一种罗米地辛组合物及其在制备治疗肝癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种罗米地辛组合物及其在制备治疗肝癌药物中的应用。

(二)

背景技术：

肝癌是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一，已成为我国第二位的癌症杀手。由于多数肝癌病人诊断时已是晚期，以手术切除为主的综合治疗效果差，导致化疗是其治疗的主要手段之一。但是，肝癌缺少特效的化疗药，原因之一是药物作用于肝癌细胞的机制不明确。因此，研究开发针对肝癌的抗肿瘤药物是关键，阐明药物作用的机制。

Romidepsin是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)，Romidepsin是一种HDACi，于2009年11月被FDA批准上市，用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，随后于2011年FDA增加Romidepsin的适应证，批准其用于治疗多形T细胞淋巴瘤。Romidepsin应用于实体瘤后，容易产生耐药性，可能的机制是诱导了癌细胞的自噬。Chloroquine Phosphate即磷酸氯喹，是我国的一种传统中药氯喹的主要成分，原本是用来治疗疟疾，后研究发现它可以通过抑制细胞的自噬体与溶酶体融合，达到抑制自噬的目的。目前将Romidepsin和Chloroquine Phosphate配伍应用，治疗肝癌未见研究报道。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物及其制备防治肝癌药物中的应用，较大地提高了Romidepsin对肿瘤细胞活性抑制作用，具有较好疗效且毒副作用较少，为新药筛选提供了基础。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种罗米地辛组合物，所述罗米地辛组合物由罗米地辛(Romidepsin)和磷酸氯喹(Chloroquine Phosphate)以质量比1:25～200混合而成，更优选罗米地辛和磷酸氯喹以质量比1:100混合而成。

本发明还提供一种所述罗米地辛组合物在制备治疗肝癌药物中的应用，优选所述药物为抑制Huh7肝癌细胞活性的药物。

目前肝癌缺少特效的化疗药，研究开发针对肝癌的抗肿瘤药物有很重要的意义。

我们选取Huh7肝癌细胞株建立裸鼠皮下成瘤模型，对Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物，经药效学整体动物实验研究，取得了肯定的治疗效果，较单独的Romidepsin或者Chloroquine Phosphate疗效更好。Romidepsin和Chloroquine Phosphate按1:100质量配比，对瘤体生长的抑制作用最明显。

同时我们一般采用cleaved-caspase-3(c-caspase-3)和Ki-67来评价药物对肿瘤的治疗作用。c-caspase-3是检测细胞凋亡的经典蛋白，Ki-67是检测细胞增殖的经典蛋白，如果药物的治疗肿瘤作用越好，c-caspase-3表达越高，而Ki-67表达越低。所以，我们通过免疫组化检测瘤体的凋亡指标(c-caspase-3)和增殖指标(Ki67)的变化，确定Romidepsin和Chloroquine Phosphate的治疗效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种罗米地辛组合物及其在制备治疗肝癌药物中的应用，本发明所述罗米地辛组合物对Huh7肝癌细胞具有较强的抑制作用，而单独罗米地辛治疗效果不佳，单独Chloroquine Phosphate对肝癌基本无治疗作用。我们发现罗米地辛组合物(1:100)比罗米地辛单药治疗肝癌效果提高约2.2倍左右，比Chloroquine Phosphate单药治疗肝癌效果提高约2.7倍左右，说明罗米地辛和磷酸氯喹有协调作用，为新药筛选提供了基础。

(四)附图说明

图1：Romidepsin：Chloroquine Phosphate(RO:CQ)质量配比1:100作用于裸鼠肝癌模型21天后瘤体大小图片。

图2：Romidepsin：Chloroquine Phosphate质量配比1:100作用于裸鼠肝癌模型后，c-caspase-3和Ki-67蛋白变化显微图片。

图3：Romidepsin：Chloroquine Phosphate质量配比1:100作用于裸鼠肝癌模型后，心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏组织切片的HE染色图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1 Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物配比药效学实验

1.实验药品：Romidepsin(FK228,Depsipeptide，产品目录号S3020)和Chloroquine Phosphate(产品目录号S4157)，购于selleck中国公司。

