多能性干细胞迁移促进剂的制作方法

本发明涉及痘苗病毒接种炎症组织提取物(以下，有时记作“本发明提取物”。)的新的医药用途等。更具体而言，涉及含有本发明提取物的多能性干细胞迁移促进剂等。

背景技术：

干细胞(stemcell)是具有自我增殖能力和多向分化能力的细胞，常见的有胚胎干细胞(embryonicstemcell；es细胞)和人工多能性干细胞(inducedpluripotentstemcell；ips细胞)。但是，由于es细胞是将受精卵破坏取出的，所以存在伦理上的问题。另外，由于受精卵不是患者本人的细胞，所以存在排斥反应的问题。另一方面，为了构建ips细胞，需要在体细胞中导入特定的基因、特定的化合物这样的复杂的操作，而且由于人工的初始化因子的导入引起的基因损伤或未分化细胞的残存所引起的肿瘤化会成为问题。

然而，在生物体内原本存在着被称为间充质干细胞的干细胞，已知具有分化成骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨格肌肉等的能力。利用该分化能力，进行着用于治疗骨关节疾病、脊椎损伤、帕金森病、糖尿病等的研究。已知间充质干细胞能够从骨髓、脂肪组织、胎盘组织、脐带组织、牙髓等的组织获得，但由于是包含各种细胞的细胞群，所以其治疗效果上偏差大被视作问题。

根据本发明的发明人的研究，发现了存在于间充质系细胞组分、不需要基因导入等复杂的诱导操作而可以得到的、表达ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3，阶段特异性胚胎抗原-3)作为表面抗原的多能性干细胞(multilineage-differentiatingstressenduringcell，多系分化持续应激细胞；muse细胞)。发现了muse细胞存在于生物体内的皮肤、骨髓、脂肪等间充质组织中，在脊髄损伤、肝脏损伤、腓肠肌损伤等各种各样的模型小鼠(不排斥人细胞的免疫缺陷小鼠)中，所移植的muse细胞聚集在损伤部位，分化成损伤组织的细胞(国际公开wo2011/007900)。另外，由本发明的发明人发现了：在兔心肌梗塞模型中，所移植的muse细胞聚集在梗塞部位，使梗塞尺寸缩小(国际公开wo2014/027474)；鞘氨醇-1-磷酸(s1p)等增强muse细胞的迁移能力，诱导存在于间充质系组织的muse细胞向损伤部位的迁移(国际公开wo2014/133170)。

关于本发明的多能性干细胞迁移促进剂所含有的痘苗病毒接种炎症组织提取物(本发明提取物)或含有该提取物的制剂，已知镇痛作用、镇静作用、抗应激作用、抗过敏作用(参照专利文献1)、免疫促进作用、抗癌作用、肝硬化抑制作用(参照专利文献2)、对特发性血小板减少性紫癜的治疗效果(参照专利文献3)、对带状疱疹后遗神经痛、脑水肿、痴呆、脊髄小脑变性症等的治疗效果(参照专利文献4)、对雷诺氏综合征、糖尿病性神经障碍、亚急性视神经脊髓病(smon)后遗症等的治疗效果(参照专利文献5)、激肽释放酶产生抑制作用、末梢循环障碍改善作用(参照专利文献6)、骨萎缩改善作用(参照专利文献7)、对败血症、内毒素休克的治疗有效的一氧化氮产生抑制作用(参照专利文献8)、对骨质疏松症的治疗效果(参照专利文献9)、基于nef作用抑制作用、趋化因子产生抑制作用的艾滋病治疗效果(参照专利文献10、11)、对脑梗塞等的缺血性疾病的治疗效果(参照专利文献12)、对纤维肌痛症的治疗效果(参照专利文献13)、对感染症的治疗效果(参照专利文献14)、对由抗癌剂引起的末梢神经障碍的预防或轻减作用(参照专利文献15)、慢性前列腺炎、间质性膀胱炎和/或排尿障碍的治疗效果(参照专利文献16)、bdnf等的神经营养因子的产生促进作用(参照专利文献17)、软骨细胞中的胶原和蛋白多糖合成促进作用(参照专利文献18)等非常多样的作用、效果。然而，本发明提取物或含有该提取物的制剂具有多能性干细胞的迁移促进作用是目前未知的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭53－101515号公报

