技术领域和
背景技术：
当外部机械力引起脑功能障碍时，会发生创伤性脑损伤(tbi)。
创伤性脑损伤通常是由于对头部或身体的猛烈撞击或摇晃造成的。穿透颅骨的物体如子弹或颅骨的碎片也会造成创伤性脑损伤。
tbi被称为现代战争的标志性损伤。2008年公开的rand公司调查估计，部署到伊拉克或阿富汗的人中有多达19.5％遭受tbi(rand；reportsandbookstore；researchbriefs；rb-9336；invisiblewounds:mentalhealthandcognitivecareneedsofamerica'sreturningveterans)。心理健康和创伤性脑损伤卓越防御中心(defensecentersofexcellenceforpsychologicalhealthandtraumaticbraininjury)(dcoe)估计每年有170万人罹患tbi，并且报道去年有将近25,000名军队成员被诊断为患有新tbi(dcoe的万维网扩展名.health.mil)。
创伤性脑损伤可能由各种冒犯引起。在西南亚的手术中，绝大多数轻度tbi(mtbi)是由爆炸暴露引起的。mtbi可能引起脑细胞暂时性功能障碍。更严重的创伤性脑损伤可能引起挫伤、组织撕裂、出血以及可能引起长期并发症或死亡的对脑的其它物理破坏。
脑震荡是一种创伤性脑损伤，其是由对头部或身体的撞击、跌倒或者震动或摇晃颅骨内的大脑的另一种损伤引起的。脑震荡的症状在轻微到严重范围内，并且可以持续数小时、数天、数周或甚至数月。反复脑震荡或严重脑震荡可能会导致运动、学习或说话的长期问题。目前，休息联合用于任何头痛的对乙酰氨基酚被认为是让脑从脑震荡中恢复的最适当方法。
虽然严重脑损伤的后遗症已经被研究多年并且相对充分地表征，但爆炸诱发或震荡性mtbi的后遗症还需要更充分地了解。现有文献表明，大多数症状的性质是神经感觉(hoffer等人,otolneurotol.201031(2):232-6；hoffer等人,plosone20138(1):e54163.doi:10.1371/journal.pone.0054163)。眩晕、听力下降、头痛和神经认知功能障碍是常见后遗症，并且尽管在一部分群体中这些后遗症会随时间推移而消除，但在多个个体中它们会持续并且可能恶化(hoffer等人,otolneurotol.201031(2):232-6)。此外，还有一批新兴的文献表明，随时间推移，继发于爆炸的mtbi可以展现表明这些患者中存在神经退化性病症的特征(woods等人,acschem.neurosci.2013epubaheadofpress.doi:10.1021/cn300216h)。
鉴于n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(ampa)和红藻氨酸(kainite)这些受体在神经破坏中的作用，研究工作集中于使用这些受体的拮抗剂来干扰所述受体介导的引起细胞死亡和坏死的钙流出。
关于这些拮抗剂的一些研究集中于大麻素(cannabinoid)，一部分大麻素是nmda受体拮抗剂。参见例如美国专利5,538,993、5,521,215和5,284,867。
然而，在ii期和iii期临床试验中测试了nmda受体拮抗剂地塞米诺(dexanabinol)(shohamie&biegona.cnsneuroldisorddrugtargets.2014；13(4):567-73)。在之前用于治疗脑震荡的地塞米诺的研究中，一项研究显示其降低了颅内压。然而，其它研究充其量也只是给出非最终结果，并且发现其不能抑制神经胶质增生和随后的免疫级联。所述研究未能为使用地塞米诺作为治疗脑震荡的单一药剂提供足够的支持。
美国专利6,630,597提出使用基本上不与nmda受体结合的大麻素作为神经保护剂。
以下文献也公开了大麻素作为用于脑震荡的一种可能疗法：shohami等人(journalofneurotrauma2009,10(2):109-119.doi:10.1089/neu.1993.10.109)、fernández-ruiz等人(handbexppharmacol.2015；231:233-59)以及pryce等人(handbexppharmacol.2015；231:213-31)。
大麻素cb2受体也被公开作为发炎依赖性神经变性的靶标(ashtonjc&glassm.currentneuropharmacology.2007；5(2):73-80)。
