用于细胞输送、细胞培养和炎症预防的脱细胞化的人羊膜的制作方法

相关申请的交叉引用本申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2015年4月17日提交的美国临时申请第62/149,447号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。背景在过去的二十年中，人们对组织和器官的脱细胞化以创建生物细胞外基质支架的兴趣增大。这些支架含有天然组织的微观结构，理论上，在用干细胞接种时它可以提供组织和器官再生的框架。脱细胞组织带来的激动人心的潜能使得研究人员对皮肤、小肠粘膜下层、膀胱、血管、心脏瓣膜和肝脏等几种组织的脱细胞作用进行了研究(chen,r.n.etal.(2004)biomaterials25:2679-2686;badylak,s.f.etal.(1995)journalofbiomedicalmaterialsresearch29:977-985;chen,f.etal.(1999)urology54:407-410;dahl,s.l.etal.(2003)celltransplantation12:659-666;korossis,s.a.etal.(2002)thejournalofheartvalvedisease11:463-471;uygun,b.e.etal.(2010)naturemedicine16:814-820)。这些脱细胞支架已经成功地应用于皮肤和骨移植、硬脑膜修复、疝修补和肌腱修复以及心脏瓣膜置换等临床应用。虽然有几个研究小组试图再细胞化(recelluarize)整个器官，但创造“现货(off-the-shelf)”器官的最终目标尚未实现。技术实现要素：虽然有几个小组已经研究了胎盘的脱细胞作用，但胎盘脱细胞的全部临床潜力尚未确定。胎盘是一个独特的器官，其尚未成为脱细胞的主要焦点，申请人认为胎盘的独特再生特性可能比其他脱细胞组织在干细胞输送、组织工程、伤口愈合和炎症预防方面具有独特的优势。如下文更详细提供的，本发明利用足月胎盘、收集羊膜，并使用标准方案去除细胞成分。这导致产生脱细胞羊膜片，其随后可用于产生羊膜衍生的细胞外基质水凝胶，或被微粉化成粉末而用作局部用粉末或与盐水混合以产生可注射的、可流动的基质溶液或局部用凝胶。这些脱细胞产物可以用于干细胞输送、细胞培养和炎症预防，例如腹膜粘连(peritonealadhesion)应用。脱细胞羊膜及其衍生物的产生以及这些产品在防止粘连和瘢痕形成中的应用(例如用于愈合伤口、再生组织和防止粘连)具有新的治疗潜力。在一个方面，本文提供了分离的脱细胞羊膜(dcm)，其可分离自任何适当的来源，例如人、牛、马、猫科动物、犬科动物或鼠科动物。另一方面，分离的dcm通过冷冻、冷冻干燥、冻干和/或微粉化而加工成粉末或用胃蛋白酶处理而产生水凝胶。在另一方面，dcm或加工的产品与载体组合，例如药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水、去离子水、水凝胶或基于胶原的产物中的一种或多种。上述组合物可以进一步包含一种或多种治疗性细胞，或者基本上由一种或多种治疗性细胞组成，或者进一步由一种或多种治疗性细胞组成。这种细胞的非限制性实例包括干细胞，例如间充质干细胞。该细胞可以来自与分离的dcm相同的物种或适当的其他物种。本文还提供了培养细胞的方法，包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成或者由以下步骤组成：将该细胞与分离的dcm、水凝胶或基于胶原的产物混合，并在有利于该细胞的生长和扩张的条件下在所组合的组合物中培养该细胞。混合可以在体外或体内进行。在一个方面，细胞是治疗性细胞，例如干细胞，如间充质干细胞。本文还提供治疗方法。本文提供治疗伤口的方法，该方法向有需要的受试者施用有效量的如上所述的分离的dcm或如上所述的其它组合物。本文还提供用于调节、治疗或预防有此需要的受试者的炎症的方法，该方法向有需要的受试者施用有效量的如上所述的分离的dcm或如上所述的其它组合物。本文还提供了治疗或预防有需要的受试者中的粘附或瘢痕形成的方法，该方法向有需要的受试者施用有效量的如上所述的分离的dcm或如上所述的其他组合物。本文提供治疗脊髓损伤或脊柱裂的方法，该方法向有需要的受试者施用有效量的如上所述的分离的dcm或如上所述的其它组合物。本文还提供了一种促进有此需要的受试者的血管形成的方法，该方法向受试者施用有效量的如上所述的分离的dcm或如上所述的其它组合物。在一个方面，所述组合物进一步包含干细胞，所述干细胞可以是正在治疗的受试者的同种异体干细胞或自体干细胞。这些方法可以用于治疗人类患者或治疗动物，例如牛、马、猫科动物、犬科动物或鼠科动物。本文还提供了试剂盒，其含有如上所述的组合物并且任选地含有使用说明书。本文所述的组合物可用于治疗脊髓损伤和脊柱裂。本文所述的源自人胎盘的用于人的治疗组合物可以根据需要在体内和在子宫内施用。可以对本文所述的组合物进行修饰以优化其各种免疫调节性质，并以有效量给予需要这种治疗的患者或受试者。本文所述的组合物可用于将干细胞在体外和体内分化成不同的组织谱系。细胞和组织可以来源于多能干细胞或者从如骨髓、脂肪组织、肺、牙蕾等组织中获得，如本文所述使用。本文所述的组合物起到的治疗效果可能归因于所包含的生物学功能生物分子，例如细胞外基质、细胞因子、趋化因子、前列腺素等。因此，可将本文所述的组合物施用于有此需要的受试者或患者以调节炎症和促进血管生成。附图说明图1a-1b显示了胶原水凝胶的扫描电子显微镜图像。(图1a)浓度为3mg/ml的水凝胶，(图1b)5mg/ml。图像在2000x放大时拍摄，比例尺为10微米。图2a-2b显示纤维蛋白水凝胶的扫描电子显微镜图像。(图2a)浓度为5mg/ml的水凝胶，(图2b)20mg/ml。图像在2000x放大时拍摄，比例尺为10微米。图3a-3c显示了羊膜水凝胶的扫描电子显微镜图像。(图3a)浓度为4mg/ml的羊水凝胶，(图3b)6mg/ml，(图3c)8mg/ml。图像在2000x放大时拍摄，比例尺为10微米。图4显示了水凝胶的胶凝动力学。在500nm用分光光度法测量。图5显示了各种水凝胶中pmsc的增殖。浓度为20mg/ml的纤维蛋白水凝胶、浓度为3和5mg/ml的胶原水凝胶和浓度为6和8mg/ml的羊膜水凝胶。图6显示了与二维细胞培养和对照相比，包埋在羊膜水凝胶、胶原蛋白水凝胶和纤维蛋白水凝胶中的pmsc的旁分泌。图中显示了密度值高于103的因子。图7显示了与二维细胞培养相比，包埋在羊膜水凝胶中的pmscs的旁分泌。显示了综合密度值高于103的因子。图8a-8d显示了干细胞水凝胶构建体的live-dead细胞荧光试验。(图8a)具有c2c12成肌细胞的羊膜水凝胶，(图8b)具有pmsc的羊膜水凝胶，(图8c)具有sh-sy5y成神经细胞瘤细胞的羊膜水凝胶，(图8d)具有骨髓msc的羊膜水凝胶。图像在100倍放大率时拍摄。图9a-9c示出了在沿着左侧肠旁沟的标准位置产生四个腹膜按钮，盲肠被手动磨蚀以诱导术后粘连(图9a)。然后在初次操作(indexprocedure)过程中将羊膜(图9b)或10ml的am-ecm水凝胶(图9c)置于腹腔内。图10a-10c显示了对照动物在全部四个腹膜按钮和中度至重度粘连处显示牢固的粘连形成(图10a)。用脱细胞羊膜处理的动物表明，该膜防止了膜覆盖的腹膜按钮处的粘连形成(图10b)。用脱细胞化的am-ecm处理的动物也表现出粘连形成的量和严重性下降(图10c)。图10c中所示的am-ecm动物没有任何粘连性疾病，腹膜纽扣和盲肠被覆盖一个薄层的am-ecm水凝胶中。图11a-11g显示了在动物模型中体内应用水凝胶的组织学和免疫荧光检查。发明详述除非另有说明，否则本技术的实施将采用本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术。参见例如sambrookandrusselleds.(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition;theseriesausubeletal.eds.(2007)currentprotocolsinmolecularbiology;theseriesmethodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.);macphersonetal.(1991)pcr1:apracticalapproach(irlpressatoxforduniversitypress);macphersonetal.(1995)pcr2:apracticalapproach;harlowandlaneeds.