专利文献2：日本特开昭55－87724号公报

专利文献3：日本特开平1－265028号公报

专利文献4：日本特开平1－319422号公报

专利文献5：日本特开平2－28119号公报

专利文献6：日本特开平7－97336号公报

专利文献7：日本特开平8－291077号公报

专利文献8：日本特开平10－194978号公报

专利文献9：日本特开平11－80005号公报

专利文献10：日本特开平11－139977号公报

专利文献11：日本特开2000－336034号公报

专利文献12：日本特开2000－16942号公报

专利文献13：国际公开wo2004/039383号公报

专利文献14：日本特开2004－300146号公报

专利文献15：国际公开wo2009/028605号公报

专利文献16：国际公开wo2011/111770号公报

专利文献17：国际公开wo2011/162317号公报

专利文献18：国际公开wo2012/051173号公报

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明提供含有本发明提取物的多能性干细胞迁移促进剂等。

用于解决课题的方法

本发明的发明人对于谋求有效的治疗方法的损伤的药剂治疗进行了深入研究，其结果发现本发明提取物具有优异的多能性干细胞的迁移促进作用，从而完成了本发明。

发明的效果

本发明提取物具有促进多能性干细胞的迁移这样的优异的药理作用。另外，含有该提取物的制剂为副作用等问题少的安全性高的药剂，因此本发明是有用性极高的发明。

在本发明中，损伤是指生物体由于内在和/或外在因素而受到全身性或局部性的某种障碍。因此，本发明中的损伤除了各种外伤以外，还包括梗塞、退行性病变、组织破坏等各种状态。另外，损伤部位也可以列举全身的各种组织，例如、脑、神经、肾脏、胰脏、肝脏、心脏、皮肤、骨、软骨等各个部位，但不限定于这些。作为引起损伤的因素，例如，可以列举物理的外力(事故、火伤、被辐射等)、心肌梗塞等缺血性心疾病、各种炎症、糖尿病、各种感染症、自免疫疾病、肿瘤、在毒物中的暴露、神经变性疾病等，但不限定于这些。

附图说明

图1是通过了pet膜的muse细胞的染色图像。

图2是研究本发明提取物的muse细胞迁移活性的试验结果。

具体实施方式

本发明是基于使用从源自人脂肪细胞的间充质干细胞分离的muse细胞来研究本发明提取物对于该细胞的迁移的作用的结果而得到的发明。作为本发明的优选实施方式可以列举以下方式，但并不限定于这些。此外，在本申请中，“含有痘苗病毒接种炎症组织提取物的多能性干细胞迁移促进剂”的发明包括：痘苗病毒接种炎症组织提取物本身为多能性干细胞迁移促进剂的发明，以及含有痘苗病毒接种炎症组织提取物的制剂为多能性干细胞迁移促进剂的发明。

(1)含有痘苗病毒接种炎症组织提取物的多能性干细胞迁移促进剂。

(2)如上述(1)所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，多能性干细胞的迁移促进为向生物体的损伤部位的诱导。

(3)如上述(1)或(2)所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，多能性干细胞为ssea-3阳性细胞。

(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，多能性干细胞为muse细胞。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，炎症组织为皮肤组织。

(6)如上述(1)～(4)中任一项所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，炎症组织为兔的皮肤组织。

(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的多能性干细胞迁移促进剂，其为注射剂。

(8)如上述(1)～(6)中任一项所述的多能性干细胞迁移促进剂，其为口服剂。

(9)如上述(8)所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，口服剂为固形剂。

(10)如上述(9)所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，固形剂为片剂。

(11)如上述(8)所述的多能性干细胞迁移促进剂，其中，口服剂为液剂。

(12)如上述(1)～(6)中任一项所述的多能性干细胞迁移促进剂，其通过导管给药。

(13)痘苗病毒接种炎症组织提取物在多能性干细胞的迁移促进剂的制造中的使用。

(14)如上述(13)所述的使用，其中，多能性干细胞的迁移促进为向生物体的损伤部位的诱导。

(15)如上述(13)或(14)所述的使用，其中，多能性干细胞为ssea-3阳性细胞。

(16)如上述(13)～(15)中任一项所述的使用，其中，多能性干细胞为muse细胞。

(17)如上述(13)～(16)中任一项所述的使用，其中，炎症组织为皮肤组织。

(18)如上述(13)～(16)中任一项所述的使用，其中，炎症组织为兔的皮肤组织。

(19)如上述(13)～(18)中任一项所述的使用，其中，多能性干细胞的迁移促进剂为注射剂。

(20)如上述(13)～(18)中任一项所述的使用，其中，多能性干细胞的迁移促进剂为口服剂。

(21)如上述(20)所述的使用，其中，口服剂为固形剂。

(22)如上述(21)所述的使用，其中，固形剂为片剂。

(23)如上述(20)所述的使用，其中，口服剂为液剂。

(24)如上述(13)～(18)中任一项所述的使用，其中，多能性干细胞的迁移促进剂通过导管给药。

(25)痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂的判定或评价方法，其以多能性干细胞的迁移促进作用为指标。

