相关申请的交叉引用本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2015年4月30日提交的美国临时申请62/155,296号的优先权，其所有内容通过引用并入本文中。序列表本申请包含序列表，其已经以ascii格式电子提交，并且其全文通过引用并入本文中。所述ascii副本创建于2016年4月29日，命名为064189-7181_sl.txt，大小为42,860字节。本发明总体上涉及人免疫学领域，具体涉及癌症免疫疗法。
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：：本发明的
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：的以下描述仅用于辅助本领域技术人员理解本发明。申请人的研究团队已经研发了独特的癌症成像方法以及利用坏死细胞作为单克隆抗体(mab)的选择性结合的靶标的疗法。(epstein,a.l.etal.(1988)cancerres.48:5842-5848；chen,f.m.etal.(1991)jnatlcancerinst.83:200-204；epstein,a.l.etal.(1991)antibody,immunoconj&radiopharm.4:151-161；miller,g.k.etal.(1993)hybridoma12:689-698；hornick,j.l.etal.(1998)cancerbiother&radiopharm13:255-268)。肿瘤坏死疗法(tumornecrosistherapy,tnt)代表了与使用mab来结合至肿瘤相关的细胞表面抗原的其他方法彻底不同的方法。相反，tntmab识别在正常或肿瘤细胞死亡或受到损害(例如通过缺氧、坏死、细胞凋亡或细胞毒性试剂和/或过程)时由细胞鬼影显示并保留的细胞内抗原。因此，tntmab定位于恶性肿瘤中，这是由于在正常组织中不存在可渗透的退化细胞。技术实现要素：本发明的一些方面涉及一种嵌合抗原受体(car)，其包括：(a)tnt抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内结构域，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。本发明的进一步的方面涉及一种嵌合抗原受体(car)，其包括：(a)tnt抗体的抗原结合结构域；(b)cd8α铰链结构域；(c)cd8α跨膜结构域；(d)cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域；以及(e)cd3ζ信号传导结构域，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述tnt抗体的抗原结合结构域包括tnt重链可变区域和tnt轻链可变区域，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述tnt重链可变区域包括含有seqidno:1-3、9-11、17-19、25-27中的任一个或其每一个的等效物的cdr区域，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述tnt重链可变区域包括由seqidno:7、15、23、31中的任一个或其每一个的等效物编码的氨基酸序列，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述tnt轻链可变区域包括cdr区域，该cdr区域含有seqidno:4-6、12-14、28-30中的任一个或其每一个的等效物，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述tnt轻链可变区域包括由seqidno:8、16、24、32中的任一个或其每一个的等效物编码的氨基酸序列，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述car进一步包括位于tnt重链可变区域和tnt轻链可变区域之间的接头多肽，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在进一步的实施方式中，所述接头多肽包括序列(甘氨酸-丝氨酸)n，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，其中n是1至6的整数(seqidno:66)。在一些实施方式中，所述car进一步包括连接至car的可检测标记物和/或纯化标记物，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。本发明的其他方面涉及一种分离的核酸序列，其编码如上所述的car、或其补体、或其每一个的等效物。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列进一步包括位于编码所述tnt抗体的抗原结合结构域的多核苷酸的上游的kozak共有序列，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些方面，所述分离的核酸进一步包括编码可操作地结合至所述分离的核酸的抗生素抗性多肽的多核苷酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。本发明的一些方面涉及一种载体，其包括上述分离的核酸中的一种或多种。在一些实施方式中，所述载体是质粒或病毒载体，其选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。所述分离的核酸和包含它们的载体可用于制备如本文所述的car。本文的进一步的方面涉及一种分离的细胞，其包括上述组分中的一种或多种：tntcar、编码car或其补体的分离的核酸、或含有所述分离的核酸的载体，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述分离的细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌)或真核细胞。在一些实施方式中，分离的真核细胞选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠科细胞、马科细胞或人细胞。在进一步的实施方式中，所述分离的细胞是来自如本文公开的任何物种的t细胞、b细胞、或nk细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞进一步包括一种分离的核酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，所述分离的核酸包括可操作地连接至编码免疫调节分子的多核苷酸的nfat调节性多核苷酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。分离的细胞的非限制性例子是原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌)或真核细胞。在一些实施方式中，分离的真核细胞选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠科细胞、马科细胞或人细胞。在进一步的实施方式中，所述分离的细胞是来自如本文公开的任何物种的t细胞、b细胞、或nk细胞。在一些实施方式中，所述分离的核酸进一步包括编码抗生素抗性基因的多核苷酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述免疫调节分子是选自以下的一种或多种分子：b7.1、ccl19、ccl21、cd40l、cd137l、gitrl、gm-csf、il-12、il-2、低毒性il-2、il-15、il-18、il-21、lec和ox40l。本发明的一些方面涉及一种组合物，其包括上述组分中的一种或多种，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，所述组分例如是car、分离的核酸、细胞、或载体和递体。在一些实施方式中，所述组合物进一步包括免疫调节分子和/或包括可操作地连接至编码免疫调节分子的多核苷酸的nfat调节性多核苷酸的分离的核酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述免疫调节分子是选自以下的一种或多种分子：b7.1、ccl19、ccl21、cd40l、cd137l、gitrl、gm-csf、il-12、il-2、低毒性il-2、il-15、il-18、il-21、lec和ox40l。本发明的一些方面涉及一种分离的复合物，其包括car或含有结合至tnt相关抗原或其片段的car的细胞、和/或表达tnt相关抗原的细胞。在一个方面，所述抗原结合结构域在细胞的表面上表达。在另一个方面，所述tnt相关抗原在肿瘤(例如肿瘤的坏死组织)中表达。肿瘤的非限制性例子是实体肿瘤。实体肿瘤的非限制性例子是包含结肠癌细胞的肿瘤。本文公开了其他实体肿瘤。在一个方面，含有或表达上述tntcar的细胞是nk细胞、b细胞、或t细胞。所述肿瘤或细胞可以来自任何动物，例如哺乳动物，例如人类细胞。本发明的一些方面涉及一种生产表达tntcar的细胞的方法，所述方法包括以下步骤、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：使用编码如本文所述的car的核酸序列转导分离的细胞。在进一步的方面，所述方法进一步包括选择和分离表达car的细胞。在进一步的方面，所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人类细胞，例如nk细胞、b细胞、或t细胞。可以使用如本文描述的病毒载体或替代地使用在rietetal.(2013)meth.mol.biol.969:187-201标题为“nonviralrnatransfectiontotransientlymodifytcellwithchimericantigenreceptorsforadoptivetherapy”中描述的技术，转导所述细胞。在一些实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：使用分离的核酸转导细胞，所述分离的核酸包括可操作地连接至编码免疫调节分子的多核苷酸的nfat调节性多核苷酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。可以使用如本文描述的病毒载体或替代地使用在rietetal.(2013)meth.mol.biol.969:187-201标题为“nonviralrnatransfectiontotransientlymodifytcellwithchimericantigenreceptorsforadoptivetherapy”中描述的技术，转导所述细胞。在一些实施方式中，所述免疫调节分子是选自以下的一种或多种：b7.1、ccl19、ccl21、cd40l、cd137l、gitrl、gm-csf、il-12、il-2、低毒性il-2、il-15、il-18、il-21、lec和ox40l。在一些实施方式中，生产表达tntcar细胞的所述方法进一步包括以下步骤、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：激活并扩增表达tntcar的细胞的群体。本发明的一些方面涉及一种分离的、激活的细胞群体，其包括tntcar、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。一些实施方式中，所述细胞是nk细胞、b细胞、或t细胞中的一种或多种。本发明的一些方面涉及一种抑制表达tnt相关抗原的肿瘤的生长的方法，该方法通过将所述肿瘤与有效量的上述所述分离的细胞或组合物接触。所述接触可以是体外或体内的。当所述接触是体外时，所述方法可以被用来测试针对患者的肿瘤的个性化的疗法或者测试联合疗法。当所述接触时体内时，所述方法可用于在有需要的对象中抑制肿瘤的生长，例如患有癌症的人类患者，并且所述患者接受有效量的所述细胞。在一些实施方式中，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方式中，被靶定的所述癌症/肿瘤是影响血液和/或骨髓的实体肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述分离的细胞对于被治疗的所述对象来说是自体同源的。在另一个方面，所述方法进一步包括以下步骤、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：向所述对象施用有效量的细胞减灭(cytoreductive)疗法。在进一步的方面，所述方法进一步包括以下步骤：分离要被施用至所述对象的细胞，使用有效量的编码本文所述的car的分离的核酸转导所述细胞，培养所述细胞以获得编码car的细胞的群体，所述细胞被任选地扩增和激活并且然后将所述细胞施用至所述患者。本文还公开了试剂盒，其包括上述组合物中的一种或多种、以及在本文公开的方法中使用它们的说明。附图说明图1的示意图示出了cart细胞形成的方法，其中t细胞突触被抗体单链构建体替换以绕过hla依赖性t细胞活化。公开的接头序列为seqidno:67。图2a-2d示出了结合至肿瘤的坏死区域的tnt抗体的特征。图2a示出了h&e染色的人类肿瘤，其具有所有肿瘤典型的活的索(cord)、新坏死区域和旧坏死。在图2b-2d中示出了tnt结合至小鼠和人类的肿瘤的能力。图2b示出了放射性标记的tnt抗体在balb/c小鼠的皮下结肠26肿瘤中的摄取。图2c示出了放射性标记的chtnt-3在患者的肺中的免疫闪烁照相图像，该患者患有由右肺和左肺野中的小肿瘤结节组成的支气管肺泡癌。图2d示出了注射有i-131放射性标记的chtnt-3的患有顶部后部肺癌肿块的患者的免疫闪烁照相图像。随着时间的推移拍摄的图像显示血池的初始成像，其随时间强度降低，同时肿瘤的图像保持超过十天，表明对肿瘤的特异性。此外，该患者在左下腹部区域具有化脓性炎症病灶，其没有成像，这是因为发现pmn具有高度异染色核，这隐藏了tnt抗原，从而防止了tnt抗体的结合。膀胱显示代谢的i-131放射性标记的积累，其在排空后被消除。图3a-3b示出了证明放射性标记的tnt抗体结合至肿瘤的坏死区域的放射自显影研究。图3a是异种移植在裸鼠中的人me-180宫颈肿瘤的h&e染色切片。轻微染色的区域是坏死的，更黑的染色区域是活的肿瘤。图3b示出了通过宏观放射自显影染色的连续切片。黑色染色的区域显示48小时之前施用的放射性标记的抗体的沉积。在该研究中，看出抗体只染色坏死区域。红色箭头显示结合至坏死区域的抗体的例子，而黄色箭头标记未由抗体标记的活性区域。图4示出了在colon26鼠肿瘤模型中lec诱导的免疫细胞浸润。在这些研究中，在肿瘤植入之后的第7-11天用单独的chtnt-3(对照)或lec/chtnt-3处理带有肿瘤的小鼠，并在3天后处死。上部三个面板取自对照处理的小鼠，而下部三个面板取自lec/chtnt-3处理的小鼠。与对照相比，被靶定的lec产生大量pmn和树突细胞的浸润，产生有效的免疫应答，显示在右下面板中，其中在新产生的坏死区周围观察到淋巴样浸润并伴随着肿瘤血管纤维化和凝血。图5示出了lec/chtnt-3的趋化活性。在趋化室中使用thp-1人单核细胞白血病细胞，以确定lec/chtnt-3、游离lec和chtnt-3(阴性对照)的生物活性。图6a-6b示出了可诱导的il-12和lec基因的示意图。图7示出了可诱导的双顺反子il-12和lec基因的示意图。图8a-8b示出了(在图8a中)nfat蛋白质结合基序和可诱导的nfat基因(seqidno:57).tss、转录起始位点和(在图8b中)可诱导的双顺反子il-12和lec基因的示意图。图9示出了用含有可诱导的nfat-zsgreen1基因的慢病毒转导nk-92mi细胞。zsgreen1是由clontech实验室(mountainview,ca)开发的修饰的gfp。转导的细胞在完全rpmi中培养2周，然后用50fmolrmil-12刺激。刺激16小时后，评估细胞的zsgreen1表达。图10示出了jurkat细胞的流式细胞术结果，所述jurkat细胞用单独含有可诱导的nfat-zsgreen1基因的慢病毒或另外含有cd19car的慢病毒进行转导。以1:1car-靶细胞的比率，使用靶标cd19+raji细胞将car-nfat细胞孵育过夜。孵育16小时之后，通过流式细胞术评估细胞的诱导的zsgreen1表达。图11示出了使用单独含有tnt-car的慢病毒、或者另外含有可诱导的nfat-lec或nfat-il12基因的慢病毒，所转导的jurkat细胞的诱导的il-12分泌。在24孔板上，在涂覆有单链小牛胸腺dna(sigma-aldrich,st.louis,mo)或涂覆有pma(10ng/ml)和伊屋诺霉素(500ng/ml)的孔中，以在500μl完全rpmi中2x105个细胞孵育转导的细胞。刺激16小时之后，收获细胞上清液，并通过elisa测定scmil-12。scmil-12，单链鼠il-12。详细描述应该理解的是，本发明不被限制至所述特定的方面，因为这些方面当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的方面，并且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅仅被附加的权利要求限制。除非另有定义，否则此处所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的任何方法和材料类似或等价的方法和材料可被用于实践或测试本技术，但现在要描述的是目前优选的方法、装置和材料。此处引用的所有技术和专利出版物均通过引用纳入本文中。本文的任何部分不应被解释为承认本技术不早于这些公开内容。除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术，这是在本领域的技术之内的。参见例如sambrookandrusselleds.(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition；theseriesausubeletal.eds.(2007)currentprotocolsinmolecularbiology；theseriesmethodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.)；macphersonetal.(1991)pcr1:apracticalapproach(irlpressatoxforduniversitypress)；macphersonetal.(1995)pcr2:apracticalapproach；harlowandlaneeds.(1999)antibodies,alaboratorymanual；freshney(2005)cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,5thedition；gaited.(1984)oligonucleotidesynthesis；u.s.patentno.4,683,195；hamesandhigginseds.(1984)nucleicacidhybridization；anderson(1999)nucleicacidhybridization；hamesandhigginseds.(1984)transcriptionandtranslation；immobilizedcellsandenzymes(irlpress(1986))；perbal(1984)apracticalguidetomolecularcloning；millerandcaloseds.(1987)genetransfervectorsformammaliancells(coldspringharborlaboratory)；makridesed.(2003)genetransferandexpressioninmammaliancells；mayerandwalkereds.(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(academicpress,london)；以及herzenbergetal.eds(1996)weir’shandbookofexperimentalimmunology。所有数值(包括范围值)，例如ph、温度、时间、浓度和分子量，都是近似值，适当时可上(+)下(-)浮动1.0或0.1，或浮动+/-15％、或10％、或5％、或2％。要理解的是，虽然不会总是明确表述，但所有数值前都有术语“约”。还要理解的是，虽然不会总是明确表述，但本文所述的试剂仅仅是示例性的，这些试剂的等效物在本领域是已知的。不需明确指出，除非另有说明，否则推定当本发明涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，它们的等效物或生物等效物也预期在本发明的范围内。定义如在本文和在权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、以及“所述”包括复数指代，除非文中另外明确规定。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。如本文所用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在此被可交换地使用，表示人类和兽医对象，例如人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马和牛。在一些实施方式中，所述对象是人类。如本文使用的，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于iga、igd、ige、igg和igm及其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物(例如人类、山羊、兔和鼠)以及非哺乳动物物种(例如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有具体说明，否则术语“抗体”包括特异性地结合至感兴趣的分子(或感兴趣的高度相似的分子的群组)至实质性排除结合至其他分子的完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”(例如，在生物样品中与对其他分子的结合常数相比，对感兴趣的分子的结合常数大至少103m-1、至少104m-1或至少105m-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括遗传工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。还请参见piercecatalogandhandbook,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,ill.)；kuby,j.,immunology,3rded.,w.h.freeman&co.,newyork,1997。如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指，通过b淋巴细胞的单一克隆制造的抗体，或者通过其中已经转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞制造的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法制造的，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合而制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(h)链和轻(l)链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型(或同种型)：igm、igd、igg、iga和ige。每个重链和轻链都包括恒定区域和可变区域(所述区域也被称为“结构域”)。结合起来，重链和轻链可变区域特异性地结合抗原。重链和轻链可变区域包括被三个高度可变区域打断的“框架”区域，所述高度可变区域也被称为“互补决定区域”或“cdr”。框架区域和cdr的范围已经被确定(参见kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991，其以引用的方式合并入本文中)。kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区域的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区域，即组成的轻链和重链的结合的框架区域，主要采用β折叠构象，而cdr形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区域作用来形成支架，其用来通过互链、非共价相互作用将cdr定位在正确的朝向中。cdr主要负责结合至抗原的表位。每个链的cdr通常被称为cdr1、cdr2和cdr3，这是从n末端开始依次进行编号，并且也通常由该特定的cdr所位于的链而确定(重链区域标记为cdhr而轻链区域标记为cdlr)。因此，cdhr3是来自位于发现其的抗体的重链的可变结构域的cdr3，而cdlr1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的cdr1。tnt抗体将具有对tnt相关抗原独特的特异性的vh区域和vl区域序列，并因此具有特异性的cdr序列。具有不同的特异性(即对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的cdr。