(1999)antibodies,alaboratorymanual;freshney(2005)cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,5thedition;gaited.(1984)oligonucleotidesynthesis;美国专利号4,683,195;hamesandhigginseds.(1984)nucleicacidhybridization;anderson(1999)nucleicacidhybridization;hamesandhigginseds.(1984)transcriptionandtranslation;immobilizedcellsandenzymes(irlpress(1986));perbal(1984)apracticalguidetomolecularcloning;millerandcaloseds.(1987)genetransfervectorsformammaliancells(coldspringharborlaboratory);makridesed.(2003)genetransferandexpressioninmammaliancells;mayerandwalkereds.(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(academicpress,london);及herzenbergetal.eds(1996)weir’shandbookofexperimentalimmunology。如本文所使用的，某些术语可以具有以下定义的含义。如说明书和权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数指代。例如，术语“细胞”包括单个细胞以及多个细胞，包括其混合物。如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应意味着排除对组成或方法具有任何实质重要性的其他元素。“由...组成”应指排除要求保护的组合物和实质性方法步骤的超过微量元素的其他成分。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本发明的范围内。因此，所述方法和组合物可以包括额外的步骤和组分(包含)或者包括不重要的步骤和组合物(基本上由...组成)或者仅包括所陈述的方法步骤或组合物(由...组成)。所有数值标示，例如ph、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)都是近似值，其以0.1的增量变化(+)或(-)。应该理解的是，虽然并不总是明确指出，所有的数值标示之前都有术语“大约”。术语“大约”除了包括诸如“x+0.1”或“x-0.1”之类的“x”的微小增量之外，还包括精确值“x”。尽管并不总是明确指出，本文描述的试剂仅仅是示例性的，并且这些的等价物是本领域已知的。“组合物”还意在包括活性剂与另一种载体的组合，例如惰性的(例如可检测试剂或标记)或活性的化合物或组合物，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可单独或组合存在，其按重量或体积计单独或组合地占1-99.99%。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白(例如人血清白蛋白(hsa))、重组人白蛋白(rha)、明胶、酪蛋白等。代表性的氨基酸/抗体组分(也可以起缓冲作用)包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸，甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也在本发明的范围内，其实例包括但不限于单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。术语“药学上可接受的载体”(或介质)可与术语“生物相容的载体或介质”互换使用，是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与治疗性给药的细胞和其他药剂相容，而且在合理的医学判断范围内，也适用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或具有相称的利益/风险比率的其他并发症。适用于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体(例如凝胶)和固体材料(例如，细胞支架和基质、管板(tubesheet)以及其他本领域已知的并且在本文更详细描述的这样的材料)。这些半固体和固体材料可以被设计成抵抗体内降解(不可生物降解)，或者它们可以被设计成在体内降解(可生物降解的、生物可蚀的)。可生物降解的材料还可以是生物可再吸收的或生物可吸收的，即它可以被溶解并被吸收到体液中(水溶性植入物是一个实例)，或者被降解并最终从身体消除，通过转化成其他材料或者通过自然途径分解和消除。在一个方面，术语“水凝胶”意指天然的、重组的或合成来源的水凝胶聚合物或其杂合物，水凝胶以干燥的、较少水合的或基本上去溶胀的(deswollen)状态引入，并在生理环境中再水化以进行体积膨胀，并影响组织或器官的封闭(sealing)、填塞(plugging)或增大或影响组织或器官中的缺陷。水凝胶聚合物可以通过在该位点的控释释放而输送治疗物质。美国专利号7,780,980中描述了这样的一个非限制性例子。如'980号专利所述，水凝胶是吸收溶剂(如水)的材料，其经历快速溶胀而没有明显溶解，并保持能够可逆变形的三维网络。参见例如park,etal.,biodegradablehydrogelsfordrugdelivery,technomicpub.co.,lancaster,pa.(1993)本文使用的水凝胶可以是未交联的或交联的。水凝胶可以通过物理或化学交联或这两种方法的组合来形成。如'980号专利所述，物理交联是由于离子键、氢键、范德华力或其它这样的物理作用力导致的。化学交联是由于形成共价键而发生的。亲水聚合物(包括水溶性聚合物)的共价交联网络通常称为水合状态的水凝胶(或水凝胶(aquagel))。已经基于具有不同长度聚氧乙烯侧链的甲氧基聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯的交联聚合物链来制备水凝胶，并且已经研究了它们与血液成分的相互作用(nagaokaetal.,inpolymersasbiomaterial(shalabyetal.,eds.)plenumpress,1983,p.381)。该术语还包括已知维持和扩增多潜能和多能干细胞的基质，例如matrigel。matrigel是由corninglifesciences生产和销售的由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的商品名。trevigen,inc.以商品名cultrexbme销售另一种形式的该凝胶状蛋白质混合物。matrigel类似于在许多组织中发现的复杂细胞外环境，并被用作培养各种类型的多潜能和多潜能干细胞的底物。其他例子包括用于组织工程研究、细胞培养和生物化学的牛胶原溶液(i型)的purecol®ez凝胶(参见advancedbiomatrix.com/collagen-type-i/purecol-ez-gel/)。另一个例子是excellagen，它是用于伤口护理管理的药学上配制的纤维状i型牛胶原凝胶。excellagen流动的即用型配方适用于不同形状和表面轮廓的伤口以及片状产品不适合的隧道(tunneled)/深层(undermined)伤口。(请参阅excellagen.com)。如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指动物、哺乳动物或更进一步地为人类患者。仅出于说明的目的，哺乳动物包括但不限于人、猴、鼠科动物、牛、马、猪或羊。如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其它物质(例如大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%)的分子或生物物质或细胞物质。在一个方面，术语“分离的”是指分别与其他存在于天然来源中的dna或rna、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离的核酸(如dna或rna)、或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官，其允许对材料进行操作以获得其原始或天然状态下不能实现的结果，例如重组复制或突变操作。