最近，正在研究黄体酮治疗作为改善tbi中的认知结果的可能药剂(si等人,neuroscilett.2013年8月14日.pii:s0304-3940(13)00714-3.doi:10.1016/j.neulet.2013.07.052；baykara等人,biotechhistochem.2013年7月；88(5):250-7.doi:10.3109/10520295.2013.769630；和meffre等人,neuroscience.2013年2月12日；231:111-24.d10.1016/j.neuroscience.2012.11.039)。
需要鉴定治疗剂和它们用于预防或治疗与爆炸或脑震荡诱发的mtbi相关的神经感觉缺陷的方法。
技术实现要素：
本发明涉及用于治疗受试者的创伤性脑损伤的方法和组合物。
本发明的一个方面涉及一种用于治疗受试者的创伤性脑损伤的方法，所述方法包含向受试者施用包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂的第一组合物和包含能够穿过血脑屏障的消炎剂的第二组合物。
本发明的另一方面涉及一种治疗受试者的创伤性脑损伤的方法，所述方法包含向受试者施用包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂的第一组合物和包含cb2激动剂的第二组合物，所述cb2激动剂为有效增加内源性cb2激动剂的药剂和/或调节花生四烯酸乙醇胺(aea)或2-花生四烯酰基甘油(2-ag)的水平的药剂。
在一个非限制性实施方式中，施用的第一组合物包含7-羟基-δ6-四氢大麻酚1,1-二甲基庚基。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含非大麻素cb2激动剂。
在另一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含也结合nmda受体的大麻素cb2激动剂。
在另一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含提高aea水平的药剂。
在另一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含降低2-ag水平的药剂。
在又一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含脂肪酸酰胺水解酶的抑制剂。
在一个非限制性实施方式中，所治疗的创伤性脑损伤是脑震荡。
本发明的又一方面涉及用于治疗创伤性脑损伤的组合物。在一个非限制性实施方式中，所述组合物包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂和能够穿过血脑屏障的消炎剂。在一个非限制性实施方式中，所述组合物包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂和cb2激动剂，所述cb2激动剂为有效增加内源性cb2激动剂的药剂和/或调节花生四烯酸乙醇胺(aea)或2-花生四烯酰基甘油(2-ag)的水平的药剂。
发明详述
本发明提供用于治疗受试者的创伤性脑损伤的方法。在一个非限制性实施方式中，所治疗的创伤性脑损伤是脑震荡。
本发明方法包含向罹患创伤性脑损伤的受试者施用包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂的第一组合物。
如本文所用，“nmda受体拮抗剂”旨在包括用于拮抗或抑制n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmda)的作用的药剂类别。实例包括但不限于地佐环平(dizocilpine)(mk-801)、氯胺酮(ketamine)、美金刚胺(memantine)、苯西克定(phencyclidine)、加克雷定(gascyclidine)、ap5、金刚烷胺、伊波加因(ibogaine)、一氧化二氮利鲁唑(nitrousoxideriluzole)、右啡烷(dextrorphan)、ap-7、替来他明(tiletamine)、米达福太(midafotel)、阿替加奈(aptiganel)和7-羟基-δ6-四氢大麻酚1,1-二甲基庚基(地塞米诺：hu-211)。在一个非限制性实施方式中，nmda受体拮抗剂是非竞争性(noncompetitive)nmda受体拮抗剂，诸如地塞米诺、gk-11或加克雷定或苯西克定，或无竞争性(uncompetitive)nmda受体拮抗剂，诸如地佐环平(dizocilpine)。适用于本发明的nmda受体拮抗剂的其它非限制性实例公开于美国专利5,521,215中，其教导以全文引用的方式并入本文中。在一个非限制性实施方式中，nmda受体拮抗剂是7-羟基-δ6-四氢大麻酚1,1-二甲基庚基(地塞米诺：hu-211)。