虽然抗体与抗体之间不同的是cdr，但是在cdr之内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。在cdr之内的这些位置被称为特异性决定残基(sdr)。如本文使用的，术语“抗原”是指可以被特异性的体液或细胞免疫的产品(例如抗体分子或t细胞受体)特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子(例如复合碳水化合物(例如多糖))、磷脂和蛋白质。常见的抗原的类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病的抗原、过敏和移植物排斥、毒素和其他杂项抗原。如本文使用的，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽结构域。如本文使用的，当被用来描述抗体时，术语“tnt”是指识别肿瘤坏死疗法(tumornecrosistherapy，tnt)相关抗原或其功能性等效物的抗体。“肿瘤坏死疗法(tnt)相关抗原”是这样的抗原，其中整个抗原、表位或其片段被即将死亡的细胞保留并且整个抗原、表位或片段通常不会被暴露，而是细胞死亡后暴露。这样的tnt相关抗原的非限制性的例子是通常仅在细胞死亡之后才可进入的dna或dna/组蛋白靶点；例如，tnt-1结合至组蛋白h1的一部分。其他组蛋白靶点包括但不限于h2a、h2b、h3、h4、h5和/或其他人类或动物组蛋白。其他tnt相关抗原包括但不限于单链dna和异染色dna。tnt抗体包括但不限于tnt-1、tnt-2、tnt-3和nhs76；其cdr在下文列出或者在如在美国专利号8,795,672、美国专利号8,545,838中描述的现有技术中已知。如本文使用的，术语tnt-1是指含有具有这样的cdr的氨基酸序列的抗体，该cdr与以下公开的cdr的任一个、优选cdr3区域的至少一个、最优选两个cdr3区域具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。tnt-1cdhr1,seqidno:1:gfsltdygtnt-1cdhr2,seqidno:2:iwgggsttnt-1cdhr3,seqidno:3:akekrrgyyyamdytnt-1cdlr1,seqidno:4:ssvsssytnt-1cdlr2,seqidno:5:ststnt-1cdlr3,seqidno:6:qqysgyplttnt-1重链可变区域序列，seqidno:7:caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctcagggttctcattaaccgactatggtgtaaggtggattcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtggtggaagcacatactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatgtactactgtgccaaagagaaacggagggggtattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcatnt-1轻链可变区域序列，seqidno:8:ggagaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagtcaggtgcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacagtggttacccactcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。如本文使用的，术语tnt-2是指含有具有这样的cdr的氨基酸序列的抗体，该cdr与以下公开的cdr的任一个、优选cdr3区域的至少一个、最优选两个cdr3区域具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。tnt-2cdhr1,seqidno:9:gysftgyytnt-2cdhr2,seqidno:10:inpyngattnt-2cdhr3,seqidno:11:arldrgdytnt-2cdlr1,seqidno:12:envvtytnt-2cdlr2,seqidno:13:gastnt-2cdlr3,seqidno:14:gqgysypyttnt-2重链可变区域序列，seqidno:15:gaggtacagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctactacatgcactgggtgaagcaaagccatgtaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgctactagctacaaccagaatttcaaggacaaggccagcttgactgtagataagtcctccagcacagcctacatggagctccacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagactagaccggggggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcatnt-2轻链可变区域序列，seqidno:16:aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgacctgcaaggccagtgagaatgtggttacttatgtttcctggtatcaacagaaaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagggttacagctatccgtacacgttcggaggggggacaaagttggaaataaaacgtacg。如本文使用的，术语tnt-3是指含有具有这样cdr的氨基酸序列的抗体，该cdr与以下公开的cdr的任一个、优选cdr3区域的至少一个、最优选两个cdr3区域具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。tnt-3cdhr1,seqidno:17:gytftrywtnt-3cdhr2,seqidno:18:iypgnsdttnt-3cdhr3,seqidno:19:argeeigvrrwfaytnt-3cdlr1,seqidno:20:qsisnytnt-3cdlr2,seqidno:21:yastnt-3cdlr3,seqidno:22:qqsnswplttnt-3重链可变区域序列，seqidno:23:caggtccaactgcagcagtcaggagctgaactggtcaagactggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagatactggatgcactgggtaaaacagaggcctggacaggctctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatactagctactaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatctgccagcactgcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagaggggaggaaataggggtacgacgctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcatnt-3轻链可变区域序列，seqidno:24:gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtcagtctttcctgcagggccaggcaaagtattagcaactacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctggcatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtaacagctggccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaa。如本文使用的，术语nhs76是指含有具有这样cdr的氨基酸序列的抗体，该cdr与以下以及在美国专利号6,827,925中公开的cdr的任一个、优选cdr3区域的至少一个、最优选两个cdr3区域具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。nhs76cdhr1,seqidno:25:sgyywgnhs76cdhr2,seqidno:26:siyhsgstyynpslksnhs76cdhr3,seqidno:27:gkwskfdynhs76cdlr1,seqidno:28:qgdslrsyyasnhs76cdlr2,seqidno:29:gknnrpsnhs76cdlr3,seqidno:30:nsrdssgnhvvnhs76重链可变区域序列，seqidno:31:caggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctctggttactccatcagcagtggttactactggggctggattcggcagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctatcatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcagacacggccgtgtattactgtgcaagagggaagtggtcgaagtttgactattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcttcanhs76轻链可变区域序列，seqidno:32:tcctctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggattccagaccgattctctggctccagctcaggaaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccatgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta。如本文使用的，术语“自体同源的(autologous)”在涉及细胞时是指，被分离并且被灌注回相同的对象(受体或宿主)的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。如本文使用的，术语“b细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。b细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后开发记忆b细胞。b细胞与其他淋巴细胞(例如t细胞)的不同点在于细胞表面上存在b细胞受体。b细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的b细胞系的非限制性例子包括ahh-1(crl-8146tm)、bc-1(crl-2230tm)、bc-2(crl-2231tm)、bc-3(crl-2277tm)、ca46(crl-1648tm)、dg-75[d.g.-75](crl-2625tm)、ds-1(crl-11102tm)、eb-3[eb3](ccl-85tm)、z-138(atcc#crl-3001)、db(atcccrl-2289)、toledo(atcccrl-2631)、pfiffer(atcccrl-2632)、sr(atcccrl-2262)、jm-1(atcccrl-10421)、nfs-5c-1(atcccrl-1693)；nfs-70c10(atcccrl-1694)、nfs-25c-3(atcccrl-1695)、和sup-b15(atcccrl-1929)细胞系。进一步的例子包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如del、dl-40、fe-pd、jb6,karpas299、ki-jk、mac-2aply1、sr-786、su-dhl-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、dohh-2、nu-dhl-1、u-937、granda519、usc-dhl-1、rl；霍奇金淋巴瘤，例如dev、hd-70、hdlm-2、hd-myz、hkb-1、km-h2、l428、l540、l1236、sbh-1、sup-hd1、su/rh-hd-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection)或称atcc(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)(https://www.dsmz.de/)。如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”(car)是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(car)”有时被称为“嵌合受体”、“t-体(t-body)”或“嵌合免疫受体(cir)”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”是指能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”或“细胞内信号传导结构域”是指已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。在一些实施方式中，除了主信号传导结构域之外，细胞内结构域可以包括一个或多个共刺激信号传导结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。“跨膜结构域”是指已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链(hinge)结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。本文提供了其非限制性的例子，例如：铰链结构域：igg1重链铰链序列，seqidno:59:ctcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccg跨膜结构域：cd28跨膜区域，seqidno:60:ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg细胞内结构域：4-1bb共刺激信号传导区域，seqidno:61:aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg细胞内结构域：cd28共刺激信号传导区域，seqidno:62:aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc细胞内结构域：cd3ζ信号传导区域，seqidno:63:agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。如本文使用的，术语“cd8α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd8α铰链结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在pinto,r.d.etal.(2006)vet.immunol.immunopathol.110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的cd8α铰链结构域的示例性序列。在pinto,r.d.etal.(2006)vet.immunol.immunopathol.110:169-177中提供了与cd8α铰链结构域相关的序列。其非限制性的例子包括：人类cd8α铰链结构域，seq.idno:33:pakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiy小鼠cd8α铰链结构域，seq.idno:34:kvnstttkpvlrtpspvhptgtsqpqrpedcrprgsvkgtgldfacdiy猫cd8α铰链结构域，seq.idno:35:pvkptttpaprpptqapittsqrvslrpgtcqpsagstveasgldlscdiy。如本文使用的，术语“cd8α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd8α跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类t细胞表面糖蛋白cd8α链的183至203位氨基酸(genbank登录号：np_001759.3)、或者小鼠t细胞表面糖蛋白cd8α链的197至217位氨基酸(genbank登录号：np_001074579.1)、以及大鼠t细胞表面糖蛋白cd8α链的190至210位氨基酸(genbank登录号：np_113726.1)相关的片段序列，提供了cd8α跨膜结构域的其他的示例性序列。与列出的登录号的每一个相关的序列提供如下：人类cd8α跨膜结构域，seq.idno:36:iyiwaplagtcgvlllslvit小鼠cd8α跨膜结构域，seq.idno:37:iwaplagicvalllsliitli大鼠cd8α跨膜结构域，seq.idno:38:iwaplagicavlllslvitli。如本文使用的，术语“cd28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd28跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与genbank登录号xm_006712862.2和xm_009444056.1相关的片段序列，提供了cd28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。与列出的登录号的每一个相关的序列提供如下：由seqidno:60编码的序列。如本文使用的，术语“4-1bb共刺激信号传导区域(signalingregion)”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的4-1bb共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号20130266551a1(以美国申请号13/826,258提交)中提供了4-1bb共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，例如以下提供的示例性序列：4-1bb共刺激信号传导区域，seqidno:39:krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。如本文使用的，术语“cd28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；geiger,t.l.etal.,blood98:2364-2371(2001)；hombach,a.etal.,jimmunol167:6123-6131(2001)；maher,j.etal.natbiotechnol20:70-75(2002)；haynes,n.m.etal.,jimmunol169:5780-5786(2002)；haynes,n.m.etal.,blood100:3155-3163(2002)中提供了示例性的cd28共刺激信号传导区域。非限制性的例子包括以下cd28序列的114-220残基：mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seqidno:40)；及其等效物。如本文使用的，术语“icos共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的icos共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141a1中提供了icos共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下。icos共刺激信号传导区域，seqidno:64:acaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagccaaaaaatccagactcacagatgtgacccta。如本文使用的，术语“ox40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的ox40共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552a1中公开了ox40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，其包括以下提供的示例性序列。ox40共刺激信号传导区域，seqidno:65:agggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatc。如本文使用的，术语“cd3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd3ζ信号传导结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国申请号us13/826,258中提供了cd3ζ信号传导结构域的非限制性的示例性序列，例如：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:41)。“组合物”通常是指活性剂(例如化合物或组合物)和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的，例如可检测试剂或标签，或者是活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地包括1-99.99％。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白(例如人血清白蛋白(hsa)、重组人白蛋白(rha))、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在位于本技术的范围之内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。如本文使用的，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)中排除微量污染物。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。如本文使用的，术语“共有序列(consensussequence)”是指这样的氨基酸或核苷酸序列，其通过对齐一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在所述多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该系列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。如本文使用的，“细胞减灭疗法(cytoreductivetherapy)”包括但不限于化学疗法、冷冻疗法(cryotherapy)和放射疗法。起作用以减少细胞增殖的试剂是本领域已知的并被广泛使用。仅在分裂时才杀死癌细胞的化学疗法药物被称为细胞周期特异性的。这些药物包括作用于s期的药物，包括拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶i和ii)的作用的药物。在化疗过程期间，拓扑异构酶控制复制所必需的dna结构的操纵，因此是细胞周期特异性的。拓扑异构酶i抑制剂的例子包括上面列出的喜树碱类似物、伊立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan)。拓扑异构酶ii抑制剂的例子包括安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷和替尼泊苷(teniposide)。抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，通常干扰涉及染色体复制的过程。它们在周期的特定阶段攻击细胞。抗代谢物包括叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨(capecitabine)和吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉屈滨(cladribine)、氟达拉滨(fludarabine)、奈拉滨(nelarabine)和喷他汀(pentostatin)；等等。植物生物碱来源于某些类型的植物。长春花生物碱由长春花植物(catharanthusrosea)制成。紫杉烷由太平洋紫杉树(taxus)的树皮制成。长春花生物碱和紫杉烷也被称为抗微管剂。鬼臼毒素来源于5月份的苹果植物。喜树碱类似物来源于亚洲的“快乐树”(camptothecaacuminata)。鬼臼毒素和喜树碱类似物也被分类为拓扑异构酶抑制剂。植物生物碱通常是细胞周期特异性的。