术语“分离的”还指当通过重组dna技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白中分离的多肽，并且意欲包括纯化的和重组的多肽，例如纯度大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞或组织中分离的细胞或组织，并且意欲涵盖培养的和工程化的细胞或组织。如本文所用，“干细胞”是指在培养物中具有无限期分裂并产生特化细胞的能力的细胞。在本文中，为了方便，干细胞被分类为成体(成人)干细胞或胚胎干细胞。成体干细胞是在分化的组织中发现的未分化的细胞，其可以自我更新(克隆)并且(具有一定的局限性地)分化以产生其起源组织的所有特化细胞类型。胚胎干细胞是来自胚胎的原始(未分化的)细胞，其具有成为各种各样的特化细胞类型的潜力。胚胎干细胞是已经在体外条件下培养的细胞，其允许在数月至数年内增殖而不分化。通过使用标志物可以将多能胚胎干细胞与其他类型的细胞区分开来，这些标志物包括但不限于oct-4、碱性磷酸酶、cd30、tdgf-1、gctm-2、genesis、生殖细胞核因子、ssea1、ssea3和ssea4。术语“干细胞”还包括“去分化”干细胞，其一个例子是直接转化为干细胞的体细胞，即重编程细胞。克隆是与原始细胞(在这种情况下为干细胞)基因相同的细胞系。“诱导多能细胞”是指从成体细胞重编程为未成熟表型的胚胎样细胞。本领域已知有多种方法可以获得这样的细胞，例如2014年1月29日发表于nature的“asimplenewwaytoinducepluripotency”，2014年2月5日最后一次访问的sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445，以及美国专利公开第2010/0041054号。人类ipsc也表达干细胞标志物，并且能够产生具有所有三个胚层特征的细胞。术语“增殖”是指生长或改变细胞或细胞群的表型。术语“生长”或“扩增”是指在重组支持性培养基、营养素、生长因子、支持细胞或获得所需数量的细胞或细胞类型所需的任何化学或生物学化合物的条件下的细胞增殖。在一个实施方案中，细胞的生长导致组织的再生。术语“培养”是指细胞或生物体在各种介质上或介质中的体外增殖。可以理解的是，在培养物中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同(即在形态上、基因上或表型上不完全相同)。“扩增”是指细胞的任何繁殖或分裂。“克隆增殖”是指通过将单细胞连续分裂成两个相同的子细胞和/或相同细胞群而使细胞群生长。如本文所用，细胞的“谱系”是指细胞的遗传，即其前身和子代。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的谱系结构之中。“分化”描述非特化细胞获得特化细胞(如心脏、肝脏或肌肉细胞)的特征的过程。“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化成特定的细胞类型或表型。“去分化的(dedifferentiated)”是指返回到细胞谱系内一个较不特化的位置的细胞。如本文所用，术语“分化”是指在细胞谱系内占据更特化(“分化”)的位置的细胞。如本文所用，“分化成中胚层(或外胚层或内胚层)谱系的细胞”是指分别成为特化的中胚层、外胚层或内胚层谱系的细胞。分化成中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞实例包括但不限于：脂肪形成细胞、平滑肌形成细胞、软骨形成细胞、心源性细胞、皮肤生成细胞、造血细胞、血管生成细胞、生肌细胞、肾源性细胞、泌尿生殖细胞、成骨细胞、心包生成细胞、或基质细胞。分化成外胚层谱系的细胞实例包括但不限于表皮细胞、神经原细胞和神经胶质细胞。分化成内胚层谱系的细胞实例包括但不限于胸膜生成细胞、肝生成细胞(hepatogeniccell)、产生肠内膜的细胞、以及产生胰生成细胞(pancreogenic)和内脏生成细胞(splanchogenic)的细胞。如本文所使用的，“多能细胞”是指分化程度较低的细胞，其可以产生至少两种不同的(基因型上和/或表型上)进一步分化的后代细胞。“多谱系干细胞”或“多能干细胞”是指自身再生并且产生来自不同发育谱系的至少两种进一步分化的子代细胞的干细胞。谱系可以来自相同的胚层(即中胚层、外胚层或内胚层)，或来自不同的胚层。由多谱系干细胞分化而成的具有不同发育谱系的两种子代细胞的实例是生肌细胞和脂肪形成细胞(均来源于中胚层，但产生不同的组织)。另一个例子是(外胚层来源的)神经母细胞和(中胚层来源的)脂肪形成细胞。如本文所用，术语“治疗”是指为了通过减少、减轻、逆转或预防至少一种不利作用或症状来改善患者的状况的目的而施用药物组合物。如本文所用，术语“预防”是指识别出对疾病具有增加的易感性但尚未表现出疾病症状的受试者(即，患者)，并且根据本公开的原理实施治疗。预防性治疗的目的是减少易感者后来出现症状的可能性，或者比在没有预防性治疗的情况下，疾病的发作推迟或进展更慢。可以通过任何适当的方法将受试者识别为具有增加的发病可能性，所述方法包括例如通过识别疾病或其他退行性脑病的家族史，或具有一种或多种指示疾病或对疾病易感的标记物。术语“有效量”是指足以达到所需效果的量。在治疗或预防应用的情况下，有效量将取决于所讨论的病症的类型和严重程度以及个体受试者的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。“施用”可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。确定最有效的给药方法和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的、被治疗的靶细胞和被治疗的受试者而变化。可以根据主治医师选择的剂量水平和模式而单次或多次给药。合适的剂量制剂和给药方法在本领域是已知的。也可以确定施用途径，确定最有效施用途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的、受治疗的受试者的健康状况或疾病阶段及靶细胞或组织而变化。给药途径的非限制性实例包括口服给药、鼻腔给药、吸入、注射和局部应用。具体实施方式本公开提供了分离的脱细胞羊膜(dcm)。在一个方面，将分离的dcm进一步处理，例如冷冻、冷冻干燥、冻干和/或微粉化成粉末或用胃蛋白酶处理以产生水凝胶。另一方面，分离的dcm进一步包含载体，例如药学上可接受的载体，或者基本上由其组成，或者由其组成。药学上可接受的载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、去离子水、水凝胶或基于胶原的产物中的一种或多种。在一个方面，分离的dcm源自分离自人、牛、马、猫科动物、犬科动物或鼠科动物的胎盘。另一方面，所述组合物或dcm进一步包含一种或多种治疗性细胞，或者基本上由其组成，或由其组成，所述治疗性细胞例如是基因工程细胞(例如原核或真核细胞)、干细胞(如间充质干细胞)。干细胞可以来自任何合适的动物来源，例如人、牛、马、猫科动物、犬科动物或鼠科动物。它可以是受试者自体或异体的。本文进一步提供了培养细胞的方法，所述方法包含以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：将所述细胞与如上所述的dcm水凝胶混合，并在有利于所述细胞生长和扩增的条件下培养所述细胞。混合可以在体外或体内进行。所述细胞可以是一种或多种治疗性细胞，例如基因工程细胞(例如原核或真核)，例如干细胞，如间充质干细胞。干细胞可以来自任何合适的动物来源，例如人、牛、马、猫科动物、犬科动物或鼠科动物。它可以是受试者自体或异体的。本文还提供了治疗伤口的方法，所述方法包含以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：向有需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的dcm和/或组合物，从而治疗伤口。另外的疗法和/或组合物可以与该治疗应用组合，例如抗生素、生长因子等。如主治医生或兽医所确定的，共同施用可以是同时施用或顺序施用。因此，所述方法可以用于动物以及人类，并且dcm的来源被选择用于所述受试者。本文还提供了用于治疗或预防有此需要的受试者的炎症的方法，所述方法包含以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：向受试者施用有效量的分离的dcm和/或如本文所述的组合物，从而治疗或预防炎症。另外的治疗和/或组合物可以与该治疗应用组合，例如抗炎剂，例如类固醇等。如主治医生或兽医所确定的，共同施用可以是同时施用或顺序施用。因此，这些方法可用于动物以及人类。