本发明涉及药物制剂
技术领域：
，具体涉及一种体内原位载药水凝胶载体及其制备方法和应用。
背景技术：
：利用材料包埋药物延缓药物释放，提高药物疗效及靶向作用已经广泛应用于临床。其中，BMP-2已广泛用于临床上脊柱椎间融合，骨不连，大段骨缺损修复等等，展现了其替代自体骨修复的巨大潜力。但是目前PDA批准的可用于临床的BMP-2产品“BMP-2+ACS”存在溶液状态的BMP-2粘附性差导致周围播散导致异位骨化等并发症，此外为弥补体内快速降解及酶解作用提高BMP-2效应,BMP-2超生理剂量使用(mg/ml)导致成骨质量差、骨囊肿、脂肪形成等副作用，因此亟需开发一种不影响因子活性，又能控制因子缓慢释放的载体。已有较多的细胞因子载体报道，他们往往只能够延长BMP-2释放时间几天，还达不到BMP-2等细胞因子在自然骨折中的病理生理释放时间(3周)；此外有关multi-barriercarrierstructures,e.g.,hierarchicalstructure[25],core-shellstructure[26]andnanoparticleembeddedstructure[27].等探索显示了控制因子释放较长时间，但是要控制因子在负重部位人工骨支架中的三维时空释放还面临挑战。可注射温敏水凝胶(PLGA-PEG-PLGA)逐渐显示了其在药物释放领域中的巨大潜力，该系列水凝胶可于室温环境下与细胞因子均匀混合并可注射体内，而在较高温度(>30℃，包括体温)时包埋细胞因子形成原位载药凝胶。文献(俞麟，Biomaterials，2013，Along-actingformulationofapolypeptidedrugexenatideintreatmentofdiabetesusinganinjectableblockcopolymerhydrogel；Biomater.Sci.,2013，ThethermogellingPLGA–PEG–PLGAblockcopolymerasasustainedreleasematrixofdoxorubicin)已利用该系列水凝胶包埋肿瘤化疗药物、胰岛素等领域应用并取得较好效果。文献(许国华，3DArtificialBonesforBoneRepairPreparedbyComputedTomography-GuidedFusedDepositionModelingforBoneRepair.ACSAppl.Mater.Interfaces，2014；Sol–gelderivedmesoporous58SbioactiveglasscoatingsonAZ31magnesiumalloyandinvitrodegradationbehavior，SurfaceandCoatingsTechnology，2014；中国专利CN102532585B，硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法)公开发表了关于组织工程骨的改进，如临床使用的骨水泥、椎间融合器等仅仅起到机械支撑作用，可能导致融合率差等缺陷。目前，尚未见可用于仿生人工骨髓支架的体内原位载药水凝胶载体的相关文献报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种体内原位载药水凝胶载体及其制备方法和应用。本发明的主要技术方案是：本发明的第一目的在于提供一种体内原位载药水凝胶载体PLGA–PEG–PLGA，所述水凝胶载体由丙交酯LA、聚乙二醇PEG和乙交酯GA聚合而成；其中，PLGA与PEG的数均分子量之比为1.5-3：1，LA与GA的摩尔比为3-5:1。进一步的，所述水凝胶载体中PLGA与PEG的数均分子量之比为2：1，LA与GA的摩尔比为4:1，所述水凝胶载体的数均分子量Mn为5956，重均分子量Mw为8732，分子量分布系数D为1.26；相变温度约27-30℃；核磁计算得到的实际数均分子量为1744-1500-1744。本发明的第二目的在于提供一种体内原位载药水凝胶载体PLGA–PEG–PLGA的制备方法，包括：a.以双端羟基的PEG为引发剂，油浴加热至100-150℃，减压除水3-6小时，然后加入丙交酯单体LA和单体乙交酯GA，真空环境加热待其完全融化后加入辛酸亚锡无水甲苯溶液催化，减压除甲苯1小时，油浴升温至150℃后在氩气下继续反应6小时；其中，所述PLGA与PEG按数均分子量1.5-3：1比例投料；LA与GA的摩尔比为3-5:1；b.反应完毕后，降温至90-120℃，减压除未反应单体及低沸点产物，将初始产物溶于10-15℃的冷水中，待其完全溶解后，加热溶液至90-120℃，发生产物沉淀，移除上层溶液，重复提纯产物，最后通过冷冻干燥除去水分并保存于-20℃真空。进一步的，所述步骤a中，PLGA与PEG按数均分子量2：1比例投料；LA与GA的摩尔比为4:1。进一步的，所述步骤a中，油浴加热至120℃，减压除水4小时。进一步的，所述步骤b中，反应完毕后，降温至100℃，减压除未反应单体及低沸点产物，将初始产物溶于10-15℃的冷水中，待其完全溶解后，加热溶液至100℃。