一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物的制作方法

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物，用于预防和治疗嗜水气单胞菌感染引起的水产动物疾病。

背景技术：

厚朴又名紫朴，是一种常见的中草药，主要分布于我国四川、湖北等地。中药厚朴具有行气化湿、温中止痛等功效，对常见的致病菌具有较强的抑菌作用。木脂体类化合物是厚朴的主要化学成分，其中厚朴酚、和厚朴酚等化合物为产生药理学活性的主要成分。二氢杨梅素是提取自葡萄属植物藤茶的提取物，是一种黄酮类化合物，在抗氧化、抗肿瘤和抗炎等方面有较好的效果。但目前尚未见到有关以二氢杨梅素、和厚朴酚治疗嗜水气单胞菌感染药物的报道。

嗜水气单胞菌是一种广泛分布于自然界中的一种条件性致病菌，是多种水生动物的原发性致病菌，是一种典型的人-兽-鱼共患致病菌。近年来随着人们对水产品消费的日益增加，嗜水气单胞菌感染人的事件时有发生，对人类健康产生了严重的威胁。另一方面，由于近年来水产养殖业的发展导致抗生素类药物在养殖过程中大量使用，导致细菌耐药性加重，因此以抗生素为主的治疗手段面临极大的局限性。因此寻找新的抗菌机制对于水产养殖药物研发刻不容缓。近年来研究发现嗜水气单胞菌分泌的外毒素是其导致各种疾病的主要原因，其中气溶素是嗜水气单胞菌分泌的最重要的毒力因子之一，在其致病过程中起关键作用，不表达气溶素的嗜水气单胞菌的菌株致病力显著下降甚至消失。因此，以气溶素为靶标设计药物对嗜水气单胞菌感染的治疗具有重要的意义。通过本研究发现，二氢杨梅素联合和厚朴酚使用可以降低二氢杨梅素的抑菌浓度，提高抑菌活性，结合和厚朴酚具有抑制气溶素表达的作用，在提高二氢杨梅素抗菌活性的同时通过和厚朴酚降低细菌的致病性，提高感染鱼模型的存活率。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物，所述的药物组合物由二氢杨梅素、和厚朴酚组成，在提高二氢杨梅素抗菌活性的同时通过和厚朴酚降低细菌的致病性。

本发明的另一个目的是在于提供一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物在制备预防或治疗水产动物嗜水气单胞菌的药物中的应用，实验动物模型存活率的影响证实二氢杨梅素联合和厚朴酚可以对水产动物嗜水气单胞菌感染起到治疗作用，该药物具有剂量低、毒副作用小、残留量低、不易产生耐药性等优点，可以作为药物制剂和饲料添加剂。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物由二氢杨梅素、和厚朴酚组成，二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1:2至1:16。

作为优选，抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物中二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1:2至1:8。

作为优选，抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物中二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1:2。

一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物在制备预防或治疗水产动物嗜水气单胞菌的药物中的应用，对于感染嗜水气单胞菌的水产动物可每8h口服给药一次，二氢杨梅素的用量为6.25-50mg/kg，和厚朴酚的用量为100mg/kg，可达到最佳治愈率。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：该组合物使用剂量低，治疗效果好，不易产生耐药性，两种成分均为中药提取物，对鱼体没有毒副作用，没有药物残留的风险。

附图说明

图1为和厚朴酚与二氢杨梅素不同组合方式(单独或联合)对嗜水气单胞菌菌株MS201509的时间杀菌曲线。

图2为和厚朴酚对不同嗜水气单胞菌菌株气溶素溶血活性的作用。

具体实施方式

实施例1：二氢杨梅素与和厚朴酚单独或联合使用对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度测定

采用CLSI推荐的微量稀释法测定二氢杨梅素、和厚朴酚单独或联合使用的最小抑菌浓度(MICs)。本发明中涉及7种不同来源的嗜水气单胞菌菌株均由长江水产研究所保存，名称见表1。其步骤是：

(1)将配置好的药物在96孔细胞培养板中倍比稀释，二氢杨梅素浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL；和厚朴酚浓度分别为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，每孔药物体积100μL；

(2)分别无菌接种嗜水气单胞菌7个菌株的单菌落至MH培养基中30℃培养过夜，离心取菌体用无菌生理盐水调整浓度为0.5麦氏比浊度，然后用培养基稀释至1×10⁶CFU/mL，在96孔细胞培养板中加入菌液，使其最终浓度达到5×10⁵CFU/mL，分别设置阴性和阳性对照组(阴性对照组不加药物不加菌液，阳性对照组只加菌液不加药物)，每个药物重复三次，在30℃生化培养箱中培养18-24h后观察结果，以没有细菌生长的最低药物浓度判定为该药物的最低抑菌浓度。

结果如表1所示，二氢杨梅素、和厚朴酚单独使用对嗜水气单胞菌的MIC范围分别为4-16μg/mL和32-128μg/mL。

表1和厚朴酚与二氢杨梅素(单独或联合)对受试嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度

实施例2：棋盘式微量稀释试验测定二氢杨梅素与和厚朴酚联合使用的作用效果

依据CLSI公布的标准方法测定不同浓度二氢杨梅素联合和厚朴酚对嗜水气单胞菌Ah01的抑制作用。其步骤是：

(1)分别将两种用于试验的不同药物组合在无菌离心管中倍比稀释，使二氢杨梅素浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL；和厚朴酚浓度分别为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL，然后分别向96孔细胞培养板中各加入50μL的二氢杨梅素、和厚朴酚，使二氢杨梅素浓度从左到右(1-10)依次降低，和厚朴酚浓度从上到下(A-H)依次降低；