本文进一步提供了用于治疗或预防有需要的受试者中的粘连或瘢痕形成的方法，所述方法包含以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：施用有效量的本文所述的分离的dcm和/或组合物，从而治疗或预防粘连或瘢痕形成。另外的治疗和/或组合物可以与治疗应用组合，例如抗炎剂，例如类固醇等。如主治医生或兽医所确定的，共同施用可以是同时施用或顺序施用。因此，这些方法可用于动物以及人类。在所公开的方法中，施用包括局部、腹膜内、局部或全身施用中的一种或多种，并且在一个方面，组合物还包含干细胞。所述细胞或组合物对所治疗的受试者来说可以是自体的或同种异体的，并且受试者是任何合适的受试者，这样的非限制性例子包括人、牛、马、猫科动物、犬科动物或鼠科动物。本文进一步提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的分离的dcm和/或组合物，或者基本上由其组成，或者进一步由其组成，并且该试剂盒任选地包含进行本文所公开的方法和制备本文公开的组合物和dcm的说明。实验部分实施例1羊膜脱细胞足月胎盘从加利福尼亚大学戴维斯医学中心妇产科在接受阴道或剖宫产分娩后获得。将胎盘带到外科生物工程实验室，并使用钝性解剖从绒毛膜板上切下羊膜。羊膜在1xpbs中洗涤，然后在-20°c冷冻器中冷冻，直到其需要用于脱细胞。在脱细胞时，将羊膜从冷冻器中取出，利用brown等人开发的方案解冻脱细胞化，该方案之后被改良而用于羊膜处理(brown,b.etal.(2006)tissueengineering12:519-526)(表i)。表i:羊膜脱细胞方案时间称重羊膜冻融羊膜24小时，循环3次去离子水洗30分钟x30.02%胰蛋白酶/0.05%edta1小时去离子水冲洗、揉3%triton1小时去离子水冲洗、揉4%脱氧胆酸钠1小时去离子水冲洗、揉0.1%过乙酸/4%乙醇2小时1x磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗15分钟去离子水冲洗15分钟x2去除多余的去离子水，并在-20°c冰箱中冷冻产品对技术人员显而易见的是，上述时间和成分可以变化，并且仍然在本发明的范围和精神内。例如，本文提供了使羊膜组织脱细胞化的方法，所述方法包含以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：冷冻和融化从合适宿主分离的羊膜组织至少两个、或至少三个、至少四个或更多个循环，每个循环为20至约28小时，或者22至27小时之间，或者23至26小时之间或者约24小时的循环。然后，将产物揉10分钟，用去离子水洗涤30分钟，重复至少2个、或者至少3个、或者至少4个循环。加入洗涤剂溶液以裂解细胞并帮助脱细胞，如3%triton，并将组合物转移至振荡器中振荡约1小时，然后用去离子水漂洗约1小时或至少30分钟去除洗涤剂溶液。向产物中加入4%脱氧胆酸钠溶液以进一步使组织脱细胞化，并将组合物转移至stovalbellydancer至少30分钟或至少1小时，然后进行如上所述的去离子水按揉。将产物返回至振荡器中，加入约0.1%过乙酸/4%乙醇的溶液并保持至少1.5小时或至少2小时，以从ecm中消毒并除去残留的核酸，而对组合物的成分和结构影响最小。然后在振荡器上用1x磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗组合物至少10分钟，或者至少15分钟。用去离子水在振荡器上再次清洗产物(至少一次、或两次或更多次)至少10分钟，或者至少15分钟。除去多余的水分，产品可以冷冻或进一步加工储存。脱细胞后，将羊膜冷冻保存。然后可以如本文所述，使用脱细胞膜用于例如产生脱细胞羊膜衍生的细胞外基质水凝胶以用于干细胞输送、细胞培养和组织工程和/或使用脱细胞羊膜片或脱细胞化羊膜衍生的细胞外基质水凝胶防止腹部粘连，以及涉及这些问题的疾病或病症的治疗。脱细胞人羊膜衍生的细胞外基质(am-ecm)水凝胶——一种用于干细胞输送、细胞培养和组织工程的新型支架干细胞具有用于组织工程和其他基于细胞的治疗应用的巨大潜力。但目前使用干细胞的再生策略常常受到移植后细胞存活率、分布和整合的限制，部分是由于干细胞输送到组织损伤部位的方法不佳。通过使用支持三维细胞培养的水凝胶已经部分地克服了这个问题。然而，为了优化干细胞的治疗潜力，需要创建维持细胞活力并促进整合的新的细胞输送载体。维持和扩增多能干细胞和多潜能干细胞需要适当的基质。matrigel就是一个很好的基质例子。matrigel是由corninglifesciences生产和销售的由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的商品名。trevigen,inc.以cultrexbme的商标名销售自己的版本。matrigel类似在许多组织中发现的复杂细胞外环境，并被用作培养各种类型的多潜能和多能干细胞的底物。然而，其肉瘤来源使其不可能用于临床应用。还有一些其他基质已经开发用于干细胞扩增、输送或伤口处理。例如，用于组织工程研究、细胞培养和生物化学的牛胶原蛋白溶液(i型)purecol®ez凝胶(advancedbiomatrix.com/collagen-type-i/purecol-ez-gel)。另一个例子是excellagen，它是用于伤口护理管理的药学上配制的纤维状i型牛胶原凝胶。excellagen流动的即用型配方适用于不同形状和表面轮廓的伤口以及片状产品不适合的隧道/深层伤口(excellagen.com)。到目前为止，市场上还没有人源(无异种)水凝胶基质可用于人类干细胞培养、扩增和输送。为此，本文提供了由脱细胞人羊膜(am-ecm，片和水凝胶形式)制成的细胞外基质，用于繁殖和扩增人类干细胞以及用于干细胞输送。am-ecm水凝胶由于其免疫调节性质和血管生成性质、其生物相容性以及am-ecm通过自然过程生物降解的能力，而成为用于组织修复和再生的有前景的材料。此外，分娩后，胎盘是一种可获得器官(accessibleorgan)，其应该被使用且可以存储以备将来使用。方法胎盘来源的间充质干细胞培养来自不同来源如骨髓或胎盘的多能间充质干细胞为基于细胞的疗法提供很大的希望。最近的一些公开文献表明胎盘来源的间充质干细胞(pmsc)具有广泛的应用，并且可以作为骨髓基质细胞的有效替代物(lankford,l.etal.(2015)worldjournalofstemcells7:195-207;parolini,o.etal.(2011)placenta32(suppl2):s186-s195)。在这项研究中，申请人使用人类pmsc作为例子。pmsc分离自胎盘组织中，其从位于加利福尼亚州萨克拉门托的加州大学戴维斯医学中心从常规分娩和手术分娩中获得的。将细胞在37℃、5%co2培养箱中在补充有20ng/mlbfgf和20ng/mlegf的5%fbsdmem中进行扩增。水凝胶的制备脱细胞后，将羊膜冻干(冷冻干燥)并在室温下储存在无菌容器中，直至水凝胶形成。使用由wolf等开发的改良方案生成水凝胶(wolf,m.t.etal.(2012)biomaterials33:7028-7038)(表ii)。表ii:脱细胞的am-ecm水凝胶方案测定脱细胞冻干产品的重量将脱细胞产物粉碎成在>3mm的碎片用milli-q水稀释脱细胞产物直至达到10mgecm/ml的浓度向溶液中加入1mg/ml的猪胃蛋白酶向溶液中加入1m盐酸(hcl)以获得0.01nhcl溶液在室温下以恒定速率搅拌溶液72小时溶液可以冷冻在-20°c以备后用或立即用于凝胶化为了诱导胶凝，通过加入1/10体积的0.1nnaoh来中和溶液的ph加入消化量的1/9的10倍pbs对技术人员显而易见的是，上述时间和成分可以变化，并且仍然在本发明的范围和精神内。因此，本文提供了使am-ecm脱细胞化以提供水凝胶基质的方法。将脱细胞的产物切成约3mm的碎片并与milli-q水或其等价物混合以达到约8至15，或者约11至13，或者约10mgecm/ml的浓度。有效量的胃蛋白酶以约1mg/ml的浓度加入。加入约1mhcl或其它等同的酸以获得0.01nhcl溶液，并且将所得溶液在室温下混合，例如搅拌约65小时或更多，或者约70小时或更多，或者约72小时。得到的溶液可以冷冻保存或处理，例如通过加入稳定剂(如甘油)来处理。中和后，将am-ecm在37℃下孵育1小时以引起胶凝。水凝胶胶凝时间测试胶凝动力学数据帮助建立注入包埋在水凝胶中的细胞的方案。通过定量溶液与不同浓度的纤维蛋白原和凝血酶组合的浊度变化来确定纤维蛋白胶的胶凝时间。在冰上制备胶原蛋白和羊膜水凝胶。对于每组，将100ml/孔的凝胶加入到96孔板中，一式三份。然后用微孔板读数器以分光光度法在37℃测定材料的浊度，550nm每分钟，测定60分钟，一式三份。水凝胶纳米结构的评价扫描电子显微镜被用来评价支架形态。