这些试剂的例子包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；鬼臼毒素，例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(tenisopide)；和喜树碱类似物，例如伊立替康和托泊替康。冷冻治疗包括但不限于涉及降低温度的治疗，例如低温治疗。辐射疗法包括但不限于暴露至辐射，例如如本领域已知的电离辐射、uv辐射。示例性的剂量包括但不限于至少约2gy至不多于约10gy范围的电离辐射的剂量，和/或至少约5j/m2至不多于约50j/m2、通常约10j/m2范围的紫外线辐射的剂量。如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接制造可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光制造可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团(例如荧光剂、发光染料)、带有通过电子显微镜或通过其电性质(例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗)检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法(例如原子力谱、隧道效应)、或放射性分子(例如32p、35s或125i)。“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mrna。反义链是这样的核酸的补体，并且编码序列可以由此导出。如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能(例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，即全长序列的活性)，则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”表示抗体如通过elisa或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效的抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。如本文使用的，在指示蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70％同源性或同一性、或至少80％同源性或同一性和替代地、或至少约85％、或替代地至少约90％、或替代地至少约95％、或替代地98％百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当指示多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其补体(complement)杂交的多核苷酸。多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基(或氨基酸)在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.1987)supplement30,section7.7.18,table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是blast，使用默认参数。特别地，优选的程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序＝highscore；数据库＝不重复的，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mrna的过程和/或被转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组dna，则表达可以包括mrna在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mrna或蛋白的量确定基因的表达水平。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域(例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60％同一性、优选地至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被对齐的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.1987)supplement30,section7.7.18,table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是blast，使用默认参数。特别地，优选的程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序＝highscore；数据库＝不重复的，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代基的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40％的同一性、或者替代地少于25％的同一性。“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过watson-crick碱基配对、hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如pcr过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。严格杂交条件的例子包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6xssc至约10xssc的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4xssc至约8xssc的洗涤溶液。中度杂交条件的例子包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9xssc至约2xssc的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5xssc至约2xssc的洗涤溶液。高严格杂交条件的例子包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc至约0.1xssc的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。ssc是0.15mnacl和15mm柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的ssc的等效物。如本文使用的，术语“免疫调节分子”可以指可以调节或直接影响免疫反应的任何分子，其包括但不限于趋化因子，例如ccl2、ccl5、ccl14、ccl19、ccl20、cxcl8、cxcl13和lec；淋巴因子和细胞因子，例如白细胞介素(例如il-2、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21等)、干扰素α、β和γ、刺激细胞生长的因子(例如gm-csf)、和其他因子(例如肿瘤坏死因子、dc-sign、mip1α、mip1β、tgf-β或tnf)；为t细胞活化提供共刺激信号的因子，例如b7分子和cd40；辅助分子，例如cd83；参与抗原加工和呈递的蛋白质，例如tap1/tap2转运蛋白，蛋白体分子，例如lmp2和lmp7，热休克蛋白，例如gp96、hsp70和hsp90、以及mhc或hla分子；以及其生物等效物。本文公开了免疫调节分子的非限制性的例子。如本文使用的，术语“b7.1”(也被称为b7；bb1；b7-1；cd80；lab7；cd28lg；cd28lg1)是指与该名称相关的特定的分子，以及与b7.1具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了b7.1序列的例子。此外，与genbank登录号nm_005191.3和np_005182.1相关的序列是示例性的。非限制性的例子包括np_005182.1,seqidno:42:mghtrrqgtspskcpylnffqllvlaglshfcsgvihvtkevkevatlscghnvsveelaqtriywqkekkmvltmmsgdmniwpeyknrtifditnnlsivilalrpsdegtyecvvlkyekdafkrehlaevtlsvkadfptpsisdfeiptsnirriicstsggfpephlswlengeelnainttvsqdpetelyavsskldfnmttnhsfmclikyghlrvnqtfnwnttkqehfpdnllpswaitlisvngifviccltycfaprcrerrrnerlrresvrpv。在一些实施方式中，b7.1作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“ccl19”(也被称为elc；ckb11；mip3b；mip-3b；scya19)是指与该名称相关的特定的分子，以及与ccl19具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了ccl19序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000009.11nc_018920.2nt_008413.19、np_006265.1相关的序列是示例性的。非限制性的例子包括np_006265.1,seqidno:43:malllalsllvlwtspaptlsgtndaedcclsvtqkpipgyivrnfhyllikdgcrvpavvfttlrgrqlcappdqpwveriiqrlqrtsakmkrrss。在一些实施方式中，ccl19作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“ccl20”(也被称为ckb4；larc；st38；mip3a；exodus；mip-3a；scya20；mip-3-α)是指与该名称相关的特定的分子，以及与ccl20具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了ccl20序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000002.11nc_018913.2nt_005403.18、np_001123518.1、和np_004582.1相关的序列是示例性的。例子包括np_004582.1,seqidno:44:mcctkslllaalmsvlllhlcgeseaasnfdcclgytdrilhpkfivgftrqlanegcdinaiifhtkkklsvcanpkqtwvkyivrllskkvknm以及np_001123518.1,seqidno:45:mcctkslllaalmsvlllhlcgeseasnfdcclgytdrilhpkfivgftrqlanegcdinaiifhtkkklsvcanpkqtwvkyivrllskkvknm。在一些实施方式中，ccl20作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见网页地址linscottsdirectory.com，在2015年4月9日最后一次登入)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“cd40l”(也被称为igm；imd3；trap；gp39；cd154；cd40lg；higm1；t-bam；tnfsf5；hcd40l)是指与该名称相关的特定的分子，以及与cd40l具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了cd40l序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000023.10、nc_018934.2、nt_011786.17、np_000065.1相关的序列是示例性的。非限制性的例子包括np_000065.1,seqidno:46:mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhrrldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdimlnkeetkkensfemqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl。在一些实施方式中，cd40l作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见网页地址linscottsdirectory.com，在2015年4月9日最后一次登入)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“cd137l”(也被称为tnfsf9；4-1bb-l)是指与该名称相关的特定的分子，以及与cd137l具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了cd137l序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000019.9、nt_011295.12、nc_018930.2和np_003802.1相关的序列是示例性的。非限制性的例子包括np_003802.1,seqidno:47:meyasdasldpeapwppapraracrvlpwalvaglllllllaaacavflacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse。在一些实施方式中，cd137l作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见网页地址linscottsdirectory.com，在2015年4月9日最后一次登入)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“gitrl”(也被称为tnfsf18；tl6；aitrl；hgitrl)是指与该名称相关的特定的分子，以及与gitrl具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了gitrl序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000001.10、nc_018912.2、nt_004487.20、和np_005083.2相关的序列是示例性的。非限制性的例子包括np_005083.2,seqidno:48:mtlhpspitceflfstalispkmclshlenmplshsrtqgaqrsswklwlfcsivmllflcsfswlififlqletakepcmakfgplpskwqmasseppcvnkvsdwkleilqnglyliygqvapnanyndvapfevrlyknkdmiqtltnkskiqnvggtyelhvgdtidlifnsehqvlknntywgiillanpqfis。在一些实施方式中，gitrl作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见网页地址linscottsdirectory.com，在2015年4月9日最后一次登入)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“gm-csf”(也被称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；csf2)是指与该名称相关的特定的分子，以及与gm-csf具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了gm-csf序列的例子。此外，与genbank登录号p04141-csf2_human相关的蛋白序列：mwlqsllllgtvacsisaparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqe(seqidno:49)。在一些实施方式中，gm-csf作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(http://www.linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“il-12”(也被称为白细胞介素12)是指与该名称相关的特定的分子，以及与il-12具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了il-12序列的例子，并且其包括但不限于成熟形式的il-12及其变体和片段，例如单链il-12、il-12a(genbank登录号nc_000003.11nt_005612.17nc_018914.2)、以及il-12b(genbank登录号nc_000005.9nc_018916.2nt_023133.14)。与在美国专利号8,556,882中公开的序列相关的蛋白序列是示例性的，例如由seqidno:50编码的单链il-12。在一些实施方式中，il-12作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(http://www.linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“il-2”(也被称为白细胞介素2)是指与该名称相关的特定的分子，以及与il-2具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。非限制性的例子是seqidno:51，其提供了天然人类il-2的全长序列：aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt。术语“低毒性il-2”是指il-2的修改版本，其表现出类似的生物功能但是在施用至对象时毒性更低。在一些实施方式中，与野生型il-2相比，低毒性il-2包括血管透性降低的突变。美国专利号7,371,371公开了在人类il-2的氨基酸22至58位之间的野生型il-2的增强渗透性的区域中的示例性突变。非限制性的例子包括在人类序列中的38位处的r至w的突变。美国专利号7,371,371进一步公开了包含在il-2的增强渗透性的区域之外的一个或多个位置的突变的低毒性il-2。如本文使用的，术语“il-15”(也被称为白细胞介素15)是指与该名称相关的特定的分子，以及与il-15具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了il-15序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000004.11、nc_018915.2、nt_016354.20、np_000576.1、np_751915.1相关的蛋白序列是示例性的。由seqidno:52编码的成熟蛋白是非限制性的例子。在一些实施方式中，il-15作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见如上所述的linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“il-18”(也被称为“白细胞介素18”、igif、“白介素1γ”、il1f4、ifn-γ-诱导因子、il-1g)是指与该名称相关的特定的分子，以及与il-18具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了il-18序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000011.9、nc_018922.2、nt_033899.9、np_001230140.1、np_001553.1相关的蛋白序列是示例性的。由seqidno:53编码的成熟蛋白是非限制性的例子。在一些实施方式中，il-18作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见如上所述的linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“il-21”(也被称为“白细胞介素21”；za11；cvid11)是指与该名称相关的特定的分子，以及与il-21具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了il-21序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000004.11、nc_018915.2、nt_016354.20相关的蛋白序列是示例性的。由seqidno:54编码的成熟蛋白是非限制性的例子。在一些实施方式中，il-21作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见如上所述的linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“lec”(也被称为ccl16；lmc；ncc4；ckb12；hcc-4；lcc-1；mtn-1；ncc-4；scyl4；ilinck；scya16)是指与该名称相关的特定的分子，以及与lec具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了lec序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000017.10、nt_010783.16、nt_187614.1、nc_018928.2、np_004581.1相关的蛋白序列是示例性的。非限制性的例子包括np_004581.1,seqidno:55:mkvseaalsllvliliitsasrsqpkvpewvntpstcclkyyekvlprrlvvgyrkalnchlpaiifvtkrnrevctnpnddwvqeyikdpnlpllptrnlstvkiitakngqpqllnsq。在一些实施方式中，lec作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见如上所述的linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“ox40l”(也被称为tnfsf4；gp34；cd252；txgp1；cd134l；ox-40l)是指与该名称相关的特定的分子，以及与ox40l具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了ox40l序列的例子。此外，与genbank登录号nc_000001.10、nt_004487.20、nc_018912.2、np_003317.1相关的蛋白序列是示例性的。非限制性的例子包括np_003317.1,seqidno:56:mervqpleenvgnaarprfernklllvasviqglglllcftyiclhfsalqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl。在一些实施方式中，ox40l作为组合物的一部分而施用，它可以是合成的或者购自任何可用的商业来源。这样的来源包括santacruzbiosciences、origene、以及纯化蛋白及其修改版本的其他卖家。可以在linscott’sdirectoryofimmunological&biologicalreagents(参见如上所述的linscottsdirectory.com)上找到商业来源的列表。如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指，核酸(例如dna或rna)或蛋白或多肽(例如抗体或其衍生物)或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他dna或rna、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基(当通过重组dna技术生产时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(hsc)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞)和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。如本文使用的，术语“接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包括可以被重复1至10、或替代地至约8、或替代地至约6、或替代地约5、或4或替代地3、或替代地2次的1至10个、或替代地8个氨基酸、或替代地6个氨基酸、或替代地5个氨基酸。例如，接头可以包括由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一个方面，接头序列是包括gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:68)的三个拷贝的(glycine4serine)3柔性多肽接头(seqidno:67)。“与肿瘤组织类型对应的正常细胞”是指来自与肿瘤组织相同的组织类型的正常细胞。