在一个非限制性实施方式中，所述第一组合物通过有效抑制创伤性脑损伤所致的肿胀的方案施用。
在一个非限制性实施方式中，所述第一组合物在创伤性脑损伤12小时内或者创伤性脑损伤6小时内或者创伤性脑损伤3小时内施用。在这些实施方式中，所述第一组合物可以以单次剂量或多次剂量施用。
在一个非限制性实施方式中，在创伤性脑损伤后72小时的时段内施用多次剂量的第一组合物。
在一个非限制性实施方式中，每天或每两天施用所述第一组合物直至创伤性脑损伤的症状减轻。
所述第一组合物可以通过能将有效量的nmda受体拮抗剂递送至脑的任何途径施用。施用途径的实例包括但决不限于静脉内、鼻内、口服、局部、透皮或通过吸入。
本领域技术人员在阅读本公开后将会了解，剂量可以由主治医师根据待治疗损伤的程度、施用方法、患者年龄、体重、禁忌症等来确定。剂量的非限制性实例包括150mg或大于150mg的单次静脉内剂量，以及在每天1-4次或每隔一天方案中在每公斤体重0.05mg至约50mg范围内的剂量。
在一个非限制性实施方式中，本发明方法还包含向受试者施用包含能够穿过血脑屏障的消炎剂的第二组合物。所述消炎剂可以根据有效抑制创伤性损伤所致的脑部发炎的任何给药方案施用。所述消炎剂可以在施用nmda受体拮抗剂之前、同时或之后施用。
在一个非限制性实施方式中，本发明方法还包含向受试者施用包含cb2激动剂的第二组合物，所述cb2激动剂为有效增加内源性cb2激动剂的药剂和/或调节花生四烯酸乙醇胺(aea)或2-花生四烯酰基甘油(2-ag)的水平的药剂。
如本文所用，“cb2激动剂”旨在包括以选择性或非选择性方式活化大麻素2受体的药剂类别。在一个非限制性实施方式中，所述cb2激动剂为非大麻素cb2激动剂。在另一个非限制性实施方式中，所述cb2激动剂为也结合nmda受体的大麻素cb2激动剂。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含大麻二酚(cbd)，大麻二酚(cbd)是某些种类的大麻中天然存在的化学物质。cbd无精神活性作用。cbd充当cb-2激动剂并呈现广泛的消炎和免疫抑制作用。
可替选地或此外，所述第二组合物可以包含有效增加内源性cb2激动剂的药剂和/或调节花生四烯酸乙醇胺(aea)或2-花生四烯酰基甘油(2-ag)的水平的药剂。在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含提高aea水平的药剂。在另一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含降低2-ag水平的药剂。在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含脂肪酸酰胺水解酶的抑制剂。在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物包含aea。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物通过有效抑制创伤性脑损伤所致的神经胶质增生的方案施用。
所述第二组合物可以在施用所述第一组合物之前、同时或之后施用。
在一个非限制性实施方式中，将第一和第二组合物一起配制成包含两种治疗剂的单一组合物。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物在创伤性脑损伤后12至72小时施用。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物在创伤性脑损伤12小时内或者创伤性脑损伤6小时内或者创伤性脑损伤3小时内施用。在这些实施方式中，第二组合物可以以单次剂量或多次剂量施用。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物与所述第一组合物一起以单一组合物形式在创伤性脑损伤12小时内或者创伤性脑损伤6小时内或者创伤性脑损伤3小时内施用。在这些实施方式中，包含第一和第二组合物的所述组合物可以以单次剂量或多次剂量施用。
在一个非限制性实施方式中，所述第二组合物在创伤性脑损伤后每天施用历时最多7天。