本发明的第三目的在于提供上述体内原位载药水凝胶载体PLGA–PEG–PLGA在制备仿生人工骨髓支架中的应用。进一步的，所述应用包括：在所述水凝胶载体PLGA–PEG–PLGA中包埋促骨生长因子制成仿生人工骨髓支架。进一步的，所述促骨生长因子选自rhBMP-2、rhVEGF-165中的一种或两种的混合。对于不同链长的样品，即使在亲疏水比接近的条件下，其溶解性差别也很大而且有独特的分子量依赖性，只有分子量适中的嵌段共聚物才能溶于水中，分子量太小或分子量太大的样品都不溶解。本发明通过调节PLGA–PEG–PLGA聚合物中亲疏水嵌段比例，实现了聚合物/水体系在超过凝胶浓度以后具有室温下为溶液、体温下为凝胶的热致sol-gel转变特征。其中，PLGA–PEG–PLGA在20℃需要1h搅拌可得到均一透明的溶液，其25wt％溶液在较低温度(小于27℃)时为流动的溶胶，接近体温附近(大于30℃)时发生凝胶化，温度达到42℃时沉淀析出。本发明的体内原位载药水凝胶载体通过包埋促骨生长因子，可模拟自然骨髓充填于多孔人工骨支架中，模拟骨折修复过程中重要讯息因子的释放，在改善脊柱融合、骨不连、骨缺损修复等领域具有极好的应用。附图说明图1为实施例1制备的PLGA-PEG-PLGA水凝胶载体的1HNMR谱图；图2为实施例1制备的PLGA-PEG-PLGA的GPC轨迹图；图3为25wt％PLGA-PEG-PLGA水溶液随温度变化的流变图；图4为PLGA-PEG-PLGA水凝胶载体相变大体观；其中，sol溶胶中箭头示液平，gel凝胶中箭头示液平凝固；图5为21天内三组凝胶载体rhVEGF165浓度释放图(Elisa检测)；图6为21天内三组凝胶载体rhBMP-2浓度释放图(Elisa检测)；图7为四组凝胶缓释系统对成骨细胞成骨基因表达的影响，*代表显著性差异，P<0.05有统计学意义；其中，a为ALP、b为COL-I、c为RUNX-2、d为OPN；图8为四组凝胶缓释系统中贴壁成骨细胞14天钙结节染色；其中，a表示N组，b表示V组，c表示B组，d表示VB组；图9为可注射PLGA-PEG-PLGA水凝胶载体注射小鼠皮下降解情况；其中，a表示注射后即刻，b表示注射后第1天，c表示原位凝胶取出后，d表示注射后3天，e表示注射后7天；图10为水凝胶载体注射小鼠皮下14天降解情况；其中，a表示N组残留凝胶，b表示V组残留凝胶伴毛细血管分布，c表示B组骨性结构伴血管分布，d表示VB组骨性结构伴血管分布，d骨性结构较c组少；图11为水凝胶载体注射小鼠皮下21天时情况；其中，a表示N组残留凝胶，b表示V组残留凝胶伴毛细血管分布，c表示B组骨性结构伴血管分布，d表示VB组骨性结构伴血管分布，c组与d组骨样结构大小无明显差异；图12为水凝胶载体注射小鼠皮下28天时情况；其中，a表示N组残留凝胶，b表示V组残留凝胶伴毛细血管分布，c表示B组骨性结构伴血管分布，d表示VB组骨性结构伴血管分布，c组与d组骨样结构大小无明显差异；图13为甲苯胺蓝染色，图中箭头示成骨细胞和类骨质结构。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1体内原位载药水凝胶载体PLGA–PEG–PLGA的制备以下原料：聚乙二醇PEG(1500)(Aldrich-SigmaCo.)、丙交酯DL-lactide(LA)(Purac)、乙交酯glycolide(GA)(Purac)、辛酸亚锡(99％，Aldrich-SigmaCo.)，以及无水甲苯及二氯甲烷均通过市售获得。在250毫升的烧瓶中加入20g双端羟基的PEG(1500)，油浴加热至120℃，减压除水4小时，然后加入单体丙交酯(LA)48.8g和乙交酯12.2g(GA)摩尔比为4:1，真空环境加热待其完全融化后加入150微升辛酸亚锡无水甲苯溶液催化，减压除甲苯1小时，油浴升温至150℃后在氩气下继续反应6小时。反应完毕后降温到100℃，减压除未反应单体及低沸点产物。将初始产物溶于(10-15℃)冷水中，待其完全溶解后，加热溶液至100℃，发生产物沉淀，移除上层溶液，重复提纯产物，最后通过冷冻干燥除去水分并保存于-20℃真空。实施例2水凝胶载体数均分子量、分子量分布、变相温度测定1、将实施例1制备的的PLGA-PEG-PLGA水凝胶载体根据核磁计算得到的实际数均分子量为1744-1500-1744，LA:GA＝4:1，如图1所示。2、通过GPC分析计算实施例1的PLGA-PEG-PLGA为均一物质，其数均分子量Mn:5956，重均分子量Mw:8732，分子量分布系数D:1.26，如图2所示。3、用生理盐水配置PLGA-PEG-PLGA的25wt％的溶液，其流变图如图3所示，可见当以0.5℃/min升温速率到达27-30℃左右时，该水凝胶开始变相，超过30℃基本由流动的溶胶状态变为固态的凝胶状态(如图4)。