(26)如上述(25)所述的判定或评价方法，其中，多能性干细胞为培养细胞。

(27)如上述(25)或(26)所述的判定或评价方法，其中，多能性干细胞为ssea-3阳性细胞。

(28)如上述(25)～(27)中任一项所述的判定或评价方法，其中，多能性干细胞为muse细胞。

(29)如上述(25)～(28)中任一项所述的判定或评价方法，其中，炎症组织为皮肤组织。

(30)如上述(25)～(28)中任一项所述的判定或评价方法，其中，炎症组织为兔的皮肤组织。

(31)通过上述(25)～(30)中任一项所述的判定或评价方法保证了品质规格的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂。

(32)通过进行上述(25)～(30)中任一项所述的判定或评价，保证痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂的品质规格的方法。

(33)用于预防、治疗损伤或抑制恶化的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂。

(34)如上述(33)所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，损伤的预防、治疗或恶化抑制是通过多能性干细胞向损伤部位的迁移实现的。

(35)如上述(34)所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，多能性干细胞为ssea-3阳性细胞。

(36)如上述(34)或(35)所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，多能性干细胞为muse细胞。

(37)如上述(33)～(36)中任一项所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，炎症组织为皮肤组织。

(38)如上述(33)～(36)中任一项所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，炎症组织为兔的皮肤组织。

(39)如上述(33)～(38)中任一项所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，给药是通过注射进行的。

(40)如上述(33)～(38)中任一项所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，给药是通过口服进行的。

(41)如上述(33)～(38)中任一项所述的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂，其中，给药是通过导管进行的。

(42)一种损伤的预防、治疗或恶化抑制方法，其包括对需要治疗的患者，施用有效量的痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有该提取物的制剂的步骤。

(43)如上述(42)所述的方法，其中，损伤的预防、治疗或恶化抑制是通过多能性干细胞向生物体的损伤部位的迁移实现的。

(44)如上述(43)所述的方法，其中，多能性干细胞为ssea-3阳性细胞。

(45)如上述(43)或(44)所述的方法，其中，多能性干细胞为muse细胞。

(46)如上述(42)～(45)中任一项所述的方法，其中，炎症组织为皮肤组织。

(47)如上述(42)～(45)中任一项所述的方法，其中，炎症组织为兔的皮肤组织。

(48)如上述(42)～(47)中任一项所述的方法，其中，给药是通过注射进行的。

(49)如上述(42)～(47)中任一项所述的方法，其中，给药是通过口服进行的。

(50)如上述(42)～(47)中任一项所述的方法，其中，给药是通过导管进行的。

本发明提取物是含有从接种痘苗病毒并发痘的动物的发炎组织提取和分离的非蛋白质性的活性物质的提取物。本发明提取物在提取状态下是液体，但也能够通过干燥制成固体。含有本发明提取物的制剂(以下，也称为“本发明制剂”。)作为医药品是非常有用的。作为本发明制剂，在申请人在日本制造并销售的具体的商品中，有“含有接种痘苗病毒的家兔的炎症皮肤的提取液的制剂”(商品名：神经妥乐平/neurotropin〔注册商标〕)(以下称为“神经妥乐平”。)。神经妥乐平中有注射剂和片剂，都为医疗用医药品(ethicaldrug)。

神经妥乐平的注射剂的适应症为“腰痛症、颈肩综合症、症状性神经痛、伴随皮肤疾病(湿疹、皮炎、荨麻疹)的瘙痒、过敏性鼻炎、亚急性脊髓视神经病(smon)后遗症状的寒冷感、感觉异常、疼痛”。神经妥乐平的片剂的适应症为“带状疱疹后遗神经痛、腰痛症、颈肩综合症、肩周炎、变形性关节症”。本发明制剂是申请人创制并作为医药品开发出来的，其有效性和安全性上的优异特长受到赞赏，已经销售多年，并已经在日本医药品市场中确立了稳固的地位。