在一个非限制性实施方式中，每天或每隔一天施用所述第二组合物直至创伤性脑损伤的症状减轻。
所述第二组合物可以通过能将有效量的cb2激动剂递送至脑的任何途径施用，所述cb2激动剂为有效增加内源性cb2激动剂的药剂和/或调节花生四烯酸乙醇胺(aea)或2-花生四烯酰基甘油(2-ag)的水平的药剂。施用途径的实例包括但决不限于静脉内、鼻内、口服、局部、透皮或通过吸入。
本领域技术人员在阅读本公开后将会了解，剂量可以由主治医师根据待治疗损伤的程度、施用方法、患者年龄、体重、禁忌症等来确定。
本发明还提供用于治疗创伤性脑损伤的药物组合物。在一个非限制性实施方式中，所述组合物包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂和能够穿过血脑屏障的消炎剂以及药学上可接受的载体。在一个非限制性实施方式中，所述药物组合物包含n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂和cb2激动剂以及药学上可接受的载体，所述cb2激动剂为有效增加内源性cb2激动剂的药剂和/或调节花生四烯酸乙醇胺(aea)或2-花生四烯酰基甘油(2-ag)的水平的药剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括与治疗性组合物的活性相容并且为受试者生理学上可接受的任何和所有溶剂、赋形剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例是缓冲生理盐水(0.15mnacl)。这些介质和药剂用于药学上活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与治疗性组合物不相容，否则考虑将其用于适用于药物施用的组合物中。还可以将补充活性化合物并入所述组合物中。
包含治疗性组合物的分散液可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂来防止微生物的生长。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且必须在一定程度上是流动性的以便容易注射。其必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，液体聚乙二醇等)、适合的其混合物、和油(例如植物油)。可以例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
无菌可注射溶液可以通过将治疗性组合物以需要的量与以上所列举的成分中的一种或组合一起并入适当溶剂中，接着视需要过滤灭菌来制备。通常，通过将治疗性组合物并入无菌载体中来制备分散液，所述分散液含有基本分散介质和来自以上所列举的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法产生活性成分(即治疗性化合物)的粉末，任选地加有来自先前无菌过滤的溶液的任何其它所需成分。
用于口服施用的固体剂型包括可摄入胶囊、片剂、丸剂、棒棒糖、粉末、颗粒、酏剂(elixir)、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)、颊含片、锭剂等。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性赋形剂或稀释剂或可吸收的可食用载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下材料混合：a)填充剂或增量剂(extender)，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐(alginate)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)湿润剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，诸如石蜡，f)吸收促进剂，诸如季铵化合物，g)润湿剂，诸如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物，或直接并入受试者的膳食中。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以作为填充剂用于使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊。组合物和制剂中治疗性化合物的百分比当然可以变化。这些治疗上有用的组合物中治疗性化合物的量使得将获得适合的剂量。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物之外，液体剂型还可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、磨碎的坚果玉米油、胚芽橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、风味剂和芳香剂。