非限制性例子是来自患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或者来自患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。如本文使用的，术语“nfat调节性多核苷酸”是指与与转录因子的活化的t细胞的核因子(“nfat”)家族相互作用的多核苷酸。nfat是指在大多数免疫细胞中表达并且在t细胞中的基因转录的激活中起到重要作用的钙调磷酸酶依赖的转录因子的集合(fric,j.etal.(2012)blood120(7):1380-1389)。特别地，nfat在免疫反应期间控制大量基因的转录，最显着的是il-2、il-4、tnf-α和ifn-γ(fric,j.etal.(2012)blood120(7):1380-1389；rao,a.etal.(1997)annurevimmunol.15:707-747；hogan,p.g.etal.(2003)genesdev.17(18):2205-2232)。与nfat相互作用的多核苷酸的一个例子是：ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg(seqidno:57)及其等效物。如本文使用的，术语“t细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。t细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如b细胞)的不同点在于细胞表面上存在t细胞受体。t细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“t细胞”包括表达cd3的所有类型的免疫细胞，包括t辅助细胞(cd4+细胞)、细胞毒性t细胞(cd8+细胞)、自然杀伤t细胞、t调节细胞(treg)和γ-δt细胞。“细胞毒性细胞”包括cd8+t细胞、自然杀伤(nk)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的t细胞系的非限制性例子包括bcl2(aaa)jurkat(crl-2902tm)、bcl2(s70a)jurkat(crl-2900tm)、bcl2(s87a)jurkat(crl-2901tm)、bcl2jurkat(crl-2899tm)、neojurkat(crl-2898tm)、tall-104细胞毒性人类t细胞系(atcc#crl-11386)细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的t细胞系，例如deglis、ebt-8、hpb-mlp-w、hut78、hut102、karpas384、ki225、my-la、se-ax、skw-3、smz-1和t34；以及未成熟的t细胞系，例如all-sil、be13、ccrf-cem、cml-t1、dnd-41、du.528、eu-9、hd-mar、hpb-all、h-sb2、ht-1、jk-t1、jurkat、karpas45、ke-37、kopt-k1、k-t1、l-kaw、loucy、mat、molt-1、molt3、molt-4、molt13、molt-16、mt-1、mt-all、p12/ichikawa、peer、per0117、per-255、pf-382、pfi-285、rpmi-8402、st-4、sup-t1至t14、tall-1、tall-101、tall-103/2、tall-104、tall-105、tall-106、tall-107、tall-197、tk-6、tlbr-1、-2、-3和-4、ccrf-hsb-2(ccl-120.1)、j.rt3-t3.5(atcctib-153)、j45.01(atcccrl-1990)、j.cam1.6(atcccrl-2063)、rs4；11(atcccrl-1873)、ccrf-cem(atcccrm-ccl-119)；以及皮肤t细胞淋巴瘤细胞系，例如hut78(atcccrm-tib-161)、mj[g11](atcccrl-8294)、hut102(atcctib-162)。无白血病(nullleukemia)细胞系，包括但不限于reh、nall-1、km-3、l92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如k562红白血病、thp-1单核细胞白血病、u937淋巴瘤、hel红白血病、hl60白血病、hmc-1白血病、kg-1白血病、u266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection)或称atcc(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)(https://www.dsmz.de/)。如本文使用的，术语“nk细胞”(也被称为自然杀伤细胞)是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。nk细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。nk细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的nk细胞系的非限制性例子包括nk-92(crl-2407tm)、nk-92mi(crl-2408tm)细胞系。进一步的例子包括但不限于hank1、khyg-1、nkl、nk-ys、noi-90和ytnk细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection)或称atcc(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)(https://www.dsmz.de/)。如本文关于调节性多核苷酸所用的，术语“可操作地连接”是指在调节性多核苷酸和其连接的多核苷酸序列之间的关系，使得当特定的蛋白结合至所述调节性多核苷酸时，被连接的多核苷酸被转录。如本文使用的，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中生产的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以进行已知或未知的任何作用。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、rnai、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的dna、分离的任何序列的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以被施加在多核苷酸的组装之前或之前。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分偶联。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、dna基因组、cdna、dna-rna杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，在此控制转录的起始和速率。它可以包括遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如rna聚合酶和其他转录因子。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且以其最广泛的意义来指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一个方面，所述子单元可以通过其他键(例如酯键、醚键等)而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d和l光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本发明中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80％的存在于制剂中的所有大分子物种。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90％、通常大于95％的存在于纯化制剂中的所有大分子物种。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术而被检测到。如本发明使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括his、lacz、gst、麦芽糖结合蛋白、nusa、bccp、c-myc、cam、flag、gfp、yfp、樱桃、硫氧还蛋白、聚(nanp)、v5，snap、ha、几丁质结合蛋白、softag1、softag3、strep或s蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括flag、gfp、yfp、rfp、dtomato、樱桃、cy3、cy5、cy5.5、cy7、dnp、amca、生物素、地高辛、tamra、得克萨斯红、罗丹明、alexa荧光、fitc、tritc或任何其他荧光染料或半抗原。如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组dna技术制造的多肽，其中通常编码该多肽的dna被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体和抗原之间的接触具有的结合亲和力为至少10-6m。在一些方面，抗体结合具有的亲和力为至少约10-7m，并且优选10-8m、10-9m、10-10m、10-11m或10-12m。实体肿瘤”是通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织块。实体瘤可以是良性或恶性的、转移性的或非转移性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的例子包括肉瘤、癌和淋巴瘤。术语“转导”在其被应用至生产嵌合抗原受体细胞时是指，外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方式中，该转导是通过载体完成的。如本文使用的，“治疗”在对象中的疾病是指(1)防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症(包括疾病)的程度的降低，病症(包括疾病)的稳定化(即不恶化)状态，病症(包括疾病)的延迟或减缓，病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。包含所公开的组合物和方法的治疗可以是一线、二线、三线、四线、五线疗法，并且可以旨在被用作单独的疗法或者与其他合适的疗法联合使用。如本文使用的，术语“载体(vector)”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、bac、yac等。在一些实施方式中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方式中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、aav等制造病毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。如本文使用的，术语“wpre”或“土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件”是指与该名称相关的特定的核苷酸片段，以及与本文所示的wpre序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。例如，wpre是指在土拨鼠肝炎病毒基因组序列(genbank登录号j04514)中出现的类似于人类乙型肝炎病毒转录后调控元件(hbvpre)的区域，并且该基因组序列的1093位至1684位的592个核苷酸对应于转录后调控区域(journalofvirology,vol.72,p.5085-5092,1998)。使用逆转录病毒载体的分析显示，被插入至感兴趣的基因的3'末端未翻译区域的wpre提高了产生的蛋白的量5至8倍。还被报道的是，wpre的引入抑制了mrna降解(journalofvirology,vol.73,p.2886-2892,1999)。在广义上，例如wpre的通过使mrna稳定而提高氨基酸翻译的效率的元件也被认为是增强子。与以上列出的genbank登录号和参考文献中的每一个相关的序列通过引用合并入本文中。缩写列表car：嵌合抗原受体hla：组织相容性淋巴细胞抗原il：白细胞介素ip：腹膜内ires：内部核糖体进入位点lec：肝脏表达的趋化因子mfi：平均荧光强度moi：感染复数pbmc：外周血单核细胞pbs：磷酸盐缓冲盐水scfv：单链可变片段tnt：肿瘤坏死疗法wpre：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。用于实施本发明的方式一直在寻求免疫调节分子的施用作为癌症治疗剂。但是，由于与全身给药相关的严重副作用(giovarelli,m.etal.(2000)jimmunol.164:3200-3206；lasek,w.etal.(2014)cancerimmunolimmunother.63:419-435)，在相关的肿瘤中获得高浓度的这些免疫调节分子以实现有效的免疫反应是困难的。由于最近在b细胞淋巴瘤和白血病中利用基因工程嵌合抗原受体(car)t细胞进行自体治疗而获得了前所未有的结果(maude,s.l.etal.(2014)newengl.j.med.371:1507-1517；porter,d.l.etal.(2011)newengl.j.med.365:725-733)，许多实验室已经开始将这种方法应用于实体肿瘤，包括卵巢癌、前列腺癌和胰腺肿瘤。car修饰的t细胞将单克隆抗体的hla非依赖性靶向特异性与活化的t细胞的细胞毒活性、增殖性及归巢特性相结合，但对检查站抑制不响应。由于其直接杀死抗原表达靶点的能力，cart细胞对任何抗原阳性细胞或组织都具有很高的毒性，因此有必要利用高度肿瘤特异性的抗体来构建car。到目前为止，已构建出了应用至人体实体肿瘤靶向α-叶酸受体、间皮素和muc-cd、psma及其他靶标的car修饰的t细胞，但大多数在正常组织中具有偏离靶标的抗原表达。这些构建体在患者中没有显示出同样的超常结果，所以需要进行更多的研究，以确定可用于抗实体肿瘤的cart细胞构建体的新靶点和方法。因此，本发明提供一种嵌合抗原受体(car)，其包含对tnt相关抗原特异的结合域(在某些情况下是tnt抗体的抗原结合域)，及其应用和生产相关的方法和组合物。嵌合抗原受体及其用途i.组合物本发明提供结合至tnt相关抗原的嵌合抗原受体(car)，其包含细胞激活部分、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，该细胞激活部分包含细胞外、跨膜和细胞内结构域。细胞外结构域包含靶标特异性结合元件(或称抗原结合域)。细胞内结构域或细胞质结构域包含共刺激信号传导区域和ζ链部分。所述car可任选地进一步包含多达300个氨基酸、优选地10至100个氨基酸、更优选地25至50个氨基酸的隔离结构域。抗原结合结构域。在一些方面，本发明提供了一种car，其包括对tnt相关抗原特异的抗原结合结构域、或基本上由该抗原结合结构域组成、或由该抗原结合结构域组成。tnt是肿瘤坏死疗法的缩写。“肿瘤坏死疗法(tnt)相关抗原”是这样的抗原，其中整个抗原、表位或其片段被即将死亡的细胞保留并且整个抗原、表位或片段通常不会被暴露，而是细胞死亡后暴露。这样的tnt相关抗原的非限制性的例子是通常仅在细胞死亡之后才可进入的dna或dna/组蛋白靶点；例如，tnt-1结合至组蛋白h1的一部分。同样是组蛋白靶标的其他tnt相关抗原包括但不限于h2a、h2b、h3、h4、h5和/或其他人类或动物组蛋白。其他tnt相关抗原包括但不限于单链dna和异染色dna。所述抗原结合结构域可以包括tnt-1、tnt-2、tnt-3或nhs76，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括tnt抗体或结合tnt相关抗原的抗体的抗原结合结构域，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。特异性地结合这些抗原的单克隆抗体是商业上可获得的，参见例如网页地址biocompare.com/pfu/110447/soids/123510/antibodies/tnt(在2015年4月10日最后一次登入)。在一个方面，所述抗原结合结构域包括tnt抗体的重链可变区域和轻链可变区域。在非限制性的实施方式中，tnt抗体的重链可变区域和轻链可变区域包括tnt抗体的抗原结合结构域，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，重链可变区域包括cdrh1序列，所述cdrh1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)gfsltdyg(seqidno:1)、(ii)gysftgyy(seqidno:9)、(iii)gytftryw(seqidno:17)、(iv)sgyywg(seqidno:25)、或其每个的等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在一些实施方式中，重链可变区域包括cdrh2序列，所述cdrh2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)iwgggst(seqidno:2)、(ii)inpyngat(seqidno:10)、(iii)iypgnsdt(seqidno:18)、(iv)siyhsgstyynpslks(seqidno:26)、或其每个的等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在一些实施方式中，重链可变区域包括cdrh3序列，所述cdrh3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)akekrrgyyyamdy(seqidno:3)、(ii)arldrgdy(seqidno:11)、(iii)argeeigvrrwfay(seqidno:19)、(iv)gkwskfdy(seqidno:27)、或其每个的等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在一些实施方式中，重链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctcagggttctcattaaccgactatggtgtaaggtggattcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtggtggaagcacatactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatgtactactgtgccaaagagaaacggagggggtattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seqidno:7)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，重链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：gaggtacagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctactacatgcactgggtgaagcaaagccatgtaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgctactagctacaaccagaatttcaaggacaaggccagcttgactgtagataagtcctccagcacagcctacatggagctccacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagactagaccggggggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seqidno:15)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，重链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：caggtccaactgcagcagtcaggagctgaactggtcaagactggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagatactggatgcactgggtaaaacagaggcctggacaggctctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatactagctactaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatctgccagcactgcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagaggggaggaaataggggtacgacgctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(seqidno:23)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，重链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：caggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctctggttactccatcagcagtggttactactggggctggattcggcagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctatcatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcagacacggccgtgtattactgtgcaagagggaagtggtcgaagtttgactattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcttca(seqidno:31)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，轻链可变区域包括cdrl1序列，所述cdrl1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)ssvsssy(seqidno:4)、(ii)envvty(seqidno:12)、(iii)qsisny(seqidno:20)、(iv)qgdslrsyyas(seqidno:28)、或其每个的等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在一些实施方式中，轻链可变区域包括cdrl2序列，所述cdrl2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)sts(seqidno:5)、(ii)gas(seqidno:13)、(iii)yas(seqidno:21)、(iv)gknnrps(seqidno:29)、或其每个的等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在一些实施方式中，轻链可变区域包括cdrl3序列，所述cdrl3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)qqysgyplt(seqidno:6)、(ii)gqgysypyt(seqidno:14)、(iii)qqsnswplt(seqidno:22)、(iv)nsrdssgnhvv(seqidno:30)、或其每个的等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在一些实施方式中，轻链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：ggagaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagtcaggtgcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacagtggttacccactcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(seqidno:8)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，轻链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgacctgcaaggccagtgagaatgtggttacttatgtttcctggtatcaacagaaaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagggttacagctatccgtacacgttcggaggggggacaaagttggaaataaaacgtacg(seqidno:16)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，轻链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtcagtctttcctgcagggccaggcaaagtattagcaactacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctggcatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtaacagctggccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaa(seqidno:24)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在一些实施方式中，轻链可变区域包括由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：tcctctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggattccagaccgattctctggctccagctcaggaaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccatgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta(seqidno:32)或其抗原结合片段或其每个的等效物。