2.实验主要肝癌细胞系和裸鼠

肝癌Huh7细胞裸鼠，BALB/C裸鼠(雄性，6-7周龄，体重18-20g)购买于浙江省医学科学院动物实验中心，饲养于卫生部多器官联合移植重点实验室SPF级动物房。每只裸鼠种2.5×10⁶Huh7细胞于皮下。

3.主要试剂的配置

(1)PBS(磷酸盐缓冲液)：标准配置磷酸盐20g溶解于ddH₂O 2000ml，调pH7.4。

(2)5×电泳缓冲液(1L)：94g甘氨酸，15.1g Tris碱，50ml 10％SDS水溶液，加ddH₂O溶解，调pH8.3定容至1L，临用前蒸馏水稀释5倍。

(3)转膜缓冲液(1L)：5.8g Tris碱，2.9g甘氨酸，200ml甲醇，0.37g SDS，加ddH₂O溶解，调pH8.3定容至1L，4℃保存。

(4)TBS-T：4.4g Nacl，0.5ml Tween-20，10ml 1.5M Tris-Hcl(pH8.0)，加ddH₂O溶解，调pH7.5定容至500ml，4℃保存。

(5)10％分离胶：水1.9ml，30％丙烯酰胺水溶液1.7ml，10％SDS水溶液0.05ml，1.5M Tris(pH8.8)1.3ml，10％过硫酸胺水溶液0.05ml，TEMED 0.002ml，总体积5ml。

(6)5％浓缩胶：水2.1ml，1.0M Tris(pH6.8)0.38ml，30％丙烯酰胺水溶液0.5ml，10％SDS水溶液0.03ml，TEMED 0.003ml，10％过硫酸胺水溶液0.03ml，总体积3ml。

(7)MTT：0.5g的MTT溶解于100ml的PBS中，水浴溶解后用0.22μm过滤器过滤除菌，分装后4℃避光保存。

(8)RPMI1640完全培养液：RPMI1640培养液44.5ml，青链霉素500μl，胎牛血清FBS 5ml，总体积50ml。

(9)DMEM/F12完全培养液：DMEM/F12培养液44.5ml，青链霉素500μl，胎牛血清FBS 5ml，总体积50ml。

(10)DMEM完全培养液：DMEM培养液44.5ml，青链霉素500ul，胎牛血清FBS 5ml，总体积50ml。

(11)PFA(多聚甲醛)：45ml的超纯水加热至60℃，加入2.0g多聚甲醛固体粉末，滴加10μl的NaOH，加入PBS定容至50ml，调pH至7.2，避光保存。

4.主要实验仪器及设备

超净工作台 苏净集团有限公司

电泳仪、电泳槽及转膜仪 美国Bio-Rad

超速离心机L-80XP 美国Beckman公司

371型CO₂培养箱 美国Thermo公司

1169型生物安全柜 美国Thermo公司

722N可见分光光度计 上海第二分析仪器厂

光学双目倒置显微镜 日本Nikon公司

台式低温离心机 德国heraeus公司

MDF-328E型超低温冰箱 日本SANYO公司

全自动生化分析系统 美国Beckman公司

KDC-2046低速冷冻离心机 科大创新股份有限公司

紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司

FA2104型电子分析天平 上海仪器设备厂

SSW型电热恒温水浴箱 上海博讯实业有限公司

EXL-808酶标仪 美国Biotek公司

电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂

电热恒温水浴箱 上海跃进医疗器械厂

HIRAYAMA高压灭菌器 日本HIRAYAMA公司

便携式酸度计(MP120) 瑞士梅特勒-托利多

5.具体方法和结果

(1)动物模型建立

选取Huh7肝癌细胞株建立裸鼠皮下成瘤模型，共90只，具体操作为：BALB/C裸鼠(雄性，6-7周龄，体重18-20g)，购买于浙江省医学科学院动物实验中心，饲养于卫生部多器官联合移植重点实验室SPF级动物房。Huh7肝癌细胞浓度为2×10⁷/mL，然后以2×10⁶细胞/只(100μL重悬于PBS中)接种于BALB/C裸鼠单侧腋窝皮下。

(2)药物配比及实验动物分组

1)药物配比

Romidepsin，Selleck公司，纯度99.84％，用二甲基亚砜1ml溶解，浓度为10mg/ml，生理盐水稀释，制成1mg/ml Romidepsin溶液，避光4℃保存。