(2)加入嗜水气单胞菌菌液100μL到96孔细胞培养板中，使菌液终浓度为5×10⁵CFU/mL，分别设置阴性和阳性对照组(阴性对照组不加药物不加菌液，阳性对照组只加菌液不加药物)，每个药物重复三次，在30℃生化培养箱中培养18-24h后观察结果，记录药物联合应用以后两者的MIC值；药物联合使用以后的抗菌活性通过抑菌浓度指数FICI(fractioanl inhibitory concerntration index)进行评价：FICI＝MICA药联合/MICA药单独+MICB药联合/MICB药单独。FICI≤0.5时判定为协同作用(Synergism,SYN)；0.5＜FICI≤4时判定为无关作用(indifference,IND)；FICI＞4时判定为为拮抗作用(antagonism,ANT)。

如表1所示，两种药物联合使用后二氢杨梅素MIC范围为1-16μg/mL，和厚朴酚MIC范围为8-32μg/mL。除IHB01菌株外，和厚朴酚联合二氢杨梅素在体外具有协同抑菌作用，可以降低两种药物的使用量，降低毒副作用和残留量。根据表1得到的联合用药MIC浓度数据可知，两种药物联合使用后组合中二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1：2，1：4，1：8，1：16，四种不同组合对除IHB01以外的6个嗜水气单胞菌菌株具有协同抑菌作用。具有协同抑菌作用的药物浓度组合可以对嗜水气单胞菌具有较强的抑制作用，有利于降低药物使用浓度，提高作用效果，可以作为备选的药物浓度组合。根据此方案初步确定该组合物中二氢杨梅素与和厚朴酚质量浓度比为1:2至1:16。

实施例3：测定时间杀菌曲线进一步验证不同组合的二氢杨梅素与和厚朴酚联合使用的协同效应

为了验证实施例2中所得到的协同效应，根据试验方法要求取具有协同效应的联合用药后二氢杨梅素与和厚朴酚浓度比为1：2，1：8，1：16的药物组合，将MS201509菌株作为代表菌株进行时间杀菌曲线测定。细菌培养至OD600约为0.3时分装为4瓶，每瓶10mL，分别加入以下组合的药物：1/2MIC和厚朴酚、1/2MIC二氢杨梅素、1/2MIC和厚朴酚+1/2MIC二氢杨梅素、阴性对照，详见表2。30℃振荡培养，分别于0、12、24、36和48h取菌液并稀释后涂板，用计数器计数。判定标准：联合用药组细菌数的对数比活性较强的药物组细菌数的对数下降大于等于2时判定为具有协同抑菌作用。如图1所示，组合A(二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1：2)对MS201509菌株在24h后出现协同抑菌作用，组合B(二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1：8)对MS201509在48h后出现协同抑菌作用，组合C(二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1：16)对MS201509在24h后出现协同抑菌作用。由此结果可以看出，三种不同组合物对MS201509菌株均具有协同抑菌作用。该方案再次验证当组合物中二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1:2至1:16时，这两种药物具有协同抑菌作用。

表2时间杀菌曲线不同组合药物浓度表

注：根据J Antimicrob Chemother等杂志报道，时间杀菌曲线试验时两种药物添加到各个试验组的浓度为单独使用时测的MIC的1/2，而并非联合使用后的MIC，因此此处使用的药物比例及浓度与组合名称中的比例不相对应。文献：Synergistic Activity of Econazole-Nitrate and Chelerythrine against Clinical Isolates of Candida albicans,Iranian Journal of Pharmaceutical Research(2014),13(2):567-573.；Comparative evaluation of synergy of combinations ofβ-lactams with fluoroquinolones or a macrolide in Streptococcus pneumonia,J Antimicrob Chemother 2011；66:845–849.

实施例4：和厚朴酚对嗜水气单胞菌上清液溶血活性的影响

将不同来源的细菌培养至OD600约为0.3时分装为5瓶，分别加入和厚朴酚使其浓度达到16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL和0μg/mL。继续培养至OD600为2.0时收集菌液，12000rpm离心1min取上清测定上清液的溶血活性。如图2所示，随着和厚朴酚浓度的增加上清液的溶血作用逐渐减弱，呈显著的剂量依赖性，且该药物具有广谱性，对所有试验菌株均有效。通过溶血实验结果可以发现和厚朴酚通过抑制嗜水气单胞菌溶血性毒素的表达降低其致病性，和厚朴酚浓度越高其对嗜水气单胞菌致病因子的抑制作用越强，因此在组合中提高和厚朴酚的比例可以起到更好的治疗效果。

实施例5：和厚朴酚联合二氢杨梅素对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染的实验治疗

试验在100cm×50cm×60cm的水族箱中进行，每天换水并保持水温在25℃左右。200g左右的健康斑点叉尾鮰经麻醉后通过腹腔注射嗜水气单胞菌Ah01建立人工感染模型。人工感染后2h开始对感染鱼灌服以下药物组合(见表3)，每8h给药一次。阳性对照组灌服相同体积的生理盐水作为对照。每组使用斑点叉尾鮰20尾，感染后开始记录死亡情况，结果见表4。该结果表明，人工感染嗜水气单胞菌的斑点叉尾鮰经二氢杨梅素、和厚朴酚药物不同比例组合药物治疗后可以显著降低因细菌感染造成的死亡率，其存活率高于单独使用和厚朴酚或二氢杨梅素。通过动物模型试验确定当组合物中二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比为1:2 至1:16时，对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染有治疗作用。为了提高治疗效果，二氢杨梅素与和厚朴酚的质量浓度比优选1:2至1:8，浓度比为1:2时对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染的治疗效果最佳。

表3动物模型试验中不同组合药物浓度表

注：为了减少试验分组，两种药物单独使用时均采用最高浓度。

表4不同药物组合对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染死亡率的影响