在发明的另一个方面，tnt抗体的抗原结合结构域包括以下特征中的一个或多个：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的cdr至少80％相同的一个或多个cdr；(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的cdr至少80％相同的一个或多个cdr；(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少80％相同；(d)hc免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少80％相同；以及(e)所述抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。等效物的其他例子包括与由在高度严格条件下与编码所述抗原结合结构域的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的肽或多肽具有至少85％、或替代地至少90％、或替代地至少95％、或替代地至少97％氨基酸同一性的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc、或去离子水的洗涤溶液。示例性的抗原结合结构域可以包括以下肽中的一个或多个，并且在一个方面可以包括针对在表1和表2中分别公开的特定抗原的所提及的hc和lc的全部三个cdr。表1:表2:抗tnt抗体重链可变区域轻链可变区域tnt-1seqidno:7seqidno:8tnt-2seqidno:15seqidno:16tnt-3seqidno:23seqidno:24nhs76seqidno:31seqidno:32在一个方面，本发明提供了抗体的抗原结合结构域，该抗体与选自tnt-1、tnt-2、tnt-3、和nhs76的抗体至少80％、或替代地至少85％、或替代地至少90％、或替代地至少95％、或替代地至少97％相同。等效物的其他例子包括由在高度严格条件下与编码所述抗原结合结构域的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc、或去离子水的洗涤溶液。在本发明提供的抗体的一些方面，hc可变结构域序列包括tnt-1的可变结构域序列，并且lc可变结构域序列包括tnt-1的可变结构域序列。在一个方面，本发明提供了含有tnt-1的cdr的抗体的抗原结合结构域。在一个方面，本发明提供了抗体的抗原结合结构域，其与tnt-1的cdr至少85％、或替代地80％、或替代地85％、或替代地90％、或替代地95％、或替代地97％相同，或者是由在高度严格条件下与编码tnt的cdr的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc、或去离子水的洗涤溶液。在本发明提供的抗体的一些方面，hc可变结构域序列包括tnt-2的可变结构域序列，并且lc可变结构域序列包括tnt-2的可变结构域序列。在一个方面，本发明提供了含有tnt-2的cdr的抗体的抗原结合结构域。在一个方面，本发明提供了抗体的抗原结合结构域，其与tnt-2的cdr至少85％、或替代地80％、或替代地85％、或替代地90％、或替代地95％、或替代地97％相同，或者是由在高度严格条件下与编码tnt-2的cdr的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc、或去离子水的洗涤溶液。在本发明提供的抗体的一些方面，hc可变结构域序列包括tnt-3的可变结构域序列，并且lc可变结构域序列包括tnt-3的可变结构域序列。在一个方面，本发明提供了含有tnt-3的cdr的抗体的抗原结合结构域。在一个方面，本发明提供了抗体的抗原结合结构域，其与tnt-3的cdr至少85％、或替代地80％、或替代地85％、或替代地90％、或替代地95％、或替代地97％相同，或者是由在高度严格条件下与编码tnt-3的cdr的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc、或去离子水的洗涤溶液。在本发明提供的抗体的一些方面，hc可变结构域序列包括nhs76的可变结构域序列，并且lc可变结构域序列包括nhs76的可变结构域序列。在一个方面，本发明提供了含有nhs76的cdr的抗体的抗原结合结构域。在一个方面，本发明提供了抗体的抗原结合结构域，其与nhs76至少80％相同、或者与nhs76的cdr至少85％、或替代地85％、或替代地90％、或替代地95％、或替代地97％相同，或者是由在高度严格条件下与编码nhs76的cdr的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc、或去离子水的洗涤溶液。跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况中，所述结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自cd8、cd28、cd3、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、tcr。替代地所述跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可以形成car的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。细胞质结构域。car的细胞质结构域(胞质域)或细胞内信号传导结构域负责在其中置有car的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞来进行其特异性功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截断的部分，只要该截断的部分足够来转导效应器功能信号。tcr和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在car中使用。具有在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自fcr、tcr、cd3、cds、cd22、cd79a、cd79b、cd66d。因为通过tcr产生的信号单独不足以进行t细胞的完全激活，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于cd27、cd28、4-ibb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、或特异性地与cd83结合的配体也可以被包括在car的细胞质结构域中。在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是t细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：cd8蛋白、cd28蛋白、4-1bb蛋白和cd3-ζ蛋白。在具体的实施方式中，所述car包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：tnt抗体的抗原结合结构域、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域、共刺激信号传导区域、以及cd3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方式中，所述共刺激信号传导区域包括cd28共刺激信号传导区域和4-1bb共刺激信号传导区域中的一个或两个。在一些实施方式中，所述car可以进一步包括可检测的标记物或纯化标记物。在另一个方面，本文描述的car被包含在组合物中，例如用于诊断或治疗的药学上可接受的载体。ii.用于制备tnt抗体的方法用于在本发明中使用的抗体可以购得或者使用本领域已知的并且在本文简单地描述的方法制备。它们的制造和用途是广为人知的并且被公开于例如harlow,e.andlane,d.,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1999。可以使用本领域已知的标准方法来生产抗体。抗体的例子包括(但不限于)单克隆、单链、和抗体的功能性片段。可以在一定范围的宿主(例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类等)内制造抗体。可以通过使用具有免疫原性特性的靶标抗原或其片段或寡肽(例如hla-g的c末端片段或分离的多肽)进行的注射来使它们免疫。根据宿主种类，可以加入和使用各种佐剂，以提高免疫反应。这样的佐剂包括但不限于弗氏(freund's)试剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、以及二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，bcg(卡介苗)和小棒杆菌(corynebacteriumparvum)是特别有用的。本发明还提供了分离的多肽和佐剂。在一些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的tnt抗体的混合物。在一个方面，所述多克隆抗体包括具有不同的cdr的多个类型的tnt抗体的混合物。因此，培养制造不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从得到的培养物纯化的抗体(参见wo2004/061104)。单克隆抗体生产。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术来制备tnt相关抗原的单克隆抗体。这样的技术包括但不限于杂交瘤技术(kohler&milstein,nature256:495-497(1975))；三肿瘤技术；人类b细胞杂交瘤技术(参见例如kozbor,etal.,immunol.today4:72(1983))以及ebv杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见例如cole,etal.,in:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,pp.77-96(1985))。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以使用人类杂交瘤(参见例如cote,etal.,proc.natl.acad.sci.80:2026-2030(1983))或者通过用epsteinbarr病毒体外转染人类b细胞(参见例如cole,etal.,in:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,pp.77-96(1985))来生产。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸的群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的pcr，来扩增抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段(例如可变结构域)的dna。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白(例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白)的dna，用于表达和展示噬菌体或细菌上的融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于hla-g多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代地，可以通过例如使用包括tnt相关抗原的氨基酸序列或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成的分离的多肽，使对象免疫，然后使用常规方法来从所述对象的脾分离杂交瘤，来制备表达tnt单克隆抗体的杂交瘤。参见例如milsteinetal.,(galfreandmilstein,methodsenzymol73:3-46(1981))。使用标准方法来筛选杂交瘤将制造不同特异性(即对不同表位的特异性)和亲和力的单克隆抗体。具有期望的特性(例如tnt相关抗原结合)的选择的单克隆抗体可以(i)被用作通过杂交瘤来表达，(ii)被结合至例如聚乙二醇(peg)的分子以改变其特性，或(iii)可以通过各种方法来分离、序列化和操纵编码所述单克隆抗体的cdna。在一个方面，通过杂交瘤来生产tnt单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的b细胞，其中该转基因非人动物具有包括被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在harlowetal.,antibodies:alaboratorymanualcoldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.,349(1988)；hammerlingetal.,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas,563-681(1981)中教导的技术。噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组dna和噬菌体展示技术来生产本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备tnt抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固体表面或珠粒的抗原，从全部的或组合的抗体文库(例如人类或鼠类)中选择具有期望的结合特性的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括具有fab、fv的fd和m13，或者二硫化稳定化的fv抗体结构域被重组地融合至噬菌体基因iii或基因viii蛋白。此外，方法可以适用于构建fab表达文库(参见例如huse,etal.,science246:1275-1281,1989)，以允许具有tnt相关抗原多肽(例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物)的所需的特异性的单克隆fab片段的快速和有效的识别。可以被用来制造本发明的分离的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括在以下文献中公开的方法：hustonetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85:5879-5883(1988)；chaudharyetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,87:1066-1070(1990)；brinkmanetal.,j.immunol.methods182:41-50(1995)；amesetal.,j.immunol.methods184:177-186(1995)；kettleboroughetal.,eur.j.immunol.24:952-958(1994)；persicetal.,gene187:9-18(1997)；burtonetal.,advancesinimmunology57:191-280(1994)；pct/gb91/01134；wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；wo95/20401；wo96/06213；wo92/01047(medicalresearchcounciletal.)；wo97/08320(morphosys)；wo92/01047(cat/mrc)；wo91/17271(affymax)；以及美国专利号5,698,426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908,5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637,5,780,225,5,658,727和5,733,743。洛宁的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上显示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，编码来自噬菌体的区域的抗体可以被分离并且被用来产生整个抗体(包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段)，并且被表达在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生fab、fab′和f(ab′)2片段的技术，例如在wo92/22324；mullinaxetal.,biotechniques12:864-869(1992)；sawaietal.,ajri34:26-34(1995)；以及betteretal.,science240:1041-1043(1988)中公开的。通常，可以针对合适的抗体来选择被克隆进显示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，从而识别维持了良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如barbasiiietal.,phagedisplay,alaboratorymanual(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2001)。但是，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体(被修饰的t7或lambdazap系统)以用于选择和/或筛选。抗体生产的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或面板，来产生抗体(orlandietal.,pnas86:3833-3837(1989)；winter,g.etal.,nature,349:293-299(1991))。替代地，可以使用用于生产单链抗体的技术。单链抗体(scfv)包括通过接头肽(通常长度为5至25个氨基酸)连接的重链可变区域和轻链可变区域。在scfv中，重链和轻链的可变区域可以衍生自相同的抗体或不同的抗体。可以使用重组技术来合成scfv，例如通过编码该scfv的载体在宿主生物(例如e.coli)中的表达。可以通过以下方法获得编码scfv的dna：使用部分dna作为模板进行扩增，其中该部分dna编码选自编码上述抗体的重链或重链的可变区域的dna和编码其轻链或轻链的可变区域的dna的dna的整个或所需的氨基酸序列，通过使用定义其两个末端的引物对的pcr，并且进一步结合编码多肽接头部分的dna和定义其两个末端的引物对来进行扩增，从而将接头的两个末端分别连接至重链和轻链。可以根据本领域已知的常规方法来获得含有编码scfv的dna的表达载体和由该表达载体转化的宿主。还可以产生抗原结合片段，例如f(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生，而fab片段可以通过减少f(ab′)2片段的二硫键而产生。替代地，可以构建fab表达文库来进行具有期望的特异性的单克隆fab片段的快速和简单的识别(huseetal.,science,256:1275-1281(1989))。抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。要被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将iggch3结构域结合至两个scfv分子、结合至链霉亲和素、引入螺旋-转角-螺旋基序等。本文公开的抗体组合物可以是在这些抗体中的任一个和另一个试剂(免疫偶联物)之间形成的偶联物的形式。在一个方面，本文公开的抗体被偶联至放射性物质。在另一个方面，本文公开的抗体可以被结合至多种分子，例如聚乙二醇(peg)。抗体筛选。可以使用多种免疫测试来进行筛选，以识别具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测试的许多程序在本领域中是已知的。这些免疫测试通常涉及测量在tnt相关抗原、或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用采用对两个非干扰的tnt相关抗原表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测试，但是也可以采用竞争性结合测试(maddoxetal.,j.exp.med.,158:1211-1216(1983))。抗体纯化。可以将本文公开的抗体纯化至同质化。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。仅仅作为例子，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用，分离和纯化抗体。strategiesforproteinpurificationandcharacterization:alaboratorycoursemanual,danielr.marshaketal.eds.,coldspringharborlaboratorypress(1996)；antibodies:alaboratorymanual.edharlowanddavidlane,coldspringharborlaboratory(1988)。色谱法的例子包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液体色谱(例如hplc或fplc)进行色谱。在一个方面，在亲和色谱中可以使用proteina柱或proteing柱。其他示例性的柱包括proteina柱、hyperd、poros、sepharosef.f.(pharmacia)等。iii.分离的核酸和用于制备car的方法本发明的一些方面涉及含有tntcar的分离的细胞和生产这样的细胞的方法。所述细胞是原核细胞或真核细胞。在一个方面，该细胞是t细胞、b细胞、或nk细胞。真核细胞可来源于任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞(如人细胞、猫细胞或狗细胞)。在具体的实施方式中，所述分离的细胞包含外源car、或基本上由外源car组成、或由外源car组成，所述car包含以下部分、或基本上由以下部分组成、或由以下部分组成：tnt抗体的抗原结合结构域、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域、cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域、以及cd3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的细胞是t细胞，例如动物t细胞、哺乳动物t细胞、猫t细胞、犬t细胞或人t细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是nk细胞，例如动物nk细胞、哺乳动物nk细胞、猫nk细胞、犬nk细胞或人nk细胞。在一些实施方式中，公开了生产表达tntcar的细胞的方法，所述方法包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：使用编码tntcar的核酸序列转导分离的细胞群。在进一步的方面，选择已经使用所述核酸序列成功转导的细胞的亚群。在一些实施方式中，所述分离的细胞是t细胞，例如动物t细胞、哺乳动物t细胞、猫t细胞、犬t细胞或人t细胞，从而生产tntcart细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是nk细胞，例如动物nk细胞、哺乳动物nk细胞、猫nk细胞、犬nk细胞或人nk细胞，从而生产tntcarnk细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是b细胞，例如动物b细胞、哺乳动物b细胞、猫b细胞、犬b细胞或人b细胞，从而生产tntcarb细胞。