本发明中的痘苗病毒接种炎症组织提取物能够通过如下操作得到：接种痘苗病毒，将发痘的炎症组织破碎，加入提取溶剂，除去组织碎片后，进行除蛋白处理，使其吸附于吸附剂，然后将有效成分洗脱。即，例如为如下的工序。

(a)收集接种痘苗病毒并使其发痘的兔、小鼠等的皮肤组织等，将发痘组织破碎，加入水、苯酚水、生理盐水或苯酚加甘油水等提取溶剂后，通过过滤或离心分离，得到提取液(滤液或上清液)。

(b)将上述提取液调整为酸性的ph并加热，进行除蛋白处理。接着，将除蛋白后的溶液调整为碱性并加热后，进行过滤或离心分离。

(c)使所得到的滤液或上清液成为酸性，使其吸附于活性炭、高岭土等吸附剂。

(d)在上述吸附剂中加入水等提取溶剂，调整为碱性的ph，将吸附成分洗脱，由此能够得到痘苗病毒接种炎症组织提取物。然后，根据希望，适当将洗脱液在减压下蒸发干燥固化或冻结干燥，由此也能够得到干燥固化物。

作为用于接种痘苗病毒得到炎症组织的动物，能够使用兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等感染了痘苗病毒的各种动物，作为炎症组织，优选兔的炎症皮肤组织。兔只要是属于兔目即可，可以使用任何兔子。作为例子，有：穴兔(oryctolaguscuniculus)、家兔(驯养的穴兔)、野兔(日本野兔)、鼠兔和雪兔等。其中，适合使用家兔。在日本，有从过去被饲养的作为家畜或实验用动物而频繁使用的称为家养兔(イエウサギ)的兔，这也是家兔的别称。在家兔中存在多个品种(breed)，能够优选使用称为日本白色种和新西兰白色种(新西兰白)的品种。

痘苗病毒(vacciniavirus)可以是任意株的痘苗病毒。作为例子，可以列举李斯特(lister)株、大连(dairen)株、池田(ikeda)株、em-63株、纽约市公众卫生局(newyorkcityboardofhealth)株等。

关于上述本发明提取物的基本的提取工序(a)～(d)，更详细而言，例如，能够作为如下的工序实施。

关于工序(a)

在兔的皮肤中将痘苗病毒进行皮内接种使其发痘，收集炎症皮肤组织。收集的皮肤组织以苯酚溶液等进行清洗、消毒。将该炎症皮肤组织破碎，加入其1至5倍量的提取溶剂。其中，所谓破碎是指使用绞碎机等细细地破碎为肉末状。另外，作为提取溶剂，能够使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性至弱碱性的缓冲液等，也可以适当添加苯酚等的杀菌－防腐剂、甘油等的稳定剂、氯化钠、氯化钾、氯化镁等的盐类等。此时，也能够通过冷冻融化、超声波、细胞膜溶解酶或表面活性剂等的处理来破坏细胞组织，使提取变得容易。将得到的悬浮液放置5日至12日。在该期间，可以边适当搅拌或不搅拌边加温到30至45℃。通过对得到的液体进行固液分离(过滤或离心分离等)除去组织碎片，得到粗提取液(滤液或上清液)。

关于工序(b)

对在工序(a)中得到的粗提取液进行除蛋白处理。除蛋白能够由通常进行的公知方法实施，能够应用加热处理、利用蛋白质变性剂(例如酸、碱、脲、胍、丙酮等有机溶剂等)的处理、等电点沉淀、盐析等的方法。接着，利用除去不溶物的通常方法，例如使用滤纸(纤维素、硝酸纤维素等)、玻璃过滤器、硅藻土、塞茨过滤板(seitzfilter)等的过滤、超滤、离心分离等，得到除去了析出的不溶蛋白质的滤液或上清液。

关于工序(c)

将在工序(b)中得到的滤液或上清液调整为酸性、优选调整为ph3.5至5.5，进行向吸附剂的吸附操作。作为能够使用的吸附剂，能够列举活性炭、高岭土等，在提取液中添加吸附剂进行搅拌，或使提取液通过吸附剂填充柱，能够使有效成分吸附于该吸附剂。在提取液中添加吸附剂时，通过过滤或离心分离等除去溶液，能够得到吸附有活性成分的吸附剂。

关于工序(d)