通过将每孔500ul凝胶灌注到48孔板的孔中制备水凝胶模具，并使其在37℃聚合1小时。接下来将它们在4℃用在二甲胂酸盐缓冲液中的2.5%浓度的戊二醛固定过夜。将下一批凝胶以在蒸馏水中的乙醇浓度系列洗涤以脱水：40%、60%、75%、85%、90%、95%和100%。临界干燥后，使用溅射涂布机(pelcoautosputtercoatersc-7)将凝胶用金属涂布3次，并用扫描电子显微镜(phillipsxl30tmp)成像。体外msc生存能力和增殖测试将胎盘来源的间充质干细胞(pmsc)以1×104个细胞/200ul/孔(96孔非tc-处理的微孔板)的最终浓度加入水凝胶中。凝胶化后，将细胞接种的水凝胶构建体置于37℃的co2培养箱中1天、4天和6天。celltiter96aqueousonesolutioncellproliferationassay被用来评估增殖细胞的相对数量。细胞增殖测定一式三份。水凝胶的生化组成为了分析am-ecm的成分，正在进行一系列的生化分析。中和am-ecm衍生的水凝胶并测定胶原、弹性蛋白和gag蛋白浓度。使用sircol可溶性胶原试验试剂盒(biocolor)测定酸性胃蛋白酶可溶性胶原(i型至v型)的浓度。使用fastin弹性蛋白试验试剂盒(biocolor)定量弹性蛋白。使用blyscan试验试剂盒(biocolor)测量硫酸化蛋白聚糖和糖胺聚糖。这些研究仍在进行中。分泌蛋白的细胞因子阵列分析从培养物上清液中分析血管生成相关的分泌因子。在6孔板每孔中以1×105/1ml水凝胶的密度接种pmsc。在24小时收集培养物上清液，离心去除颗粒，然后根据制造商的说明书(r＆dsystems)使用proteomeprofilertm人血管生成抗体阵列试剂盒评估55个血管生成相关细胞因子的相对水平。还收集来自单层细胞培养物以及来自羊膜凝胶和生长培养基的上清液作为阴性对照。在bio-radchemidocmp上对染色的膜印迹成像，并使用带有dotblot分析插件的imagej软件分析图像。然后使用microsoftexcel绘制从膜图像获得的积分密度值。羊膜水凝胶的相容性申请人还测试了羊膜水凝胶与其他细胞系(包括c2c12成肌细胞、骨髓衍生的msc和sh-sy5y神经母细胞瘤细胞)的相容性。简言之，将细胞与脱细胞羊膜消化物混合以形成接种了细胞的水凝胶构建体，密度为每孔(6孔板)每1ml水凝胶(6mg/ml)1×105个细胞，并置于37℃的co2培养箱中1小时，以在37°c胶凝1小时，然后加入2ml培养基以覆盖水凝胶。将接种了细胞的水凝胶构建体孵育3天。使用市售的live/dead®viability/cytotoxicity试验法(lifetechnologies)进行细胞活力检测。使用carlzeissaxioobserverd1倒置显微镜对染色的构建体成像，并使用imagej软件处理图像。胶凝动力学即使凝血酶浓度非常低(10u/ml)，纤维蛋白凝胶也能在1-2分钟内迅速变成固体(图4)。这使得当需要快速聚合时纤维蛋白凝胶会很有用，例如当将细胞输送到富含流体的隔室中时。温育开始后30分钟内，羊膜水凝胶达到其刚性的90%。增加的浓度在物理凝胶密度中起作用，但不影响胶凝时间。当与胶原蛋白水凝胶相比时，羊膜来源的水凝胶至少提前15分钟聚合。这种现象可归因于在复杂的羊膜支架中存在交联蛋白。pmsc在羊膜水凝胶中的增殖与在胶原水凝胶中一样好或好于在胶原水凝胶中增殖(图5)。浓度较低的水凝胶似乎更好地支持细胞增殖。在第4天，申请人注意到纤维蛋白5mg/ml基质的降解，到第6天，大部分降解，导致无法评估相应的细胞繁殖。20mg/ml浓度的纤维蛋白凝胶保持其大部分体积，但是其大部分在第6天降解。根据人血管生成阵列试剂盒的结果，申请人检测到在水凝胶中的pmsc分泌的27种因子(图6)。一般而言，当在水凝胶中培养时，pmsc共享其细胞因子分泌谱。与单层培养相比，在3d基质支持的培养物中生长的细胞的一些因子上调，包括血管内皮生长因子(vegf)、肝细胞生长因子、血小板生成素-2、血小板因子4、基质金属蛋白酶9和促血管新生蛋白因子(angiopoeitin)。基于纤维蛋白的基质刺激血小板因子4、基质金属蛋白酶9、胰岛素样生长因子结合蛋白2和3、二肽基肽酶4和血管抑制素(angiostatin)的分泌。在羊膜水凝胶中培养的pmsc表达升高水平的胎盘生长因子(plgf)、vegf、催乳素、il-8、fgf-7和双调蛋白(图7)、。羊膜水凝胶的相容性live-dead分析的结果显示，羊膜来源的水凝胶支持各种干细胞类型的存活和扩增，包括c2c12成肌细胞、sh-sy5y神经母细胞瘤细胞、骨髓和pmsc。人们可以观察到很少的红色荧光，表明绝大多数细胞存活并具有完好的膜。所有细胞类型均显示出正常的形态，表明细胞良好粘附在3d基质中。该数据显示am-ecm水凝胶是用于pmsc以及其他干细胞的最佳细胞输送载体。此外，am-ecm是一种容易获得且价格可承受的人来源水凝胶，其支持细胞附着、增殖和分泌，使其成为再生医学应用(如组织和器官工程、伤口愈合和组织修复)的有希望候选物。因此，本文提供了包括使用本文所述的基质的这些治疗性介入。胶凝动力学与胶原水凝胶的相似，使其成为熟悉的替代品。am-ecm也填补了支持2d和3d干细胞培养的生物相容性人源(无异种)ecm矩阵的研究和临床市场上的空白。讨论模拟细胞外基质的生物水凝胶是支持3d细胞培养的新型候选物，可用于研究以及临床应用，如组织工程和干细胞治疗。羊膜脱细胞的胞外基质可通过胃蛋白酶消化而溶解并形成具有与胶原蛋白和纤维蛋白类似的生物物理学特性的水凝胶。在纳米级水平，用3mg/ml的胶原蛋白、5mg/ml的纤维蛋白和4mg/ml的羊膜制备的水凝胶表现出类似的纤维厚度和密度以及孔径。纤维蛋白凝块聚合在水凝胶中是最快的，大约需要2-3分钟。羊膜水凝胶在25分钟内凝固，而胶原凝胶在约45分钟内凝固。在体内应用中需要更快的聚合以限制水凝胶内嵌入的干细胞从应用部位的损失。凝胶聚合速率和机械强度可以用非细胞毒性的交联剂进行进一步操作，如转谷氨酰胺酶和核糖通过非酶糖基化而交联，并且应该在干细胞治疗应用中进一步研究(orban,j.m.etal.(2004)journalofbiomedicalmaterialsresearchparta.68:756-762;roy,r.etal.(2010)journalofbiomedicalmaterialsresearchparta.93:843-851).体外细胞增殖试验揭示了羊膜水凝胶支持pmsc生长的能力。此外，与胶原蛋白和纤维蛋白包埋的细胞相比，包埋在羊膜凝胶中的细胞以显著更高的速率繁殖。由于细胞分泌的细胞因子，纤维蛋白水凝胶迅速降解，不适于持续5天以上的3d细胞培养。蛋白酶抑制剂延长了纤维蛋白的完整性，但由于存在不希望的副作用而可能限制其体内应用。有趣的是，pmsc在纤维密度较低的水凝胶中增殖更快。这可以通过孔隙基质尺寸增加、帮助细胞运动性和改善水凝胶模具的渗透来解释。科学家们都认为，间充质干细胞的许多治疗特性来自于其旁分泌活性(murphy,m.b.etal.(2013)experimental&molecularmedicine45:e54)。细胞因子分泌试验表明，尽管水凝胶包埋的pmsc中的分泌谱大致相似，但是特定细胞因子分泌水平可因细胞外支架而变化。最值得注意的是，干细胞在纤维蛋白和羊膜凝胶中培养时改变了它们的分泌构型。在由血小板释放凝血因子时，利用血纤蛋白开始伤口愈合级联反应(diegelmann,r.f.etal.(2004)frontbiosci.9:283-289)。纤维蛋白凝块在止血、伤口结构支持，细胞粘附和迁移中发挥重要作用(midwood,k.s.etal.(2004)theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology36:1031-1037)。可以预见，在纤维蛋白中培养的msc表达高水平的参与伤口愈合的细胞因子。血小板因子4(也称为趋化因子(cxc基序)配体4)与肝素结合，促进血液凝固，并参与血管发生和炎症(gupta,s.k.etal.(1995)procnatacadsciusa.92:7799-7803)。基质金属蛋白酶9(iv型胶原酶)参与细胞外基质的降解和细胞迁移(vanhinsbergh,v.w.etal.(2008)cardiovascularresearch78:203-212)。胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp)调节胰岛素样生长因子活性，调节细胞周期和凋亡(firth,s.m.etal.(2002)endocrinereviews23:824-854)。在羊膜来源的水凝胶中培养的pmsc表达与血管生成有关的细胞因子，例如胎盘生长因子和催乳素。