实施例3载rhBMP2/rhVEGF165凝胶PLGA–PEG–PLGA的制备将实施例1制备的载药水凝胶载体PLGA-PEG-PLGA溶解于生理盐水中，制备成25wt％的水凝胶溶液40ml，该水凝胶溶液经过7kGy辐照消毒(第二军医大学辐照中心)后置于4℃冰箱静置24h待其成均匀溶液状态，在室温(低于25℃)环境下于无菌超净台中利用5ml无菌注射器抽取14ml水凝胶溶液注入含有500ug的rhVEGF165试剂瓶中，将混有水凝胶和rhVEGF的试剂瓶置于混匀器中混匀5min，配制得含VEGF浓度为36ug/ml的混合物V溶液；将14ml水凝胶溶液注入含有5mg的rhBMP-2试剂瓶中配制含rhBMP-2浓度为360ug/ml的混合物B溶液；取一无菌离心管(15ml)于超净台无菌操作，注射器抽取5mlV溶液和5mlB溶液，置于混匀器中混匀5min，配制得含VEGF18ug/ml和rhBMP-2180ug/ml的混合物VB；将配置的三种凝胶溶液及不含因子的空白凝胶N溶液置于4℃冰箱待用。实施例4载rhBMP2/rhVEGF165凝胶于体外模拟体液中释放情况如图5中可见三组凝胶模拟体液中细胞因子浓度总体较平稳，其中V组和VB于第3天模拟体液中细胞因子浓度相对增高，提示此时存在药物突释效应。图6中可见三组凝胶模拟体液中细胞因子浓度总体较平稳，其中B组和VB组于第3天模拟体液中细胞因子浓度相对增高，提示此时存在药物突释效应。实施例5体外对成骨细胞的影响为比较该载药凝胶及其缓释药物对成骨细胞可能的影响，分别设置空白凝胶组(N组)、载rhVEGF165凝胶组(V组)、载rhBMP-2凝胶组和载rhBMP-2(VB组)、rhBMP-2凝胶组(B组)四组培养小鼠MC3T3成骨细胞。如图7所示，结果表明：显示随着时间增长，各组细胞的成骨表达标记物(ALP、COL-I、RUNX-2、OPN)均呈一致性显著增长；而且VB组四种标记物表达最高，B组次之，V组再次之，空白组表达最少。利用独立样本t-test进行组间比较，各组间存在显著差异(置信区间为95％)。如图8所示，于体外培养成骨细胞致第14天时，显微镜下观察贴壁成骨细胞分化后钙结节的染色情况显示，VB组钙结节染色最多，B组次之、V组、N组表达最少(图8中，从左往右依次是N、V、B、VB组)。实施例6体内降解及异位骨化结果如图9所示，于小鼠背部皮下注射水凝胶溶胶可原位形成固态凝胶，且注射后前7天四组凝胶形态逐渐变小，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉柔软、部分糊状散开，无明显血管化和骨化形成。如图10所示，于凝胶注射后14天时，其中载BMP-2凝胶(B组)凝胶大小未见变小和不均匀，反而变大而光整，表面可见血管分布，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉柔韧、无凝胶糊状散开，用眼科剪从中间慢慢剪开，有水样液体流出；载VEGF和BMP-2凝胶(VB组)凝胶形态未见明显变小，但扁平不均匀，表面可见血管分布，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉柔韧、无明显凝胶糊状散开，无水样液体流出。空白凝胶(N组)与载VEGF凝胶(V组)的凝胶形态逐渐变小并且不均匀，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉柔软、部分糊状散开，两组无明显骨样结构生成，V组凝胶表面有部分血管分布。如图11所示，于凝胶注射后21天时，载BMP-2凝胶(B组)大小较术后7天、14天时未见变小和不均匀，类似术后14天时大而光整的椭圆形，椭圆结构表面可见布满血管，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉质地较硬、无凝胶散开，用眼科剪从中间慢慢剪开，无明显水样液体流出，囊壁变厚中间可见被包裹的凝胶；而载VEGF和BMP-2凝胶(VB组)凝胶形态较术后14天时明显变厚实，成骨结构外形似于载BMP-2凝胶(B组)，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉质地较硬、无凝胶散开，无水样液体流出，中间可见被包裹的凝胶和骨样结构。空白凝胶(N组)与载VEGF凝胶(V组)的凝胶形态继续逐渐变小并且不均匀，用小镊子轻轻夹持凝胶感觉柔软、不易散开，两组凝胶处未见明显骨化改变，V组凝胶表面有少量血管分布。如图12所示，于凝胶注射后28天时，B组和VB组皮下骨化结构与21天时未见明显差异；N组与V组凝胶形态继续变小并且不均匀，其中V组凝胶表面有少量血管分布与21天时未见明显骨化差异。如图13所示，分别取B组和BV组中术后皮下14天、21天、28天时的骨样结构行甲苯胺蓝染色(x100)，可见2组于个时间点组织学检查均可见成骨细胞和类骨质样结构，且随着时间增长而增长。其中，B组于14天时类骨质面积明显多于VB组，但在术后21天及28天时VB组类骨质面积并不少于B组。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。当前第1页1 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