分离的细胞的来源。在本发明的细胞的扩增和遗传修饰之前，可以从对象(例如在涉及自体疗法的实施方式中)或商业培养物中获得细胞。细胞可以获得自对象中的许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于lifetechnologies系统；stemcelltechnologieseasyseptm、roboseptm、rosetteseptm、sepmatetm；miltenyibiotecmacstm细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和分隔试剂盒。可以通过使用在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的珠粒或其他结合试剂，分离免疫细胞的特定的亚群体。例如，macstmcd4+和cd8+microbeads可以被用来分离cd4+和cd8+t细胞。替代地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对于t细胞，bcl2(aaa)jurkatcrl-2902tm)、bcl2(s70a)jurkat(crl-2900tm)、bcl2(s87a)jurkat(crl-2901tm)、bcl2jurkat(crl-2899tm)、neojurkat(crl-2898tm)细胞系；对于b细胞，ahh-1(crl-8146tm)、bc-1(crl-2230tm)、bc-2(crl-2231tm)、bc-3(crl-2277tm)、ca46(crl-1648tm)、dg-75[d.g.-75](crl-2625tm)、ds-1(crl-11102tm)、eb-3[eb3](ccl-85tm)、z-138(atcc#crl-3001)、db(atcccrl-2289)、toledo(atcccrl-2631)、pfiffer(atcccrl-2632)、sr(atcccrl-2262)、jm-1(atcccrl-10421)、nfs-5c-1(atcccrl-1693)；nfs-70c10(atcccrl-1694)、nfs-25c-3(atcccrl-1695)、和sup-b15(atcccrl-1929)细胞系；以及对于nk细胞，nk-92(crl-2407tm)、nk-92mi(crl-2408tm)细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的t细胞系，例如deglis、ebt-8、hpb-mlp-w、hut78、hut102、karpas384、ki225、my-la、se-ax、skw-3、smz-1和t34；非成熟的t细胞系，例如all-sil、be13、ccrf-cem、cml-t1、dnd-41、du.528、eu-9、hd-mar、hpb-all、h-sb2、ht-1、jk-t1、jurkat、karpas45、ke-37、kopt-k1、k-t1、l-kaw、loucy、mat、molt-1、molt3、molt-4、molt13、molt-16、mt-1、mt-all、p12/ichikawa、peer、per0117、per-255、pf-382、pfi-285、rpmi-8402、st-4、sup-t1至t14、tall-1、tall-101、tall-103/2、tall-104、tall-105、tall-106、tall-107、tall-197、tk-6、tlbr-1、-2、-3、和-4、ccrf-hsb-2(ccl-120.1)、j.rt3-t3.5(atcctib-153)、j45.01(atcccrl-1990)、j.cam1.6(atcccrl-2063)、rs4；11(atcccrl-1873)、ccrf-cem(atcccrm-ccl-119)；皮肤t细胞淋巴瘤系，例如hut78(atcccrm-tib-161)、mj[g11](atcccrl-8294)、hut102(atcctib-162)；衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的b细胞系，例如del、dl-40、fe-pd、jb6、karpas299、ki-jk、mac-2aply1、sr-786、su-dhl-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、和-16、dohh-2、nu-dhl-1、u-937、granda519、usc-dhl-1、rl；霍奇金淋巴瘤，例如dev、hd-70、hdlm-2、hd-myz、hkb-1、km-h2、l428、l540、l1236、sbh-1、sup-hd1、和su/rh-hd-l；以及nk细胞系，例如hank1、khyg-1、nkl、nk-ys、noi-90和yt。无白血病(nullleukemia)细胞系，包括但不限于reh、nall-1、km-3、l92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如k562红白血病、thp-1单核细胞白血病、u937淋巴瘤、hel红白血病、hl60白血病、hmc-1白血病、kg-1白血病、u266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection)或称atcc(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)(https://www.dsmz.de/)。nfat连接的多核苷酸的构建。本发明的一些方面涉及一种分离的核酸，其包括可操作地连接至编码免疫调节分子的多核苷酸的nfat调节性多核苷酸。在美国专利号8,556,882中描述了用于制备这样的连接的多核苷酸的技术。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括nfat响应元件，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。nfat响应元件的例子包括但不限于nfat1、nfat2、nfat3、nfat4、和/或其补体或等效物。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括nfat可能结合的一个或多个结合基序/部分，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括相同的结合基序和/或nfat响应元件的一个或多个重复；在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括一个或多个不同的nfat结合基序和/或nfat响应元件。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括1至15个、优选2至10个、更优选3至9个、更优选6个nfat结合基序和/或nfat响应元件，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在具体的实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括相同的nfat结合基序或nfat响应元件的6个重复，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括以下序列、或替代地基本上由以下序列组成、或进一步地由以下序列组成：aggaaaaac(seqidno:58)或其等效物。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括以下序列、或替代地基本上由以下序列组成、或进一步地由以下序列组成：ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg(seqidno:57)或其等效物。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸包括重复6次的seqidno:57、seqidno:58、或其等效物，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，编码免疫调节分子的多核苷酸包括编码所述免疫调节分子的核苷酸序列的序列、其功能性部分或变体，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述分离的核苷酸包括启动子序列，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述启动子序列是对于免疫调节分子的启动子序列。在进一步的实施方式中，所述启动子序列可以是与由编码免疫调节分子的多核苷酸编码的相同的免疫调节分子的启动子序列。在替代的实施方式中，所述启动子序列是不同的免疫调节分子的启动子序列。在一些实施方式中，所述nfat调节性多核苷酸在3’末端被可操作地连接至编码免疫调节分子的多核苷酸。在一些实施方式中，所述启动子序列位于两个多核苷酸之间。在进一步的方面，所述分离的核酸进一步包括可检测的标签或基因，以协助选择诱导的细胞，例如抗生素抗性基因。载体。可以使用载体制备car。本发明的一些方面涉及编码(i)tntcar或(ii)编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸序列以及载体，所述载体包含这些核酸的一个或两个和/或补体和/或其每个的等效物，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码car，该car包含以下组分、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成：tnt抗体的抗原结合结构域、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域、cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域、以及cd3ζ信号传导结构域。在具体的实施方式中，所述分离的核酸序列包括编码以下组分的序列、或基本上由该序列组成、或由该序列组成：(a)tnt抗体的抗原结合结构域、随后的(b)cd8α铰链结构域、(c)cd8α跨膜结构域、随后的(d)cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域、随后的(e)cd3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码car，并且包括位于编码tnt抗体的抗原结合结构域的序列的上游的kozak共有序列、或基本上由该共有序列组成、或由该共有序列组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括免疫调节分子，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的实施方式中，所述免疫调节分子是选自以下的一种或多种分子：b7.1、ccl19、ccl21、cd40l、cd137l、gitrl、gm-csf、il-12、il-2、低毒性il-2、il-15、il-18、il-21、lec和ox40l。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括编码免疫调节分子的多核苷酸序列，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，并且包括可操作地连接至编码可以根据上述方法产生的免疫调节分子的多核苷酸的nfta调节性多核苷酸，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括可检测的标签和/或赋予抗生素抗性的多核苷酸。在一个方面，所述标签或多核苷酸可用来选择已经使用所述分离的核酸成功转导的细胞。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列被包括在载体中。在一些实施方式中，所述载体是质粒。在其他实施方式中，所述载体是病毒载体。其非限制性的例子包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、和腺相关病毒载体。在具体的实施方式中，所述载体是慢病毒载体。以下例子中详细地讨论了示例性的载体的制备和使用所述载体来生产表达car的细胞。总的来说，通常通过将编码car多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体，实现编码car的天然的或合成的核酸的表达。可以使用相似的方法来构建含有编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸序列。所述载体可以适于复制和整合真核生物。用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如sambrooketal.(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。在一个方面，术语“载体”是指这样的重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些方面，所述载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒(hiv)、马传染性贫血病毒(eiav)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)和猫免疫缺陷病毒(fiv)。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒(mlv)。很明显，根据本发明的病毒载体不必被局限于特定病毒的组件。所述病毒载体可以包括衍生自两种或更多种不同病毒的组件，并且还可以包括合成的组件。载体组件可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。本发明的重组载体衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒(hiv)、人类获得性免疫缺陷综合征(aids)的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒(siv)。非灵长类慢病毒群组包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(vmv)、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒(fiv)和牛免疫缺陷病毒(biv)。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123；7,056,699；7,07,993；7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进整合进靶细胞基因组。该专利教导了每个逆转录病毒包括被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复(ltr)的区域而被处于两个末端的侧翼。所述ltr负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，ltr能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒rna的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。ltr自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为u3、r和u5。u3衍生自对rna的3'末端独特的序列。r衍生自在rna的两个末端重复的序列，而u5衍生自rna的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，聚合(a)加成(终止)的位点是在lrt右手边的r和u5之间的边界处。u3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应细胞(在某些情况下为病毒)转录激活蛋白。关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白ma(基质)、ca(衣壳)和nc(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(rt)，其包括dna聚合酶、相关的rna酶h和整合酶(in)，它们介导基因组的复制。对于病毒载体颗粒的生产，载体rna基因组被表达自在宿主细胞中的编码它的dna构建体。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个)，以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒的部件。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组、或者它们可以以混合物的方式而被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：invitrogen的plenti系列版本4、6和6.2“virapower”系统，由lentigencorp.制造；phiv-7-gfp，由cityofhoperesearchinstitute实验室生成和使用；“lenti-x”慢病毒载体，plvx，由clontech制造；plko.1-puro，由sigma-aldrich制造；plemir，由openbiosystems制造；以及plv，由virology(cbf),berlin,germany的charitémedicalschool,institute实验室生成和使用。不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组dna序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段(ellsa和蛋白免疫印迹)或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将car包装进逆转录病毒包装系统。包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体包括促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包括至少一种逆转录病毒辅助dna序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒dna序列缺少编码病毒的病毒性5′ltr的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′ltr，但是编码外来的聚腺苷酸化位点(例如sv40聚腺苷酸化位点)、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、或长臂猿白血病病毒(galv)。所述外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒(hcmv)即刻早期(ie)增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒(mmsv)的增强子和启动子(u3区域)、rous肉瘤病毒(rsv)的u3区域、脾病灶形成病毒(sffv)的u3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)启动子的hcmvie增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助dna序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性mmlv或galv的gag和pol蛋白的cdna，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cdna。env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的(貂病灶形成)或10a1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒(galv)env蛋白、人类免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(vsv)g蛋白、人类t细胞白血病(htlv)i型和ii型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。在包装过程中，包装质粒和逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞(atccno.crl1573,atcc,rockville,md.)，从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞)共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞或造血干细胞)一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在另一个方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞(例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞)的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代地，载体可以被引入游离基因地(episomally)维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。car细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的car的细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来通常地激活和扩增细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041以及例如lapatevaetal.(2014)critrevoncog19(1-2):121-32；tametal.(2003)cytotherapy5(3):259-72；garcia-marquezetal.(2014)cytotherapy16(11):1537-44的参考文献中描述的方法。使用tnt相关抗原离体刺激能够激活并扩增表达所选的car的细胞亚群体。替代地，可以通过与tnt相关抗原相互作用，体内激活细胞。在一些免疫细胞的情况中，可能需要额外的细胞群体、可溶性配体和/或细胞因子或刺激剂来活化和扩增细胞。相关的试剂在本领域是公知的，并根据已知的免疫学原理进行选择。例如，可溶性cd-40配体可能有助于激活和扩展某些b细胞群；类似地，照射的饲养细胞可以用于nk细胞活化和扩增的过程。激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于lifetechnologies系统激活和扩增试剂盒；bdbiosciencesphosflowtm激活试剂盒、miltenyibiotecmacstm激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的珠粒或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚群体。例如，α-cd3/α-cd28可以被用来激活和扩增分离的t细胞的群体。iv.使用方法治疗应用。本发明的方法方面涉及用于在有需要的对象中抑制肿瘤的生长的方法、和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方式中，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方式中，所述癌症是影响血液和/或骨髓的癌症。在一些实施方式中，所述肿瘤或癌症表达或过度表达tnt相关抗原。在一些实施方式中，这些方法包括向所述对象或患者施用有效量的所述分离的细胞、或基本上由该步骤组成、或由该步骤组成。在进一步的实施方式中，该分离的细胞包括tntcar。在更进一步的实施方式中，所述分离的细胞是t细胞或nk细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞对于被治疗的所述对象或患者来说是自体同源的。在进一步的方面，所述肿瘤表达tnt相关抗原，并且所述对象已经通过诊断(例如本文所述的一种)而被选择进行治疗。所述对象是动物、哺乳动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、马科动物、鼠科动物或人类患者。本文公开的tntcar细胞可以被单独地施用，或者与稀释剂、已知的抗癌治疗剂、和/或与其他组分(例如细胞因子或免疫调节的其他细胞群体)一起施用。它们可以是一线疗法、二线疗法、三线疗法、或进一步的疗法。其他疗法的非限制性例子包括细胞减灭疗法，例如放射疗法、冷冻疗法、或化学疗法、或生物制剂。