除活性化合物之外，悬浮液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶(tragacanth)以及其混合物。
治疗性化合物的药物组合物也可以以延时释放或储库(depot)形式施用，来获得治疗性化合物随时间的持续释放。本发明的治疗性化合物也可以透皮施用(例如通过使用适合的载体以贴片形式提供所述治疗性化合物)。
脑震荡会在各种步骤中对脑造成破坏。首先，初始撞击造成组织破坏。其次，脑组织开始通过发炎肿胀，导致颅内压增加。因为脑位于颅骨包围的固定区域，所以当脑因发炎肿胀时，其以越来越高的压力压迫颅骨并引起广泛的其它破坏。这种发炎在初始损伤后的前几个小时内开始。第三波破坏是通过称为神经胶质增生的过程发生的，该过程在初始损伤后6-12小时内开始，此时脑组织中的免疫反应级联发生，从而引起白血球浸润(白细胞和巨噬细胞浸润)和细胞因子释放。这种免疫级联本身是广泛组织损伤的原因。
通过研究这个过程中的两种不同受体，预期本发明的组合疗法可预防发炎并且抑制神经胶质增生和相关免疫级联，从而为脑震荡以及其它创伤性脑损伤提供有用的疗法。
具体实施方式
提供以下非限制性实施例来进一步说明本发明。
实施例
实施例1：啮齿动物研究
在小啮齿动物模型中证实与安慰剂(未处理)比较，包含所选nmda拮抗剂地塞米诺(也称为hu211)和cb2激动剂大麻二酚(cbd)的组合疗法(组合疗法在本文中称为sp处理)减少爆炸诱发的或震荡性mtbi的神经感觉后遗症的能力。这些研究展示，当与安慰剂比较时，在于爆炸或脑震荡后施用药物时，这种组合疗法能够减少小啮齿动物模型中爆炸诱发的mtbi对脑和听力以及平衡感觉器官的破坏。此外，在sp处理和未处理动物中鉴定到组织学差异。还评定了sp处理相对于未处理动物的任何脂质(lipodemic)特征差异。
有8个初始处理组，每组/每个tbi模型有15只大鼠。三个tbi模型是爆炸暴露(blast)、落重闭合性头部损伤模型(chi)和流体压力损伤模型(fpi)。所述组为：a组(仅sp)，b组(仅载体)，c组(blast+sp)，d组(blast+载体)，e组(chi+sp)，f组(chi+载体)，g组(fpi+sp)和h组(fpi+载体)。每组使用15只大鼠允许检查短期和长期结果。所有组将在暴露前和暴露后第3天和第7天进行感觉运动、认知和工作记忆功能的行为测试、听力测试和平衡测试。在第七天牺牲每组动物的三分之一(每组5只)，并进行肉眼检查和一系列组织化学测试。每组的第二组五只动物将在第14天、第21天和第31天进行行为和听力测试，接着在第31天牺牲，此时将对其进行与第7天动物相同的终末分析。最后五只动物将是长期组，并且将在第3天、第7天、第31天、第61天和第91天进行行为和听力测试，在第91天将其牺牲来用于与前两个时间点组相同的组织学分析。
实施例2：爆炸暴露模型(blast)
啮齿动物爆炸波管暴露：冲击波发生器系统包含三英尺压缩管，该管通过与单个12英尺长×8英寸内径冷凝管对齐而进行压力密封配合。压缩管由工业压缩机充电。液压致动器件将冷凝管的滑动部分通过塑料膜压在压缩管上来密封压缩管。该系统经远程操作来控制压缩室至所选压力，将新膜移动到适当位置，将冷凝管锁合至压缩管以在非爆裂膜上形成气密密封，活化内部电枢以在所选压力下使膜爆裂，并移动新的非爆裂膜至下次爆炸事件的位置。管的输出呈现超音速的friedlander型过压/欠压波，其模拟爆炸性爆炸的冲击压力波。可以产生2磅/平方英寸(psi)或14.5千帕(kpa)至>50psi(0.35兆帕)的过压强度。单次爆炸过压(bop)研究的暴露在10至20psi之间的范围内(取决于关于优化动物测定的初始反应)。将所有动物麻醉并且放置在动物容纳管中，该动物容纳管被插入并且固定在冷凝管末端内一英尺处。动物容纳管将动物放置成大鼠的头部后表面对着即将到来的冲击波。将受试者放置在距离管膜隔片10英尺处，并且将沿正面方向接收bop波。容纳管可将异氟烷气体馈送至动物来诱发麻醉，从而使得暴露于活的但麻醉的动物。