为了使活性成分从工序(c)中得到的吸附剂中洗脱(脱离)，在该吸附剂中加入洗脱溶剂，调整为碱性、优选调整为ph9至12，在室温或适当加热、或者搅拌进行洗脱，以过滤或离心分离等通常的方法除去吸附剂。作为所使用的洗脱溶剂，能够使用碱性溶剂，例如，能够使用调整为碱性ph的水、甲醇、乙醇、异丙醇等或它们的适当的混合溶液，能够优选使用调整为ph9至12的水。洗脱溶剂的量能够适当设定。为了将这样操作得到的洗脱液作为原药使用，能够将ph适当地调整到中性附近等，最终得到接种痘苗病毒的兔炎症皮肤提取物(本发明提取物)。

本发明提取物在制成时为液体，因此也能够通过适当浓缩、稀释制成所希望浓度的提取物。从本发明提取物制造制剂时，优选实施加热灭菌处理。为了制成注射剂，例如，能够加入氯化钠等配制与生理盐水等渗的溶液。另外，也能够通过以液体或凝胶等的状态口服给药，也能够通过对本发明提取物进行适当的浓缩干燥固化等的操作，制造片剂等的口服用固体制剂。从本发明提取物制造这样的口服用固体制剂的具体方法记载于日本专利第3818657号和日本专利第4883798号的说明书中。本发明制剂是这样操作得到的注射剂或口服用制剂等。另外，本发明制剂也能够制成通过导管对想要使muse细胞迁移的部位进行给药的制剂。

作为对需要治疗的患者施用药学上有效的量的方法，没有特别限定，能够根据治疗目的适当选择。例如，除了口服给药以外，还可以列举皮下、肌肉内、静脉内给药、经皮给药等，在以使多能性干细胞聚集于损伤部位为目的的情况下，希望例如使用导管等直接施用于损伤部位。给药量能够根据痘苗病毒接种炎症组织提取物的种类适当设定。就市售的制剂中批准的给药量而言，例示有基本上以在内服时1天给药16nu、在注射剂时1天给药3.6至7.2nu的方式的医疗用医药品，但是，根据疾病的种类、严重程度、患者的个体差异、给药方法、给药周期等，能够适当增减给药量(nu：神经妥乐平单位。神经妥乐平单位使用疼痛阈值比正常动物低的慢性应激动物即sart应激小鼠，按照改进的randall-selitto方法进行试验，基于镇痛效力的ed50值加以规定。1nu表示ed50值为100mg/kg时的神经妥乐平制剂的含镇痛活性成分1mg的活性。)。

以下，例示本发明提取物的制造方法的例子、以及关于本发明提取物的新的药理作用、多能性干细胞的迁移促进作用的药理试验结果，但本发明不受这些实施例的记载任何限制。

实施例

实施例1(本发明提取物的制造)

在健康成年家兔的皮肤中皮内接种痘苗病毒，切下并收集发痘的皮肤。收集的皮肤以苯酚溶液进行清洗、消毒后，除去多余的苯酚溶液，进行破碎，加入苯酚溶液混合，放置3～7日后，接着边搅拌3～4日边在35～40℃加热。然后，用盐酸将固液分离得到的提取液调整到ph4.5～5.2，以90～100℃加热处理30分钟后，过滤除去蛋白。再用氢氧化钠将滤液调整到ph9.0～9.5，以90～100℃加热处理15分钟后，进行固液分离。

用盐酸将得到的除蛋白液调整到ph4.0～4.3，加入除蛋白液质量的2％量的活性炭，搅拌2小时后，进行固液分离。在收集的活性炭中添加水，用氢氧化钠调整到ph9.5～10，以60℃搅拌90～100分钟后，进行离心分离得到上清液。在以离心分离沉淀的活性炭中再添加水后，用氢氧化钠调整到ph10.5～11，以60℃搅拌90～100分钟后，进行离心分离得到上清液。合并两上清液，用盐酸中和，得到本发明提取物。

实施例2(试验方法和试验结果)

