡器混匀后，在酶标仪上测定光密度值。计算肿瘤细胞生长抑制率。试验表明，本发明中3.350酸性蛋白酶+菠萝蛋白酶酶解小黑豆多肽对H22癌细胞的抑制作用比其他4种单酶水解的小黑豆多肽显著增强。比单酶水解多肽中抑制作用最强的Prote AX酶解多肽提高14％以上；比3.350酸性蛋白酶单酶水解的多肽提高50％以上(见表1)。3.350酸性蛋白酶+菠萝蛋白酶酶解小黑豆多肽对S180癌细胞的抑制作用比其他4种单酶水解的小黑豆多肽显著增强。比单酶水解多肽中抑制作用最强的Prote AX酶解提高28％以上；比3.350酸性蛋白酶单酶水解的多肽提高73％以上(见表2)。
表2 MTT法测定不同酶解多肽对S180肿瘤细胞的抑制率(％)
实施例2
将经过处理得到的小黑豆乳清溶液用6000Da的超滤膜超滤，得到乳清蛋白浓缩液。然后在此浓缩液中，按照蛋白质量加入5000U/g的3.350酸性蛋白酶，在PH3.5和50℃下水解30min；然后再加入菠萝蛋白酶4000U/g，于PH6.0和55℃下水解10min；将第二次水解液加热到90℃灭酶20min，离心取上清液，真空浓缩到粗蛋白含量16％，得到有抗肿瘤作用的小黑豆浓缩乳清多肽液。按质量比在浓缩小黑豆乳清多肽液中加入多肽液2倍的多孔淀粉，搅拌均匀；吸水平衡约50min后，按照质量百分数，在多肽液与多孔淀粉的混合体中加和6％海藻酸钠粉，搅拌均匀后室温下静置1小时，然后在55℃干燥到水分10％以下，得到多肽吸附干燥物。将该干燥物粉碎后，过筛，取60目-100目的筛分粉，得到具有抗肿瘤作用的小黑豆乳清多肽粉。
取测定了多肽含量的本发明双酶酶解多肽干粉，与另外三种为未包埋的多肽干燥品 (已知多肽含量)一道进行肠胃模拟处理。4种样品分别按照混合物中多肽质量为2％取干粉，然后加蒸馏水配成混合物，在按照多肽质量的1％加入胃蛋白酶(1∶3000)；用盐酸调各烧杯中溶液的PH值到2.0，然后在37℃下保温搅拌(30rpm)3小时。反应结束后，再将4个混合液用碳酸氢钠调PH值到8.5，加入多肽质量0.05％的胰蛋白酶(1∶5000)，在37℃下保温搅拌(12rpm)5小时。结束反应后，将各烧杯中的混合液用3000rpm离心10分钟，取相同体积的离心上清液，按照MTT法测量不同上清液对H22肿瘤细胞和S180肿瘤细胞的抑制作用。
试验结果证明，本发明的小黑豆乳清多肽粉，经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，仍然具有较强的抑制肿瘤细胞的作用；而木瓜蛋白酶酶解多肽干燥粉、537酸性蛋白酶酶解多肽干燥粉和ProteAX蛋白酶酶解多肽干燥粉经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，几乎失去了抑制肿瘤细胞的作用。
表3 MTT法测定经胃酶+胰酶处理的多肽对肿瘤细胞的抑制率(％)
实施例3
将经过处理得到的小黑豆乳清溶液用6000Da的超滤膜超滤，得到乳清蛋白浓缩液。在此浓缩液中，按照蛋白质量加入5000U/g的3.350酸性蛋白酶；在PH3.0和45℃下水解40rnin；然后再加入菠萝蛋白酶4000U/g，于PH6.5和50℃下水解15min；将第二次水解液加热到90℃灭酶15min，离心取上清液，真空浓缩到粗蛋白含量18％，得到小黑豆浓缩乳清多肽液。按质量比在浓缩小黑豆乳清多肽液中加入多肽液2.5倍的多孔淀粉，搅拌均匀；吸水平衡约50min后，按照质量百分数，在多肽液与多孔淀粉的混合体中加和8％海藻酸钠粉，搅拌均匀后室温下静置1小时，然后在60℃干燥到水分10％以下，得到多肽吸附干燥物。将该干燥物粉碎后，过筛，取60目-100目的筛分粉，得到具有抗肿瘤作用的小黑豆乳清多肽粉。用该包埋的小黑豆乳清多肽粉进行以下小鼠抗肿瘤试验。
取雄性昆明小鼠建立S180模型动物。随机分为6个组，每组10只小鼠。基础组，肿瘤模型组，环磷酰胺阳性对照组(给药20mg/Kg.d)，两个乳清多肽大剂量组(8g/Kg.d)，和两个乳清多肽小剂量组(3g/Kg.d)。包埋多肽干粉灌胃前用水调成糊状。每日与未包埋的AX蛋白酶酶解多肽分别按剂量灌胃，其余各组灌胃蒸馏水，连续喂养20d，试验结束后禁食12h，测量瘤直径后，处死动物，剥离瘤，称重后计算抑瘤率、瘤重比。试验表明，每日口服本发明的双酶酶解包埋多肽干粉3g和8g/Kg时，对S180肿瘤细胞生长都有显著的抵制作用，抑瘤率分别为47.2％和18.5％(见表4)。比ProteAX蛋白酶酶解多肽相同剂量组显著提高，说明本发明的双酶酶解包埋小黑豆多肽干粉的抗肿瘤效果较好。
表4 不同样品对S180肿瘤的抑制作用(x±SD，n＝10)
注：a和b表示与模型组相比差异显著，P＜0.05和P＜0.01。