Chloroquine Phosphate，Selleck公司，纯度99.65％，用生理盐水溶解，制成100mg/ml，Chloroquine Phosphate溶液，避光4℃保存。

按照Romidepsin和Chloroquine Phosphate质量比为1:50(根据裸鼠体重Romidepsin为1mg/kg和Chloroquine Phosphate为50mg/kg，以下类推)、1:100、1:150、1:200、2:50和2:100，将上述Romidepsin溶液和Chloroquine Phosphate溶液分别配制成1:50组，1:100组，1:150组，1:200组，2:50组，2:100组的组合物溶液。

2)实验分组

a.空白组、单独Romidepsin(说明书的建议剂量为1mg/kg)组(即RQ组)和单独Chloroquine Phosphate(说明书的建议剂量为100mg/kg)组(即CQ组)，Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物1:50组，1:100组，1:150组，1:200组，2:50组，2:100组。

(3)给药方法

待裸鼠移植瘤模型的腋窝触摸有包块产生(直径约0.2-0.3cm)，开始腹腔给药，药物溶于PBS中，每次给药的总体积为200μL，1周3次。

(4)标本采取

给药开始后的第20天，断颈处死老鼠，观察肿瘤大小，取出肿瘤组织称重，取出裸鼠肺部，肝，肾，心，脾，放入福尔马林固定。

(5)指标测定

1)裸鼠体重和瘤体肿瘤体积

每隔一天给裸鼠称重。每隔两天测量肿瘤的的纵横径长，用公式V(cm³)＝width²(cm²)×length(cm)/2计算每天每组细胞形成肿瘤大小。1周2次。结果见图1，表1、表2和表3。

2)c-caspase-3和Ki-67检测

以免疫组化染色Picture SP两步法，严格按照试剂盒说明书进行操作。取下瘤体，10％福尔马林溶液固定组织标本，自动脱水机脱水后，石蜡包埋保存；石蜡包块置于-20℃冰箱中过夜后切片，将切片置于37℃水浴箱，用多聚赖氨酸包被的载玻片捞片；60℃烤箱中烘干90分钟后室温保存(不应超过1周)；用前在60℃恒温箱中烘烤30分钟后进行脱蜡处理；脱蜡后组织切片置于枸橼酸溶液中进行抗原修复，微波加热后自然冷却至室温；3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟，PBS漂洗切片3次，每次5分钟。滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；滴加50μL一抗(c-capase-3或者Ki-67)工作液至组织切片，然后将组织切片置于保湿盒中4℃过夜孵育；过夜后，室温复温并用PBS漂洗切片3次；滴加50μL鼠兔通用二抗到切片上，置入保湿盒中室温孵育60分钟后PBS漂洗3次；现配DAB染液，在显微镜下观察显色，待染色合适时停止显色反应，之后用自来水冲洗组织切片20分钟去除DAB。结果见图2和图3。

结果判定方法：细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无着色为阴性细胞。根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定实验结果：A：按显色细胞数记分，阳性细胞数<1/3为1分，阳性细胞数1/3～2/3为2分，阳性细胞数≥2/3为3分。B：按细胞显色深浅记分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。积分数＝A×B。A×B＝0判断为(－)，A×B＝1～2判断为(+)，A×B＝3～4判断为(++)，A×B＝6～9判断为(+++)。

(6)统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料均值比较用方差分析，如有统计学意义，再行组内两两Bonferroni检验。

(7)实验结果

以下各组比均为Romidepsin：Chloroquine Phosphate(RO：CQ)。

表1:Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物对瘤体重量的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01

表2:Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物对瘤体体积的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05，

表3:Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物对裸鼠体重的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05

表4:Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物对c-capase-3的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01；说明：c-capase-3阳性率越高，说明细胞凋亡越多，治疗效果越好

表5:Romidepsin和Chloroquine Phosphate组合物对Ki-67的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01；说明：Ki-67阳性率越高，说

明细胞增殖越多，治疗效果越差。

(8)结论

实验发现，Chloroquine Phosphate和Romidepsin组合物可以明显的抑制裸鼠肝癌细胞的生长，最佳质量配比1:100组的效果比单独Romidepsin提高约2.2倍，比Chloroquine Phosphate单药治疗肝癌效果强提高约2.7倍左右。同时，用免疫组化的结果证实，配比1:100组c-caspase-3蛋白表达最高，Ki-67表达最低。