plgf与vegf一起在血管生成、内皮细胞迁移和增殖中起重要作用(luttun,a.etal.(2002)annalsofthenewyorkacademyofsciences979:80-93;hoeben,a.etal.(2004)pharmacologicalreviews56:549-580)。此外，羊膜包埋的msc分泌更高水平的il-8和fgf-7。il-8在粒细胞趋化性、细胞存活和增殖中起作用(li,a.etal.(2003)journalofimmunology170:3369-3376)。fgf-7(又名角质形成细胞生长因子)是促分裂原并参与神经保护和伤口修复(beer,h.d.etal.(2000)thejournalofinvestigativedermatologysymposiumproceedings5:34-39)。这些数据表明，pmsc可响应环境信号传导而影响血管生成相关的过程，在选择细胞输送载体时应当适当考虑。为了确保干细胞疗法的安全性和有效性，在将msc输送至目标部位时应仔细评估细胞因子分泌谱。申请人的结果支持羊膜来源的水凝胶作为输送pmsc的新候选物。该基质维持细胞附着、增殖和生理学。不像胶原蛋白，它是人体衍生的产品，消除了宿主排斥的担忧。羊膜水凝胶以较低制造成本取代了纤维蛋白，因为它是由容易获得的人体组织生产的。此外，由于细胞分泌的细胞因子的积极消化，纤维蛋白基质不适合长时间的细胞培养。为了进一步研究羊膜水凝胶细胞输送能力，申请人测试了它与几种广泛使用的细胞系的相容性。c2c12用于研究成肌细胞分化，并且能够产生骨骼肌样组织(donnelly,k.etal.(2010)tissueengineeringpartc,methods16:711-718)。sh-sy5y系作为神经元功能和分化的模型，而骨髓来源的间充质干细胞是目前msc相关治疗的黄金标准。所有这些细胞成功地附着在羊膜水凝胶基质上，表现出它们常见的形态并以其正常速率增殖。live-dead试验中检测到的死细胞数量很少(如果有的话)。脱细胞羊膜和am-ecm水凝胶预防腹腔内粘连手术后腹腔粘连是腹部和盆腔手术后的一个重要问题，并且已经注意到出现于高达95%的接受了再手术式(re-operative)腹部或盆腔手术的患者中。在外科手术过程中，腹膜内衬(peritoneallining)和内脏损伤后，粘连仅次于身体正常炎症反应。虽然这是正常的反应，但结果可能导致显著的发病率，包括术后小肠阻塞、慢性腹痛和女性不育(barmparas,g.etal.(2010)journalofgastrointestinalsurgery:officialjournalofthesocietyforsurgeryofthealimentarytract14:1619-1628;practicecommitteeoftheamericansocietyforreproductivemedicineincollaborationwiththesocietyofreproductivesurgeons(2013)fertilityandsterility99:1550-1555;vangoor,h.(2007)colorectaldisease:theofficialjournaloftheassociationofcoloproctologyofgreatbritainandireland9(suppl2):25-34)。此外，腹部粘连的存在使得在骨盆上的再手术对于患者来说更加困难和危险。这些并发症导致手术工作量增大且医院资源利用增加，这转化为显著的经济负担，仅在美国估计每年花费超过20亿美元处理粘连相关问题(sikirica,v.etal.(2011)bmcsurgery11:13)。继发于粘连性疾病的肠梗阻在美国是小肠梗阻的最常见原因。一项针对20,000多名住院再入院的大型调查发现，5.7%的再入院(超过1200名患者)继发于腹部粘连，而3.8%的患者需要再次手术(ellis,h.etal.(1999)lancet353:1476-1480)。术后肠梗阻的发生率随着每个随后的管理粘连的程序而增加。大量的再入院和再手术不仅导致患者并发症的风险增加，而且增加了护理成本，并且显著影响了患者的生活质量。致密的粘连也可导致器官移动性受限，这导致内脏疼痛，进而导致慢性腹部和/或盆腔疼痛(diamond,m.p.etal.(2001)humanreproductionupdate7:567-576)。这又可以导致进一步的手术干预来尝试和减轻粘连负担，但更可能导致大量的患者发病率，而影响生活质量。盆腔粘连可以阻止卵母细胞的正常输送，从而导致不孕。这种并发症约占所有女性不育症病例的10%(practicecommitteeoftheamericansocietyforreproductivemedicineincollaborationwiththesocietyofreproductivesurgeons(2013)fertilityandsterility99:1550-1555)。从手术的角度来看，3%的剖腹手术直接与粘连有关(ellis,h.(1997)theeuropeanjournalofsurgery,actachirurgicasuppl.:5-9)。这些粘连会使再次手术扭曲组织平面和解剖结构变得复杂，但更重要的是使得再次进入腹部更加危险，对小肠、膀胱或输尿管的无意伤害的可能性更高以及失血的风险增加。几家医疗器械公司已经开始研究开发防粘连产品，但成果有限。脱细胞的羊膜和脱细胞am-ecm水凝胶的使用可以在手术领域中提供突破，不仅可以预防手术并发症，还可以提高经历了腹部和/或盆腔手术的患者的生活质量。羊膜是一种独特的膜，已被发现分泌几种生物活性细胞因子和生长因子，其随后储存在羊膜厚厚的基底膜并且随时间分泌。这些生物因子提供了几种天然治疗作用，其对于腹部粘连的患者是有益的，包括：(1)促进上皮化：已发现羊膜分泌表皮生长因子(egf)、角质形成细胞生长因子(kgf)、角质形成细胞生长因子受体(kgfr)、肝细胞生长因子(hgf)和肝细胞生长因子受体(hgfr)，其全部已知促进愈合和上皮形成。这在腹部和骨盆手术期间将有助于腹部和内脏的损伤后愈合，防止在损伤部位形成粘连(koizumi,n.j.etal.(2000)currenteyeresearch20:173-177；(2)纤维化的抑制：羊膜含有间充质透明质酸，其已知抑制转化生长因子β(tgf-β)，后者是已知的促纤维化生长因子。预防纤维化可以限制形成的粘连的数目(sporn,m.b.etal.(1987)thejournalofcellbiology105:1039-1045)；(3)抗炎性质：金属蛋白酶和白细胞介素-1(il-1)是已知的炎症介质。羊膜分泌il-1受体和金属蛋白酶抑制剂，其可减少术后期间受损的腹膜和内脏表面介导的炎症级联反应，最终降低形成粘连的可能性(hao,y.etal.(2000)cornea19:348-352)。羊膜防止纤维化和预防炎症以及帮助上皮化的能力将有利于防止粘连形成和损伤的天然组织的愈合。这些特性已经使得羊膜在眼科领域中用于在角膜损伤、化学烧伤、角膜缺损、眼部手术后以及在角膜炎患者中使用羊膜来保护和修复角膜(rahman,i.etal.(2009)eye(london,england)23:1954-1961;sippel,k.c.etal.(2001)currentopinioninophthalmology12:269-281;malhotra,c.etal.(2014)worldjournaloftransplantation4:111-121)。虽然羊膜已成功用于眼科应用，但羊膜上皮细胞层可引起免疫应答，引起对膜的炎症反应，导致粘连形成。脱细胞化的羊膜可以消除可能附着在细胞成分上的免疫反应，提高对细胞膜的免疫耐受性，使其成为更有效的抗粘连治疗。鉴于羊膜的已知特征，将其与成功的脱细胞方案相结合理论上提供了用于粘附预防的优良产品，并且这形成了使用脱细胞的羊膜和am-ecm水凝胶的原理。体内方法正在腹部粘连的啮齿动物模型中使用脱细胞化的羊膜和脱细胞化的am-ecm水凝胶来防止术后腹部粘连。几个研究小组已经使用这个标准化的模型来研究不同的治疗方法来预防腹部粘连。该模型包括通过在左侧肠旁沟(paracolicgutter)中形成缺血性腹膜按钮(peritonealbutton)并机械地磨损盲肠而手术诱导可重复的粘连(whang,s.h.etal.(2011)thejournalofsurgicalresearch167:245-250)。申请人的方法在约180-250克雌性spraguedawley大鼠上进行。全身麻醉诱导后，创建一个四厘米的中线切口。检查腹部是否存在任何预先存在的粘连。如果腹部没有粘连，则执行粘连创建程序。使用3-0丙烯缝线在左侧肠旁沟中产生四个缺血性腹膜按钮。盲肠周围也被磨损，直到诱导出点状出血。