接着，表示显示上述实施例1中得到的本发明提取物的muse细胞的细胞迁移活性化作用的药理试验的试验方法和试验结果。

试验例1使用博伊登室(boydenchamber)法的评价

细胞和试剂

对于源自人脂肪组织的间充质干细胞(lonza)，使用含有15％胎牛血清(fbs)和0.1mg/ml的硫酸卡那霉素(gibco)的dulbecco改良eagle培养基(dmem；gibco)，在37℃的co2培养箱内培养。

muse细胞迁移能力的测定

在测定前一天，利用facs(fluorescenceactivatedcellsorting，荧光激活细胞分选)分离muse细胞和非muse细胞，在37℃、5％co2条件下培养过夜。在测定日将corningbiocoatmatrigel(注册商标、以下同样)invasionchamber(24孔，8.0μm，bdbioscience)的培养插件(上段)浸入试验用培养基，在37℃、5％co2培养箱中孵育2小时。2小时后，在配套用板(companionplate)(下段)中在每1孔中添加750μl含有各浓度(0、20、100mnu/ml)的本发明提取物的培养基。将前一天分离得到的muse细胞和非muse细胞，用台盼蓝排斥法计数，以分别成为5×10⁴细胞/500μl的方式悬浮于含有10％fbs的培养基中。在培养插件中每1孔添加500μl各细胞悬浮液，将corningbiocoatmatrigelinvasionchamber在37℃、5％co2条件下静置。静置24小时后，用棉棒擦去残存于培养插件的上侧表面的没有通过pet膜的细胞，从培养插件除去。使用diff-quickkit(sysmex)将通过了培养插件的下侧表面的pet膜的迁移细胞染色。将膜风干后，对每1个膜以倍率200倍对pet膜下侧的细胞观察独立的4个视野，对细胞数进行测定。将4个视野的平均细胞数作为每1个膜的迁移细胞数。图1表示通过了pet膜的迁移细胞的染色图像。细胞的本来的颜色为紫色，但在染色图像中，被染成淡色的是细胞(看起来是黑点的不是细胞)。

统计解析

2组之间使用student的t-检验进行比较，将p＜0.05的情况作为“显著”。试验实施3次，求出平均细胞数和标准误差。在3次试验中得到了同样的结果，因此显示为代表性的数据。

试验结果

在muse细胞组中，本发明提取物的浓度为20mnu/ml和100mnu/ml时，迁移细胞数显著增加。即，本发明提取物显示对于muse细胞具有迁移促进作用。另一方面，在非muse细胞组中，没有观察到迁移细胞数的显著增加。上述内容表明本发明提取物特异性地促进muse细胞的迁移。将结果的一例表示在图2中。图中，横轴表示本发明提取物不同的浓度，纵轴表示由本发明提取物引起迁移的muse细胞数。

试验例2使用细胞动态解析技术(taxiscantechnology)的评价

细胞和试剂

将源自人骨髓的间充质干细胞使用含有dulbeccopbs、0.5％牛血清白蛋白和2mmedta(乙二胺四乙酸)的facs缓冲液，配制为细胞浓度为1×10⁷细胞/ml。作为一次抗体添加抗ssea-3抗体(稀释400倍)，在冰上一边适当悬浮一边反应1小时后，离心分离，将上清液除去。然后，重复3次facs缓冲液的添加和除去，进行清洗。作为二次抗体添加fitc标记抗大鼠igm抗体(稀释100倍)，与上述同样，在冰上反应1小时后，重复3次facs缓冲液的添加和除去，进行清洗。

muse细胞迁移能力的测定

在测定前一天利用facs分离ssea-3阳性的细胞，在37℃、5％co2条件下培养过夜。在测定日将培养的细胞回收，使用加入了25mmhepes(2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)的迁移能力测定用培养基，将细胞悬浮。在ez-taxiscan(注册商标，以下同样)holderchamber(gehealthcare)的各孔中注入细胞悬浮液，用水位差法使细胞在通道(terrace)前排列。其中，将通道的深度设为6μm。将ez-taxiscanholderchamber在37℃、5％co2条件下放入培养箱。然后，将ez-taxiscanholderchamber从培养箱中取出，设置在ez-taxiscan(gehealthcare)的主体板后，在试样侧孔中，作为本发明提取物50mnu/ml或阳性对照，添加鞘氨醇-1-磷酸(s1p)2μm。每10分钟拍摄各孔的照片，经时地测定迁移能力。s1p是来自鞘脂的脂质介质，经由s1p受体调节细胞的存活、增殖、分化、运动等。还已知s1p具有muse细胞的迁移促进作用(国际公开wo2014/133170)。

试验结果

本发明提取物添加组中，muse细胞向添加的方向移动，确认到多个移动到chamber外部的细胞。作为阳性对照使用的s1p添加组也同样确认到muse细胞的移动。

工业上的可利用性

如上所述，可知本发明提取物显示muse细胞的迁移促进作用。根据该结果可认为本发明提取物或含有该提取物的制剂的给药会成为促进损伤的治疗的有效的方法。