另外的非限制性例子包括其它相关的细胞类型，例如未修饰的免疫细胞、包含表达一种或多种免疫调节分子的载体的修饰的免疫细胞、或对与本文公开的抗原不同的抗原特异的car细胞。与本发明的car细胞一样，在一些实施方式中，这些细胞可以是自体同源的或同种异体的。合适的治疗方案将由治疗医师或兽医确定。可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用本发明的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。在一个方面，它们通过直接注射或全身给药(例如静脉内注射)而直接施用。本发明的一些方面涉及用于确定患者是可能响应还是不可能响应tntcar疗法的示例性方法。所述方法包括以下步骤、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：确定在从患者分离的肿瘤样品中存在或不存在坏死，并且定量在给定的肿瘤样品中存在的坏死量，其中坏死的存在表明所述患者可能响应所述tntcar疗法，而坏死的不存在表明所述患者不可能响应所述tnt疗法。在一些实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：向被确定可能响应tntcar疗法的患者施用有效量的tntcar疗法。所述tntcar疗法对于所述患者来说可以是自体同源的或同种异体的，并且所述患者可以是患有实体肿瘤的对象，动物或人类。坏死的组织学染色的技术在本领域中是众所周知的。例如，也称为“h&e染色”的苏木精和伊红染色是用于鉴定组织中是否存在坏死的常用技术，特别是在致瘤性或癌性生长中。细胞质h&e染色显示嗜酸性粒细胞增多，部分归因于细胞质rna的损失，部分归因于变性的胞质蛋白质。在坏死组织染色中，细胞质通常由于细胞质细胞器的酶消化而出现“虫蛀”。髓磷脂数字、钙化和吞噬进其他细胞的证据也是可以通过组织学染色检测的坏死组织的标志。坏死组织在核染色中也具有特定的标志，其常常表明由于细胞死亡导致的核溶解、固缩和核碎裂。使用显微镜和手动或自动定量这种坏死标志，可以确定tntcar疗法的相关性。通常检测致瘤性或癌性生长或坏死组织的替代方式(包括但不限于基于生物标记物或基于成像的诊断)，也与确定患者是否将对tntcar疗法作出反应同样相关，并且可以相应地使用。v.载体本发明的其他方面涉及组合物，其包括载体和在本文公开的实施方式中描述的产品中的一种或多种，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，例如tntcar、包括tntcar的分离的细胞、分离的核酸、载体、包括tntcar和免疫调节分子的分离的细胞、和/或编码其的核酸。在进一步的方面，所述组合物可以额外地包括免疫调节分子和/或含有nfat调节性多核苷酸和编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸。在一些实施方式中，所述免疫调节分子是选自以下的一种或多种分子：b7.1、ccl19、ccl21、cd40l、cd137l、gitrl、gm-csf、il-12、il-2、低毒性il-2、il-15、il-18、il-21、lec和ox40l。简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，联合一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。在治疗过程中，细胞或组合可以单个剂量形式连续或间断给药。本领域技术人员已知确定最有效的给药途径和给药剂量的方法，并且这会根据用于疗法、疗法目的和病患的情况而改变。可以根据治疗医师选择的剂量水平和模式来进行单次或多次给药。合适的制剂和给药方法在本领域是已知的。在另一个方面，本发明的细胞和组合物可与其他治疗联合进行。细胞和细胞群通过本领域已知的方法给药至宿主，这些方法例如描述于pct/us2011/064191。本发明的细胞或组合物的给药可用来产生用于实验或筛选分析的具有期望疾病、病症或适应症的动物模型。vi.试剂盒如本文所述，本发明提供了用于生产和施用tntcar细胞的方法。在一个特定的方面，本发明提供了用于执行这些方法的试剂盒，以及用于进行本发明的方法的说明，例如收集细胞和/或组织、和/或进行筛选/转导/等等、和/或分析结果。在一个方面，所述试剂盒包括本文公开的分离的核酸中的任何一种和/或含有所述核酸和/或分离的同种异体细胞(优选t细胞或nk细胞)的载体、和/或关于从患者获得自体同源细胞的说明，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。这样的试剂盒可以包括适用于表达tntcar的细胞的转导和/或选择和/或激活和/或扩增的介质和其他试剂(例如本文公开的)，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一个方面，所述试剂盒包括分离的表达car的细胞或其群体，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，该试剂盒的细胞在施用至有需要的对象之前可能需要激活和/或扩增。在进一步的实施方式中，所述试剂盒可以进一步包括介质和试剂(例如是在上文中覆盖的)，或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，以激活和/或扩增所述分离的表达car的细胞。在一些实施方式中，所述细胞将被用于tntcar疗法。在进一步的实施方式中，所述试剂盒包括关于将所述分离的细胞施用至需要tntcar疗法的患者的说明。所述试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒可以进一步包括检测所述可标记的标签(例如酶或底物)必要的组件。所述试剂盒还可以包括对照样品或一系列的对照样品，其可以被检测并且与测试样品相比较。所述试剂盒的每个组件都可以被包裹在单个容器之内，并且所有的各种容器可以与用于解读使用该试剂盒进行的测试的结果的说明一起，处于单一的包装之内。本发明的试剂盒可以包括在所述试剂盒容器之上或之内的书面产品。所述书面产品描述了如何使用被包含在试剂盒之内的试剂。经得起考验的是，可以以本领域技术人员习惯使用的方式来包装这些建议的试剂盒组件。例如，这些建议的试剂盒组件可以被提供于溶液中或者作为液体分散体等。以下实施例是可被用在各种情况下来将本发明付诸实施的示例性程序。实施例1-lec生物活性如在厂家的说明中所描述地，通过测量在96孔微趋化室(neuroprobe,gaithersburg,md)中靶细胞的迁移，体外证明lec融合蛋白的生物活性(li,j.etal.(2003)jimmunother.26:320-331；li,j.etal.(2003)cancerres.63:8384-8392)。简单来说，在结合培养基(rpmi1640，具有1％bsa和25mmol/lhepes)中将lec/chtnt-3、重组人lec或亲本chtnt-3从0.39nm连续稀释至50nm，并放置在微趋化装置的下部腔室中。然后将含有105thp-1人类单核细胞的一百μl结合培养基加入至上部腔室，并且在加湿的5％co2、37℃培养器中孵育1.5h之后，计算迁移细胞的百分比以确定迁移指数(暴露于趋化因子和融合蛋白的细胞的平均数除以暴露于结合培养基的细胞的平均数)。所有测定一式三份进行。如图5所示，游离的人重组lec和融合蛋白诱导thp-1细胞迁移。暴露于融合蛋白的thp-1细胞的迁移是剂量依赖性的，其以低至1.6nm的浓度开始，峰浓度为12.5nm。在该测定中，游离的人重组lec峰值达到约25nm的较高浓度。暴露于亲本抗体(chtnt-3)的thp-1细胞没有显示任何迁移，验证了融合蛋白的lec部分的生物学活性。实施例2-分泌型tntcart细胞的产生nfat增强子连接的il-12&lec基因的构建从人il-2基因转录激活位点上游的核苷酸-286至-258发现的nfat基序被用于可诱导的构建体(标记为(nfat)6)。加下划线的序列表示nfat结合位点，斜体序列表示ap-1结合位点(fiering,s.etal.(1990)genesdev.4(10):1823–1834)(seqidno:57)：-286ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg-258接着这些nfat基序重复的是il-2基因启动子的核苷酸-70到+47，其保留了其tata盒和转录起始位点。将该最小的il-2启动子序列直接读入编码il-12或lec的dna序列(图6a&6b)。因此，il-12或lec仅在适当的t细胞激活和nfat结合至最小il-2启动子之后才被表达，从而允许转录起始。可诱导的il-12基因由genewiz基因合成服务合成。在+47加入限制性内切酶位点以允许将lec或替代基因亚克隆到该可诱导构建体中。替代地，为了构建双重可诱导的il-12-lec基因，将il-12和lec基因亚克隆到最小il-2启动子序列的下游，并通过下文在图7中显示的内部核糖体进入位点分开。tnt-car和可诱导的基因亚克隆进慢病毒质粒单独地，用tnt-car和可诱导的质粒cdna转化novabluesinglestm化学感受态大肠杆菌细胞。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化tnt-car和可诱导的质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过过夜t4dna连接酶反应(newenglandbiosciences；ipswich,ma)被插入进基于hiv-1的慢病毒载体，该载体包括hiv-15’和3’长末端重复(ltr)、包装信号(ψ)、ef1α启动子、内部核糖体进入位点(ires)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)、和猿病毒40来源(sv40)。然后使用得到的含有tnt-car和可诱导基因的慢病毒质粒，转化novabluesinglestm化学感受态的大肠杆菌细胞。慢病毒颗粒的生产在转染之前，在10ml完全-tet-dmem中在4.0×106个细胞/100mm组织培养物处理过的板上接种hek293t细胞，并且在加湿的5％co2培养器中在37℃下过夜孵育。一旦80-90％融合，则使用tnt-car或可诱导基因慢病毒载体和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装载体，共转染hek293t细胞。还加入了专有的反应缓冲液和聚合物以促进形成结合hek293t细胞的含有载体的纳米颗粒。在37℃下孵育被转染的hek293t细胞培养物4小时之后，将转染培养基替换为10ml新鲜的完全tetdmem。然后再孵育hek293t细胞48小时，然后收获细胞上清液，并通过针对p24这一主要慢病毒衣壳蛋白的夹心elisa测试慢病毒颗粒。将含有慢病毒的上清液进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标cd4+和cd8+t细胞的转导。人类cd4+和cd8+外周血t细胞的纯化、活化和富集回收使用ficoll-paqueplus(gehealthcare；littlechalfont,buckinghamshire,uk)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(pbmc)，并通过离心进行洗涤，该离心使用含有0.5％牛血清白蛋白(bsa)和2mmedta的pbs。可以使用macscd4+和cd8+microbeads(miltenyibiotec；sandiego,ca)试剂盒来分离这些人类t细胞亚群，其中使用磁激活的ls柱来主动选择cd4+和cd8+t细胞。然后从磁性macs分离器中移除磁结合的t细胞，从ls柱中冲刷，并在新鲜的完全培养基中洗涤。通过使用lifetechnologiesacoustic细胞仪进行的流式细胞术评估cd4+和cd8+t细胞的纯度，并在有需要的情况下通过在usc的流式细胞术核心设备进行的荧光激活细胞分选而进行富集。1:1混合cd4+和cd8+t细胞，并且在合适的细胞培养容器中在补充有100iu/mlil-2的完全培养基中维持1.0×106个细胞/ml的密度，其中α-cd3/α-cd28人类t细胞戴诺磁珠(lifetechnologies；carlsbad,ca)被加入来激活被培养的t细胞。在5％co2培养器中在37℃下孵育t细胞2天，然后使用tnt-car慢病毒颗粒进行转导。cd4+cd8+t细胞的慢病毒转导收集活化的t细胞，并通过ficoll-hypaque密度梯度离心或使用macs死细胞移除试剂盒(miltenyibiotec；sandiego,ca)，移除死细胞。在6孔板中，以1.0×106个细胞/ml完全培养基的密度将活化的t细胞进行铺板。通过以下各种方法转导细胞，以便为后续的tnt-car.il-12-lec细胞生产选择产生活细胞的最大转导效率的转导方法。通过旋转转染(spinfection)进行慢病毒转导将tnt-car或可诱导基因慢病毒颗粒与4μg/ml聚凝胺(polybrene，一种阳离子聚合物，它通过促进慢病毒颗粒与靶细胞表面之间的相互作用来辅助转导)一起添加到细胞悬液中。细胞在32℃以800×g离心1小时，随后孵育过夜。在离心之后，将含有慢病毒的培养基吸出，并将细胞沉淀物重新悬浮于具有100iu/mlil-2的新鲜完全培养基中。将细胞置于5％co2加湿的培养器中在37℃过夜。在第二天，吸出耗尽的培养基，并将慢病毒上清液再次加入到细胞中。转导后三天，将细胞沉淀并重悬于含有il-2和400μg/ml遗传霉素的新鲜完全培养基中(g418sulfate)(lifetechnologies；carlsbad,ca)。通过retronectin进行慢病毒转导将retronectin通过在pbs中过夜温育而铺在非组织培养物处理的平板上。接着，将tnt-car或可诱导基因慢病毒颗粒加入到retronectin涂覆的平板中。经过半天的培养后，吸出慢病毒上清液，并且在含有100iu/mlil-2的新鲜完全培养基中，将1:1混合的cd4+cd8+t细胞加入retronectin-慢病毒涂覆的平板，放置在37℃的5％co2加湿的培养器中3天。之后，将细胞沉淀并重新悬浮于具有il-2和400μg/ml遗传霉素的新鲜完全培养基中。通过抗生素选择进行tnt-car.il-12-lec细胞选择为了使用抗生素选择tnt-car.il-12-lec细胞，将两种抗生素抗性基因分别引入到tnt-car和可诱导的il-12-lec慢病毒载体中。在两步转导过程中，cd4+cd8+t细胞通过上述的旋转转染或rectronectin用tnt-car慢病毒进行转导。在用第一种抗生素培养一周之后，活细胞被纯化，并将通过旋转转染或rectronectin使用可诱导的il-12-lec慢病毒进行第二次转导。转导之后，将细胞在含有两种抗生素的培养基中孵育，以选择含有tnt-car.il-12-lec的细胞。通过facs进行tnt-car.il-12-lec细胞选择简而言之，转导后的t细胞培养物用生物素缀合的α-独特型tnt抗体进行标记，以鉴定tnt-car的scfv区域。然后，使用异硫氰酸荧光素缀合的链霉抗生物素蛋白来结合α-tnt。将细胞保持在冰上，并转移到usc的流式细胞核心设备中，以通过荧光激活细胞分选(facs)富集tnt-car细胞。由核心的员工使用bdfacsariatmii(bdbiosciences；franklinlakes,nj)进行细胞分选。为了富集含有可诱导的il-12-lec的细胞，使用gfp报道基因对转导的细胞进行阳性选择。实施例3nfat增强子连接的il-12&lec基因的构建从人il-2基因转录激活位点上游的核苷酸-286至-258发现的nfat基序的八个重复被用于可诱导的构建体(标记为(nfat)8)。加下划线的序列表示nfat结合位点，斜体序列表示ap-1结合位点(seqidno:57)：-286ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg-258接着这些nfat基序重复的是il-2基因启动子的核苷酸-70到+47，其保留了其tata盒和转录起始位点。将该最小的il-2启动子序列直接读入编码il-12或lec的dna序列(图8a)。因此，il-12或lec仅在适当的t细胞激活和nfat结合至最小il-2启动子之后才被表达，从而允许转录起始。可诱导的il-12基因由genewiz基因合成服务合成。在+47加入限制性内切酶位点以允许将lec或替代基因亚克隆到该可诱导构建体中。替代地，为了构建双重可诱导的il-12-lec基因，将il-12和lec基因亚克隆到最小il-2启动子序列的下游，并通过下文在图8b中显示的内部核糖体进入位点分开。tnt-car和可诱导的基因亚克隆进慢病毒质粒单独地，用tnt-car和可诱导的质粒cdna转化5-α化学感受态大肠杆菌细胞(newenglandbiosciences；ipswich,ma)。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化tnt-car和可诱导的质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过过夜t4dna连接酶反应(newenglandbiosciences；ipswich,ma)被插入进基于hiv-1的慢病毒载体，该载体包括hiv-15’和3’长末端重复(ltr)、包装信号(ψ)、ef1α启动子、内部核糖体进入位点(ires)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)、和猿病毒40来源(sv40)。然后使用得到的含有tnt-car和可诱导基因的慢病毒质粒，转化5-α化学感受态的大肠杆菌细胞。慢病毒颗粒的生产在转染之前，在补充有10％透析的fcs加青霉素/链霉素的10ml完全dmem中在4.0×106个细胞/150cm2组织培养物处理过的板上接种293ltv细胞(选择用于优异的慢病毒生产能力的hek293t细胞的亚克隆)，并且在加湿的5％co2培养器中在37℃下过夜孵育。在80-90％融合和转染前两小时，使用补充有不含青霉素/链霉素的10％透析的fcs的10mldmem替换培养基。两小时之后，使用tnt-car和/或可诱导基因慢病毒质粒加上含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的慢病毒基因的包装和信封质粒，共转染细胞。加入由takara/clontech(mountainview,ca)开发的专有反应缓冲液和聚合物溶液，以促进形成结合293ltv细胞的含有质粒的纳米颗粒。在37℃下孵育被转染的293ltv细胞培养物24小时之后，将转染培养基替换为补充有10％透析的fcs加青霉素/链霉素的10ml新鲜的完全dmem。接着，每24小时收集含有慢病毒的上清液3天。最后的收集之后，上清液在4℃以350×g离心并过滤残留的细胞和碎片。然后将含慢病毒的上清液在4℃以20,000×g超速离心2小时，并重新悬浮于含有7％海藻糖和1％bsa的pbs中。将含有慢病毒的上清液分装并储存在-80℃，直至用于靶效应细胞的转导。人类cd4+和cd8+外周血t细胞的纯化、活化和富集回收使用ficoll-paqueplus(gehealthcare；littlechalfont,buckinghamshire,uk)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(pbmc)，并通过离心进行洗涤，该离心使用含有0.5％牛血清白蛋白(bsa)和2mmedta的pbs。使用t细胞富集试剂盒(stemcelltechnologies)来磁性分离cd4+andcd8+t细胞的pbmc。通过使用lifetechnologiesacoustic细胞仪进行的流式细胞术评估cd4+和cd8+t细胞的纯度，并在有需要的情况下通过在usc的流式细胞术核心设施进行的荧光活化细胞分选而进行富集。在合适的细胞培养容器中在补充有100iu/mlil-2的完全50％click's培养基/50％rpmi-1640中将1:1混合cd4+和cd8+t细胞维持1.0×106个细胞/ml的密度，其中α-cd3/α-cd28人类t细胞激活磁珠(stemcelltechnologies)被加入来激活被培养的t细胞。在5％co2培养器中在37℃下孵育t细胞2天，然后使用tnt-car慢病毒颗粒进行转导。cd4+cd8+t细胞的慢病毒转导收集活化的t细胞，并通过ficoll-hypaque密度梯度离心或使用macs死细胞移除试剂盒(miltenyibiotec；sandiego,ca)，移除死细胞。在6孔板中，以1.0×106个细胞/ml完全培养基的密度将活化的t细胞进行铺板。使用lentiblast转染助剂(ozbiosciences,sandiego,ca)用慢病毒颗粒转导细胞。为了提高难转导细胞(即nk-92mi)的转导效率，细胞可以在32℃在retronectin涂覆的平板(takara/clontech；mountainview,ca)中1小时在32℃以800×g离心1小时，然后过夜孵育。在转导之后的早晨，将含有慢病毒的耗尽的培养基与新鲜的完全rpmi交换。转导的细胞被培养直到进一步的下游测定和分析。通过抗生素选择进行tnt-car.il-12-lec细胞选择为了使用抗生素选择tnt-car.il-12-lec细胞，将两种抗生素抗性基因分别引入到tnt-car和可诱导的il-12-lec慢病毒载体中。在两步转导过程中，cd4+cd8+t细胞通过上述的旋转转染或rectronectin用tnt-car慢病毒进行转导。在用第一种抗生素培养一周之后，活细胞被纯化，并将通过旋转转染或rectronectin使用可诱导的il-12-lec慢病毒进行第二次转导。转导之后，将细胞在含有两种抗生素的培养基中孵育，以选择含有tnt-car.il-12-lec的细胞。通过facs进行tnt-car.il-12-lec细胞选择简而言之，转导后的t细胞培养物用生物素缀合的α-独特型tnt抗体进行标记，以鉴定tnt-car的scfv区域。然后，使用异硫氰酸荧光素缀合的链霉抗生物素蛋白来结合α-tnt。将细胞保持在冰上，并转移到usc的流式细胞核心设备中，以通过荧光激活细胞分选(facs)富集tnt-car细胞。由核心的员工使用bdfacsariatmii(bdbiosciences；franklinlakes,nj)进行细胞分选。为了富集含有可诱导的il-12-lec的细胞，使用绿色荧光蛋白(gfp)报道基因对转导的细胞进行阳性选择。可诱导基因的诱导的测试carnfat细胞的刺激在完全培养基中以0.5–5.0×105个细胞/ml的密度铺板carnfat细胞。为了诱导nfat基因，施用了以下条件之一：以1:1car-nfat与靶细胞的比例加入靶细胞或靶抗原；用1–2％pha、或pma(终浓度：10ng/ml)加离子霉素(500ng/ml)刺激细胞；细胞给予稀释剂控制。孵育过夜后，收获car-nfat细胞或上清液用于下游分析。流式细胞术通过离心在pbs中洗涤两次收获的细胞。然后，将细胞重悬于pbs2％fcs中，并进行fcr阻断，随后用针对car细胞(即抗scfv、抗cd3)和靶细胞抗原(例如抗cd19)的荧光抗体染色。在4℃孵育1小时之后，将细胞在pbs2％fcs中洗涤，并使用lifetechnologies声学聚焦细胞仪分析诱导的基因表达。lec和il-12的elisa将刺激的细胞离心并将上清液转移至用适当的捕获抗体(见下表)涂覆的96孔板。在4℃孵育过夜后，将elisa板在pbs0.05％tween-20中洗涤，然后用合适的抗体偶联的生物素化检测进行探测。然后，将板与链霉亲和素-hrp一起孵育，使用tmb底物显色(biolegend；sandiego,ca)。使用1mh2so4停止产色tmb反应。在biotek的synergyht酶标仪(biotek；winooski,vt)上测量在450nm的吸光度。表3:等效物除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和例子是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。在以下权利要求中阐述了其他方面。