在同一个手术中，应用了申请人的脱细胞产品。(图9)然后封闭大鼠的腹壁，大鼠从麻醉中恢复过来。按照方案进行常规的术后护理，包括日常体重、切口检查和健康检查。在粘连创建和治疗两周后，将大鼠全身麻醉，并通过右侧正中旁陷门(trapdoor)切口进行探查性剖腹术。粘连的数量和质量通过标准化的分级标准进行测量。(whang,s.h.etal.(2011)thejournalofsurgicalresearch167:245-250;lucas,p.a.etal.(1996)thejournalofsurgicalresearch65:135-138)(表iii)。对于粘连的数量，评估每个按钮处是否存在粘连。对于粘连的质量，对粘连的密度和血管进行分级并给予总分。然后累计这两个分数以产生每只动物的总体粘连负荷的综合评分。表iii:粘连分级标准分值粘连数量粘连质量0无粘连无粘连125%按钮具有粘连薄,无血管250%按钮具有粘连中等，有限血管375%按钮具有粘连致密，大量血管4100%按钮具有粘连两只对照组大鼠无任何粘连预防治疗，两只大鼠用脱细胞羊膜膜片治疗，两只大鼠用脱细胞am-ecm水凝胶治疗。在本研究中，使用羊膜和am-ecm水凝胶作为防止粘连的治疗显得不仅降低了粘连的数量，而且降低了粘连的质量(图10，表iv)。组织学分析正在进行中。表iv:啮齿动物粘连试点研究研究#治疗粘连数量粘连质量大鼠001无43大鼠002无44大鼠003脱细胞am22大鼠004脱细胞am13大鼠005am-ecm水凝胶32大鼠006am-ecm水凝胶00这些研究显示用脱细胞羊膜和am-ecm水凝胶处理的动物与对照动物相比粘连负担降低。如图2b所示，羊膜的应用可以被优化，以便腹膜内衬的受损表面可被膜完全覆盖。优化之后，需要进行额外的羊膜膜片和am-ecm水凝胶的体内研究，以确定所提出的粘连减少的改善是否是显著的发现，并确定脱细胞产物的体内可生物降解能力。实施例2目前的msc疗法临床疗效有限。例如，它们表现出在输送后较差的细胞存活，以及在移植后有限的整合。此外，在全身性输送后，许多干细胞陷入肺和毛细血管。由于msc是贴壁依赖细胞，已知它们会由于缺乏正确的细胞/ecm附着而诱导失巢凋亡或细胞凋亡。因此，细胞与细胞接触以进行附着是必要的，所以需要生物相容的输送载体来维持细胞活力和整合。鉴于本领域的上述限制，期望得到生物相容且可生物降解的胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、基质胶组合物。如本文所述的组合物提供了物理特性的灵活性并且可以支持细胞粘附，并且可以提供与天然组织结构相似的细胞外基质。目前的水凝胶组合物受到几个限制。例如，许多来源于非人类来源，例如小鼠或牛，因此可以诱导不希望的宿主免疫应答。它们制造成本昂贵，而且通常供应有限。相反，本文的水凝胶组合物可以通过酶促降解组织来生产并且会保持细胞粘附性质。它们也可用于细胞培养，因为它们具有相容的生理特性。在一个方面，本文提供了生物相容性的人羊膜来源的水凝胶。它是由废弃的足月胎盘制备的。实施例3体内细胞浸润和促炎症(m1)巨噬细胞募集组织学和免疫荧光检查将羊膜水凝胶和胶原水凝胶以10mg/ml的浓度通过皮下注射植入spraguedawley大鼠背部(每只大鼠背部左侧注射2ml羊膜水凝胶，在背部右侧注射2ml胶原水凝胶)。14天后，处死大鼠，收集残余水凝胶和邻近组织。将样品固定在10%福尔马林中，在去离子水中洗涤并在30%蔗糖中脱水，然后包埋在o.c.t化合物(tissuetek®)中，并使用低温恒温器以20μm厚度切片。用苏木精-伊红(h＆e)染色法检测羊膜水凝胶和胶原水凝胶的残余体积和细胞浸润情况。为了鉴定浸润细胞类型，使用促炎性巨噬细胞(m1表型)标记物ccr7(epitomics)。将切片与pbs中的10%(w/v)牛血清白蛋白孵育60分钟以抑制igg的非特异性结合。然后，将切片与兔抗大鼠ccr7抗体温育2小时，并用荧光标记的二抗检测。将切片用dapi复染5分钟以识别细胞核。用carlzeissaxioobserverd1倒置显微镜观察所有切片。使用imagej软件来量化组织切片中的ccr7+细胞。结果h＆e染色检查显示残余水凝胶(两个黄色假想线之间的区域，图11a)比胶原蛋白更厚(图11b)，羊膜水凝胶中(图11c)细胞浸润(黑色箭头)比在胶原水凝胶中(图11d)的少。免疫荧光检查显示，羊膜水凝胶和胶原水凝胶中的浸润细胞为ccr7阳性(图11e-11f)。羊膜水凝胶中ccr7+细胞的密度(图11e)低于胶原水凝胶(图11f)，并且它们之间存在显著差异(p<0.01)(图11g)。这表明羊膜水凝胶比胶原水凝胶降低了体内的炎症反应。等价物本文中说明性描述的公开内容可适当地在缺乏本文没有具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广义地理解而没有限制。另外，这里使用的术语和表达已经被用作描述性的术语而不是限制性的，并且不希望使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或者其部分的任何等同物，但是要认识到在要求保护的公开的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解的是，尽管本公开已经通过优选实施例和可选特征被具体公开，但是本领域技术人员可对本文公开的实施例进行修改、改进和变化，并且这样的修改、改进和变化被认为是在本公开的范围内。这里提供的材料、方法和示例是优选实施例的代表，是示例性的，并且不旨在限制本公开的范围。本文已经广泛地和一般性地描述了公开内容。属于一般公开内容的每个较窄种类和亚属群组也构成本公开的一部分。这包括从本公开的一般性描述中移除任何主题的附带条件或负面限制，无论在本文中是否具体列举了所排除的材料。另外，在根据马库什组描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域的技术人员将认识到，本公开内容也由此根据马库什组的任何成员或亚组成员进行描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均明确地通过引用整体并入，如同每个都单独通过引用并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。参考文献ballios,b.g.etal.(2010).ahydrogelbasedstemcelldeliverysystemtotreatretinaldegenerativediseases.biomaterials,31(9),2555-2564.beer,h.d.etal.(2000).expressionandfunctionofkeratinocytegrowthfactorandactivininskinmorphogenesisandcutaneouswoundrepair.jinvestigdermatolsympproc,5(1),34-39.doi:10.1046/j.1087-0024.2000.00009.xbollini,s.etal.(2013).theregenerativeroleofthefetalandadultstemcellsecretome.journalofclinicalmedicine,2(4),302-327.caplan,a.i.&dennis,j.e.(2006).mesenchymalstemcellsastrophicmediators.jcellbiochem,98(5),1076-1084.doi:10.1002/jcb.20886catelas,i.etal.(2006).humanmesenchymalstemcellproliferationandosteogenicdifferentiationinfibringelsinvitro.tissueeng,12(8),2385-2396.clark,r.a.etal.(2007).tissueengineeringforcutaneouswounds.jinvestdermatol,127(5),1018-1029.doi:10.1038/sj.jid.5700715davis,h.e.etal.(2013).enhancingosteoconductivityoffibringelswithapatite-coatedpolymermicrospheres.tissueengparta,19(15-16),1773-1782.doi:10.1089/ten.tea.2012.0288dequach,j.a.etal.(2010).simpleandhighyieldingmethodforpreparingtissuespecificextracellularmatrixcoatingsforcellculture.plosone,5(9).doi:10.1371/journal.pone.0013039diegelmann,r.f.