使用具有多达32个通道的pacificinstruments6000daq来测量和显示bop波的峰值强度、上升时间和bop波持续时间，其中每个通道具有250khz的记录速度，dytran压力传感器的额定值为0-50psi测量范围，并且电子调节器与电脑连接。暴露将由接受单次爆炸波暴露的麻醉动物组成。初始调查检查了单一10-20psi(friedlander波，过压-欠压工序)的影响，所述影响已经显示展示病理作用(参见balaban等人,jneuroscimethods2016pii:s0165-0270(16)00053-4.doi:10.1016/j.jneumeth.2016.02.001.印刷前电子出版)。
实施例3：闭合性头部损伤模型(chi)
通过先前由foda和marmarou(jneurosurg.199480(2):301-13)描述的方法，使大鼠经历轻度tbi(mtbi)。具体地，将雄性sprague-dawley大鼠在钟罩中用3％异氟烷、70％n2o和30％o2麻醉，直到对爪或尾巴掐捏无反应。初次麻醉后，通过鼻锥以1-2.5％的保持剂量保持动物麻醉。使用无菌眼润滑剂，以便在手术期间眼睛不会干燥。剃刮动物的头部并且用氯己定擦拭。进行切割来暴露颅骨。使用牙科用丙烯酸将钢盘(直径为10mm，并且厚度为3mm)连接到前囟与λ缝合线之间的颅骨上。然后将动物移到创伤器件下的泡沫褥垫(e型聚氨基甲酸酯泡沫)上。使450克的重物通过1米的垂直管自由落下。使用直肠温度探测器监测体温，并且监测颞肌温度作为脑温度的间接量度。假处理动物将进行所有手术程序，但不会经受脑创伤。在损伤后，将动物缝合并使其返回其居住笼，并且随意给予食物和水。如果动物在损伤后难以进食，则对动物实施安乐死。在脑损伤之前和脑创伤后向动物放置尾部动脉导管，将动物插管并且施用罗库溴铵(rocuronium)或泮库溴铵(pancuronium)作为麻痹剂。
实施例4：流体撞击损伤模型(pfi)
在定制的麻醉室中用3％异氟烷麻醉sprague-dawley大鼠来诱导麻醉。进行脚趾掐捏来确定动物被适当麻醉。目视评定动物的呼吸速率。然后通过鼻锥保持异氟烷麻醉，并且将损伤帽如下放置在暴露的硬脑膜上：将大鼠的头部剃刮并用氯己定溶液擦拭；接着将大鼠置于立体定位框架中并且通过手术切开头皮；在前囟后3.8mm和中线外侧2.5mm处使用环钻进行旁矢状开颅术(4.8mm)；接着将无菌塑料损伤管(无菌针的塑料连接器切成1cm长并修整以完全填充开颅术)放置在暴露的硬脑膜上并通过氰基丙烯酸(crynoacrylic)粘着剂粘合到颅骨上；接着将牙科用丙烯酸倒在损伤管周围来获得完全的密封；在丙烯酸硬化后，将损伤管用无菌凝胶泡沫海绵或luer-lok适配器塞住，将头皮订回/缝回；将动物从麻醉中移出并使其返回其居住笼中。
在上述制备后24小时，通过定制的麻醉室用3％异氟烷麻醉大鼠，并且使用脚趾掐捏来确定麻醉水平。将动物置于桌上，并且通过鼻锥施用麻醉，直到放置导管并对动物进行插管。将导管放置在未进行行为测试的那些动物的右股动脉中或放置在进行行为测试的那些动物的尾动脉中来监测动脉血压和血气。通过放置在左颞肌中的热敏电阻间接测量脑温，并在tbi之前和之后保持在正常温度(37℃)水平下。直肠温度也保持在正常温度水平下。插管后，将动物连接到呼吸器，并且用含0.5-1％异氟烷的70％一氧化二氮与30％氧气的混合物通气。用罗库溴铵机械通气使动物麻痹来将动脉血气保持在正常限度内。流体撞击(f-p)器件由有机玻璃(plexiglass)圆柱形储存器组成，该储存器一端由覆盖有橡胶的有机玻璃活塞作边界，相对端配备有转换器外壳(transducerhousing)和适用于大鼠颅骨的中心损伤螺钉。用37℃等渗盐水填充整个系统。接着将无菌金属损伤螺钉牢固地连接到被插管和麻醉的大鼠的塑料损伤管。损伤通过金属摆锤下降撞击活塞诱发，因此向封闭的颅腔中硬膜外注射少量盐水并且神经组织产生短暂的移位(18毫秒)。所得压力脉冲的振幅由压力转换器在大气中测量并且记录在powerlab图表记录系统上。假处理动物将进行所有手术程序，但不会经受f-p脉冲。将研究轻度(1.4-1.6atm)损伤。损伤后，取出导管，并且订合/缝合切口。停止麻醉并且动物在损伤后约30分钟醒来，并且将其放置在单个笼中，随意提供食物和水，直到研究结束。
实施例5：暴露后的饲养