序列表tnt-1cdhr1,seqidno:1:gfsltdygtnt-1cdhr2,seqidno:2:iwgggsttnt-1cdhr3,seqidno:3:akekrrgyyyamdytnt-1cdlr1,seqidno:4:ssvsssytnt-1cdlr2,seqidno:5:ststnt-1cdlr3,seqidno:6:qqysgyplttnt-1重链可变区域序列，seqidno:7:caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctcagggttctcattaaccgactatggtgtaaggtggattcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtggtggaagcacatactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatgtactactgtgccaaagagaaacggagggggtattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcatnt-1轻链可变区域序列，seqidno:8:ggagaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagtcaggtgcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacagtggttacccactcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaatnt-2cdhr1,seqidno:9:gysftgyytnt-2cdhr2,seqidno:10:inpyngattnt-2cdhr3,seqidno:11:arldrgdytnt-2cdlr1,seqidno:12:envvtytnt-2cdlr2,seqidno:13:gastnt-2cdlr3,seqidno:14:gqgysypyttnt-2重链可变区域序列，seqidno:15:gaggtacagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctactacatgcactgggtgaagcaaagccatgtaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgctactagctacaaccagaatttcaaggacaaggccagcttgactgtagataagtcctccagcacagcctacatggagctccacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagactagaccggggggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcatnt-2轻链可变区域序列，seqidno:16:aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgacctgcaaggccagtgagaatgtggttacttatgtttcctggtatcaacagaaaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagggttacagctatccgtacacgttcggaggggggacaaagttggaaataaaacgtacgtnt-3cdhr1,seqidno:17:gytftrywtnt-3cdhr2,seqidno:18:iypgnsdttnt-3cdhr3,seqidno:19:argeeigvrrwfaytnt-3cdlr1,seqidno:20:qsisnytnt-3cdlr2,seqidno:21:yastnt-3cdlr3,seqidno:22:qqsnswplttnt-3重链可变区域序列，seqidno:23:caggtccaactgcagcagtcaggagctgaactggtcaagactggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagatactggatgcactgggtaaaacagaggcctggacaggctctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatactagctactaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatctgccagcactgcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagaggggaggaaataggggtacgacgctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcatnt-3轻链可变区域序列，seqidno:24:gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtcagtctttcctgcagggccaggcaaagtattagcaactacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctggcatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtaacagctggccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaanhs76cdhr1,seqidno:25:sgyywgnhs76cdhr2,seqidno:26:siyhsgstyynpslksnhs76cdhr3,seqidno:27:gkwskfdynhs76cdlr1,seqidno:28:qgdslrsyyasnhs76cdlr2,seqidno:29:gknnrpsnhs76cdlr3,seqidno:30:nsrdssgnhvvnhs76重链可变区域序列，seqidno:31:caggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctctggttactccatcagcagtggttactactggggctggattcggcagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctatcatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcagacacggccgtgtattactgtgcaagagggaagtggtcgaagtttgactattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcttcanhs76轻链可变区域序列，seqidno:32:tcctctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggattccagaccgattctctggctccagctcaggaaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccatgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta人类cd8α铰链结构域，seqidno:33:pakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiy小鼠cd8α铰链结构域，seqidno:34:kvnstttkpvlrtpspvhptgtsqpqrpedcrprgsvkgtgldfacdiy猫cd8α铰链结构域，seqidno:35:pvkptttpaprpptqapittsqrvslrpgtcqpsagstveasgldlscdiy人类cd8α跨膜结构域，seqidno:36:iyiwaplagtcgvlllslvit小鼠cd8α跨膜结构域，seqidno:37:iwaplagicvalllsliitli大鼠cd8α跨膜结构域，seqidno:38:iwaplagicavlllslvitli4-1bb共刺激信号传导区域，seqidno:39:krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelcd28序列(seqidno:40):mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrscd3ζ信号传导结构域(seqidno:41):rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr“b7.1”np_005182.1,seqidno:42:mghtrrqgtspskcpylnffqllvlaglshfcsgvihvtkevkevatlscghnvsveelaqtriywqkekkmvltmmsgdmniwpeyknrtifditnnlsivilalrpsdegtyecvvlkyekdafkrehlaevtlsvkadfptpsisdfeiptsnirriicstsggfpephlswlengeelnainttvsqdpetelyavsskldfnmttnhsfmclikyghlrvnqtfnwnttkqehfpdnllpswaitlisvngifviccltycfaprcrerrrnerlrresvrpv“ccl19”np_006265.1,seqidno:43:malllalsllvlwtspaptlsgtndaedcclsvtqkpipgyivrnfhyllikdgcrvpavvfttlrgrqlcappdqpwveriiqrlqrtsakmkrrss“ccl20”一个例子含有np_004582.1,seqidno:44:mcctkslllaalmsvlllhlcgeseaasnfdcclgytdrilhpkfivgftrqlanegcdinaiifhtkkklsvcanpkqtwvkyivrllskkvknm以及np_001123518.1,seqidno:45:mcctkslllaalmsvlllhlcgeseasnfdcclgytdrilhpkfivgftrqlanegcdinaiifhtkkklsvcanpkqtwvkyivrllskkvknm“cd40l”np_000065.1,seqidno:46:mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhrrldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdimlnkeetkkensfemqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl“cd137l”np_003802.1,seqidno:47:meyasdasldpeapwppapraracrvlpwalvaglllllllaaacavflacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse“gitrl”np_005083.2,seqidno:48:mtlhpspitceflfstalispkmclshlenmplshsrtqgaqrsswklwlfcsivmllflcsfswlififlqletakepcmakfgplpskwqmasseppcvnkvsdwkleilqnglyliygqvapnanyndvapfevrlyknkdmiqtltnkskiqnvggtyelhvgdtidlifnsehqvlknntywgiillanpqfis“gm-csf”uniprot参考编号p04141-csf2_human(seqidno:49):mwlqsllllgtvacsisaparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqe“il-12”seqidno:50:catggccatgtgtcatcagcagctggtcatcagctggttcagcctggtgttcctggccagccccctggtggccatctgggagctgaagaaagacgtgtacgtggtggagctggactggtatcccgacgcccctggcgagatggtggtgctgacctgcgacacccccgaagaggacggcatcacctggaccctggaccagagcagcgaggtgctgggcagcggcaagaccctgaccatccaggtcaaagagttcggcgacgccggccagtacacctgccacaagggcggcgaagtgctgtcccacagcctgctgctgctgcacaagaaagaggatggcatctggtccaccgacatcctgaaggaccagaaagagcccaagaacaagaccttcctgcggtgcgaggccaagaactacagcggccggttcacctgttggtggctgaccaccatcagcaccgacctgaccttcagcgtgaagagcagccggggcagcagcgaccctcagggcgtgacctgcggagccgccaccctgagcgccgagagagtgcggggcgacaacaaagagtacgagtacagcgtcgagtgccaggaagatagcgcctgccctgccgccgaggaaagcctgcccatcgaggtgatggtggacgccgtgcacaagctgaagtacgagaactacacctccagctttttcatccgggacatcatcaagcccgacccccccaagaacctgcagctgaagcccctgaagaacagccggcaggtggaggtgtcctgggagtaccctgacacctggtccaccccccacagctacttcagcctgaccttctgtgtgcaggtgcagggcaagagcaagcgggagaagaaagaccgggtgttcaccgacaagaccagcgccaccgtgatctgccggaagaacgccagcatcagcgtgcgggcccaggaccggtactacagcagctcctggtccgagtgggccagcgtgccctgcagcggcggagggggcggaggaagccggaacctgcccgtggctacccccgaccccggcatgttcccctgcctgcaccacagccagaacctgctgcgggccgtgagcaacatgctgcagaaggcccggcagaccctggaattctacccctgcaccagcgaggaaatcgaccacgaggacatcaccaaggataagaccagcaccgtggaggcctgcctgcccctggaactgaccaagaacgagagctgtctgaactctcgggagacaagcttcatcaccaacggctcttgcctggccagcagaaagaccagcttcatgatggccctgtgcctgagcagcatctacgaggacctgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaacgccaagctgctgatggaccccaagcggcagatcttcctggatcagaacatgctggccgtgatcgacgagctgatgcaggccctgaacttcaacagcgagacagtgccccagaagtccagcctggaagagcccgacttctacaagaccaagatcaagctgtgcatcctcctgcatgccttccggatccgggccgtgaccatcgaccgggtgatgagctacctgaacgccagctgatgagc“il-2”seqidno:51:aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt“il-15”seqidno:52.wvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceelekknikeflqsfvhivqmfints“il-18”seqidno:53.maaepvedncinfvamkfidntlyfiaeddenlesdyfgklesklsvirnlndqvlfidqgnrplfedmtdsdcrdnaprtifiismykdsqprgmavtisvkcekistlscenkiisfkemnppdnikdtksdiiffqrsvpghdnkmqfesssyegyflacekerdlfklilkkedelgdrsimftvqned“il-21”seqidno:54.qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds“lec”np_004581.1,seqidno:55:mkvseaalsllvliliitsasrsqpkvpewvntpstcclkyyekvlprrlvvgyrkalnchlpaiifvtkrnrevctnpnddwvqeyikdpnlpllptrnlstvkiitakngqpqllnsq“ox40l”np_003317.1,seqidno:56:mervqpleenvgnaarprfernklllvasviqglglllcftyiclhfsalqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl与nfat相互作用的示例性多核苷酸(seqidno:57):ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg与nfat相互作用的示例性多核苷酸(seqidno:58):aggaaaaac铰链结构域：igg1重链铰链序列，seqidno:59:ctcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccg跨膜结构域：cd28跨膜区域seqidno:60:ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg细胞内结构域：4-1bb共刺激信号传导区域，seqidno:61:aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg细胞内结构域：cd28共刺激信号传导区域，seqidno:62:aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc细胞内结构域：cd3ζ信号传导区域，seqidno:63:agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaicos共刺激信号传导区域，seqidno:64:acaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagccaaaaaatccagactcacagatgtgaccctaox40共刺激信号传导区域，seqidno:65:agggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatc序列表<110>南加利福尼亚大学<120>分泌型tntcar细胞免疫疗法<130>064189-7181<140><141><150>62/155,296<151>2015-04-30<160>68<170>patentinversion3.5<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>1glypheserleuthrasptyrgly15<210>2<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>2iletrpglyglyglyserthr15<210>3<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>3alalysglulysargargglytyrtyrtyralametasptyr1510<210>4<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>4serservalsersersertyr15<210>5<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>5serthrser1<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>6glnglntyrserglytyrproleuthr15<210>7<211>360<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>7caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatc60acatgcactgtctcagggttctcattaaccgactatggtgtaaggtggattcgccagcct120ccaggaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtggtggaagcacatactataat180tcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttctta240aaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatgtactactgtgccaaagagaaacgg300agggggtattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca360<210>8<211>327<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>8ggagaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtc60accatgacctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcag120aagtcaggtgcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtc180cctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtg240gaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacagtggttacccactcacgttc300ggaggggggaccaagctggaaataaaa327<210>9<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>9glytyrserphethrglytyrtyr15<210>10<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>10ileasnprotyrasnglyalathr15<210>11<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>11alaargleuaspargglyasptyr15<210>12<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>12gluasnvalvalthrtyr15<210>13<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>13glyalaser1<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>14glyglnglytyrsertyrprotyrthr15<210>15<211>345<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>15gaggtacagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagata60tcctgcaaggcttctggttactcattcactggctactacatgcactgggtgaagcaaagc120catgtaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgctactagctac180aaccagaatttcaaggacaaggccagcttgactgtagataagtcctccagcacagcctac240atggagctccacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagactagac300cggggggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca345<210>16<211>327<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>16aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcacc60ttgacctgcaaggccagtgagaatgtggttacttatgtttcctggtatcaacagaaacca120gagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgat180cgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggct240gaagaccttgcagattatcactgtggacagggttacagctatccgtacacgttcggaggg300gggacaaagttggaaataaaacgtacg327<210>17<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>17glytyrthrphethrargtyrtrp15<210>18<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>18iletyrproglyasnseraspthr15<210>19<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>19alaargglyglugluileglyvalargargtrpphealatyr1510<210>20<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>20glnserileserasntyr15<210>21<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>21tyralaser1<210>22<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>22glnglnserasnsertrpproleuthr15<210>23<211>363<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>23caggtccaactgcagcagtcaggagctgaactggtcaagactggggcctc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