&evans,m.c.(2004).woundhealing:anoverviewofacute,fibroticanddelayedhealing.frontbiosci,9(1),283-289.dominici,m.etal.(2006).minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.theinternationalsocietyforcellulartherapypositionstatement.cytotherapy,8(4),315-317.doi:10.1080/14653240600855905donnelly,k.etal.(2010).anovelbioreactorforstimulatingskeletalmuscleinvitro.tissueengpartcmethods,16(4),711-718.doi:10.1089/ten.tec.2009.0125elgharably,h.etal.(2013).amodifiedcollagengelenhanceshealingoutcomeinapreclinicalswinemodelofexcisionalwounds.woundrepairandregeneration,21(3),473-481.firth,s.m.&baxter,r.c.(2002).cellularactionsoftheinsulin-likegrowthfactorbindingproteins.endocrrev,23(6),824-854.doi:10.1210/er.2001-0033gupta,s.k.etal.(1995).apotentinhibitorofendothelialcellproliferationisgeneratedbyproteolyticcleavageofthechemokineplateletfactor4.procnatlacadsciusa,92(17),7799-7803.hoeben,a.etal.(2004).vascularendothelialgrowthfactorandangiogenesis.pharmacolrev,56(4),549-580.doi:10.1124/pr.56.4.3huang,n.f.etal.(2013).themodulationofendothelialcellmorphology,function,andsurvivalusinganisotropicnanofibrillarcollagenscaffolds.biomaterials,34(16),4038-4047.doi:10.1016/j.biomaterials.2013.02.036huh,d.etal.(2011).from3dcellculturetoorgans-onchips.trendsincellbiology,21(12),745-754.karp,j.m.&teo,g.s.l.(2009).mesenchymalstemcellhoming:thedevilisinthedetails.cellstemcell,4(3),206-216.kim,i.etal.(2013).fibringlueimprovesthetherapeuticeffectofmscsbysustainingsurvivalandparacrinefunction.tissueengineeringparta,19(21-22),2373-2381.li,a.etal.(2003).il-8directlyenhancedendothelialcellsurvival,proliferation,andmatrixmetalloproteinasesproductionandregulatedangiogenesis.jimmunol,170(6),3369-3376.luttun,a.etal.(2002).placentalgrowthfactor(plgf)anditsreceptorflt-1(vegfr-1):noveltherapeutictargetsforangiogenicdisorders.annnyacadsci,979,80-93.malek,a.&bersinger,n.a.(2011).humanplacentalstemcells:biomedicalpotentialandclinicalrelevance.jstemcells,6(2),75-92.man,d.etal.(2001).theuseofautologousplateletrichplasma(plateletgel)andautologousplatelet-poorplasma(fibringlue)incosmeticsurgery.plasticandreconstructivesurgery,107(1),229-237;discussion238-229.manuelpillai,u.etal.(2011).amnioticmembraneandamnioticcells:potentialtherapeutictoolstocombattissueinflammationandfibrosisplacenta,32suppl4,s320-325.doi:10.1016/j.placenta.2011.04.010meierhenry,j.etal.(2015).placentaasasourceofstemcellsforregenerativemedicine.currentpathobiologyreports,3(1),9-16.doi:10.1007/s40139-015-0070-6midwood,k.s.etal.(2004).tissuerepairandthedynamicsoftheextracellularmatrix.theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology,36(6),1031-1037.doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.biocel.2003.12.003murphy,m.b.etal.(2013).mesenchymalstemcells:environmentallyresponsivetherapeuticsforregenerativemedicine.expmolmed,45,e54.doi:10.1038/emm.2013.94orban,j.m.etal.(2004).crosslinkingofcollagengelsbytransglutaminase.jbiomedmaterresa,68(4),756-762.doi:10.1002/jbm.a.20110phinney,d.g.&prockop,d.j.(2007).concisereview:mesenchymalstem/multipotentstromalcells:thestateoftransdifferentiationandmodesoftissuerepair--currentviews.stemcells,25(11),2896-2902.doi:10.1634/stemcells.2007-0637roy,r.etal.(2010).processingoftypeicollagengelsusingnonenzymaticglycation.jbiomedmaterresa,93(3),843-851.doi:10.1002/jbm.a.32231slaughter,b.v.etal.(2009).hydrogelsinregenerativemedicine.advancedmaterials,21(32‐33),3307-3329.vanhinsbergh,v.w.&koolwijk,p.(2008).endothelialsproutingandangiogenesis:matrixmetalloproteinasesinthelead.cardiovascres,78(2),203-212.doi:10.1093/cvr/cvm102wolf,m.t.etal.(2012).ahydrogelderivedfromdecellularizeddermalextracellularmatrix.biomaterials,33(29),7028-7038.doi:10.1016/j.biomaterials.2012.06.051.当前第1页12