使用starrlifesciences,corp.和脉冲血氧测量法在暴露之前和之后以及暴露后的整个恢复期监测所有动物的呼吸速率、心率和血氧饱和度。如果动物显示极度疼痛的迹象或爆炸暴露后可能不能恢复，则兽医会检查动物。密切观察动物的疼痛迹象，包括发声、食欲、侵犯行为、防护行为和极度激动情况。基于兽医的建议，动物可能会或不会被安乐死。为避免潜在的疼痛反应，将在爆炸暴露后立即给予酮洛芬。从麻醉恢复后立即开始施加疼痛评定。要评定的主要指标是：活动、身体外观、发声、磨牙、喂食/喝水行为以及生理迹象(诸如呼吸速率、心率和氧饱和度)。如果任何指标表明动物仍然在经历疼痛，则递送更高的剂量，或者如果难以控制的话，决不会听任动物疼痛，并且兽医可以决定使大鼠安乐死。按要求缓解疼痛。如果动物显示阻止测试的疼痛水平，则功能测量值的收集可以推迟到第二天。那时，再评估动物的状态，并且测试可以开始或再次延迟。对存活的爆炸暴露动物完成功能和认知测量后，使其安乐死来收集组织、体液和血液。
实施例6：啮齿动物模型的给药方案
暴露后2小时，通过腹膜内(ip)注射以10mg/kgcbd和1mg/kghu211的有效剂量施用sp。每天重复这种剂量，再持续7天。
实施例7：啮齿动物模型的行为测试
感觉运动测试：
自发的前肢使用：schallert和lindner(canjpsychol.199044(2):276-92)描述了这种测试，其通过评估动物在直立或站立时加入其前肢的倾向来评估自愿自发性活动期间的前肢使用。将动物在透明塑料圆筒中录影5分钟。录影带根据在沿着圆筒壁垂直移动期间的前肢使用不对称性以及直立后的着地评定：(a)在完全直立期间独立地使用左侧或右侧前肢来接触圆筒壁以在沿壁以垂直姿势横向移动时引起重量转移移动或重新获得重心；各自以(a)使用同侧(未受损)前肢相对于同侧和对侧放置总数的百分比的方式表示着壁/移动和着地。在直立期间，第一肢以明显重量支撑的方式与墙壁接触(另一肢在0.5秒内不接触壁)被评定为该肢独立壁放置。肢使用比率计算为对侧/(同侧+对侧)。
认知测试：
认知功能的分析包括使用水迷宫评定空间觅向。主要旨在评定动物在tbi后的多个时间点的活动的实验(诸如在评定设计来减轻tbi影响的治疗性处理的功效时)主要依赖于“获取”模式，包括简单的位置任务和工作记忆任务，其中要求动物在各测试阶段期间习得新的平台位置。这种方案不涉及手术前在水迷宫中进行预训练或测试。
使用的水迷宫是一个圆池(直径122cm；深60cm)，其填充有25℃的水，并通过添加两磅白色无毒涂料而变得不透明。迷宫位于安静无窗的室内，提供有各种不同的迷宫外提示。将边缘四点指定为北(n)、东(e)、南(s)和西(w)，其用作起始位置并将迷宫划分为四个象限。将一个圆形平台(直径10cm)放置在水面下1.5cm处，其位置根据任务的要求而变化。动物的移动用记录游泳路径的ccd视频录影。接着用ethovision(noldus)软件程序分析该动物的游泳路径。这个程序确定路径长度、到达平台的时延(秒)、在水迷宫的每个象限花费的时间和游泳速度。
该平台位于迷宫的东北象限。每只动物每天接受四次60秒的试验。如果老鼠成功定位平台，则允许其保持10秒；否则，将其在平台上放置10秒的时段。试验间间隔时间为2至4分钟，在此期间将大鼠置于热灯下。将动物在感觉运动测试后进行测试。
调查试验由移除平台，将动物从西部位置释放并将动物的游泳模式录影60秒组成。一个没有受损的动物应该大部分时间都在以前含有隐藏平台的象限中游泳。
对于工作记忆任务，给予动物60秒来找到淹没(未提示)平台。如果大鼠在60秒内未能找到平台，则将动物放置在平台上10秒。对同一只大鼠试验一次后5秒，进行第二次相同试验。在每对试验之间将大鼠置于加热灯下4分钟。在如上操作这组老鼠之后，将平台移动到迷宫的下一个位置，并且在该位置重复该程序。每天给予每只大鼠五对试验。
在具有两种不同种类的物体的开放场地进行新物体识别任务。两个物体在高度和体积上一致，但形状和外观不同。允许动物探索空的场地，并且在习惯期间，将动物暴露于这个熟悉的场地，其中将两个相同的物体放置在相等距离处。第二天，动物在熟悉的物体和在新物体存在下探索开放场地来测试长期识别记忆。记录探索每个物体所花费的时间和区分指数百分比。
实施例8：啮齿动物模型的听力和平衡测试
听觉脑干反应(abr)：
通过置于头顶(参比)、右乳突(负)和左后肢的皮下铂针电极获得的听性脑干反应来确定听觉阈值。数字产生的刺激信号由1024个3至30khz的特定频率的音调猝发音组成，其中梯形包络为5ms总持续时间。梯形以3ms平稳阶段以及1ms上升和下降来呈现。刺激路线为电脑控制的衰减器至插入式耳机(etymoticresearcher-2)。将插入式耳机的声音传递管与鼓膜相距约5mm来安置。插入式耳机的输出通过测量距离鼓膜4-5mm位置处的声压水平来校准。在45分钟的记录程序期间，将动物放置在塑料约束管中。放大记录电极的电响应(100,000×)，过滤(100-3000hz)，并且送入电脑中信号处理板上的a/d转换器。在每个水平下将八百至一千二百个样品取平均值。刺激以16/秒的速率呈现，并且刺激水平以10db下降步长变化，直到达到阈值，接着是5db上升步长以证实。阈值被定义为看到明显反应的最低水平与看不到反应的下一较低水平之间的中点。abr被确定为可再现的波ii反应。
前庭诱发的肌性电位(vemp)：
在创伤之前和创伤后多个时间点(长达30天)测量前庭肌性电位(cvemp)来测试平衡功能。通过连接于预放大器和数据采集系统(智能听力系统(intelligenthearingsystems))的皮下针电极进行测量。前庭引起的肌性电位(vemp)通过置于颈部肌肉中的皮下电极响应于刺激球囊的声刺激来测量。在记录之后，每15分钟观察动物从麻醉恢复的情况，并且使其每小时走动一次直到其从麻醉中完全恢复并且行为正常。将未处理动物的残留功能与处理动物进行比较。监测潜在的副作用，诸如平衡问题、旋转行为和疼痛。在急性研究中，使动物在24、48和72小时(免疫组织化学和基因表达)或在结论慢性测试(组织学分析)时安乐死。从这些研究中，确定了介入的关键时间、剂量反应和最佳治疗时长。
实施例9：啮齿动物模型中的组织病理学
组织收获：
在行为测试之后，使动物安乐死并且以如下方式收集组织：
对于组织学，在过量给予氯胺酮(150mg/kg)、甲苯噻嗪(10mg/kg)或异氟烷麻醉后，依序用盐水和4％多聚甲醛经心脏灌注大鼠。将头部、肝脏和肾脏取出并后固定在相同固定剂中。将脱钙的头部或提取的脑用于组织病理学分析。
对于质谱法成像，在过量给予氯胺酮(150mg/kg)、甲苯噻嗪(10mg/kg)或异氟烷麻醉后，用盐经心脏灌注大鼠来清洗血液。接着将脑快速取出并冷冻在用固体co2(干冰)冷却的异戊烷中。
对于分子生物学，在过量给予氯胺酮(150mg/kg)、甲苯噻嗪(10mg/kg)或异氟烷麻醉下，将大鼠割去头部，迅速取出诸如脑和肾/肝的组织，在液氮中冷冻，并且储存在-80℃下直至使用。
组织加工组织病理学：
在适当的存活时间后，用戊巴比妥钠(100mg/kg，i.p.)使假处理和创伤暴露大鼠麻醉，并且依序用0.1mpbs和多聚甲醛-赖氨酸-高碘酸盐固定剂经心脏灌注。将完整的头部在室温下在4％多聚甲醛中后固定24小时，在10％甲酸中脱钙至化学品1测试标准并在5％硫酸钠中中和过夜。包埋在石蜡中后，在水平面中以8-10m切割切片。用苏木紫(hematoxylin)和曙红(eosin)将每个第25个切片染色来进行标准组织病理学分析。对于免疫组织化学，将切片组依序在室温下在以下溶液中培育：在含5％正常驴血清(nds)的0.1mpbs中2小时；在含初级抗血清的0.1mpbs中72小时和在0.1mpbs中15分钟。接着用abc过氧化物酶或免疫荧光法观察抗体。用于将经爆炸暴露的脱钙头部的主要抗体包括神经元和非神经元标志物两者，诸如超氧化物歧化酶2、白介素8受体、趋化因子cxc基序受体3血管生成素1、血管内皮生长因子a、tnf-α和基质金属蛋白酶2。
质谱法成像：
使动物在损伤后1、3或7天安乐死。在氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg；10mg/kg)麻醉下，打开每只大鼠的胸部并且通过置于升主动脉中的导管在室温下用50至100ml磷酸盐缓冲盐水灌注，从而使血液从头部通过上腔静脉的开口冲洗。当灌注液大部分没有血液时，小心打开颅骨并解剖脑。去除脑膜后，将每只脑迅速冷冻在含有约30ml冷异戊烷的小烧杯中，然后取出，单独包装在铝箔中并在-80℃下储存直到切片，所述冷异戊烷通过将烧杯浸入固体co2中预冷却。使用低温恒温器(leicamicrosystemscm3050s,bannockburn,il)将脑切成18微米厚的冠状平面。使用纳米颗粒植入器(ionwerks,houston,tx)向组织切片中植入直径6nm的银纳米颗粒(agnp)。使用thermoscientificmaldiltq-xl-orbitrap(thermofisherscientific,sanjose,ca)和xcalibur软件用于基质辅助的激光解吸(maldi)质谱法成像(msi)数据采集。使用定制软件包(ionwerks,houston,tx)，从以正离子和负离子模式收集的数据构建冠状切片的影像，所述软件包输出ms峰值数据来用于在matlab中进一步统计分析。