本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种胶原-羟基磷灰石人工骨的制备方法。
背景技术：
骨缺损是骨外科、头颈外科、整形外科等的常见病症之一，它们不但会导致患者生 理功能发生严重障碍，还会严重影响患者的外观形象，给患者造成沉重的精神负担，目前， 临床工作中常采用骨移植进行修复。为此，国内外学者研究了众多的骨替代材料。 但是由于各方面的缺陷，这些材料不能完全满足临床修复的要求。
生物相容性和可降解性是衡量骨修复材料是否优异的重要指标。壳聚糖是天然的生物材料，带正电荷，其结构与细胞外基质中的主要成分—糖胺聚糖十分类似，其降解产物对人体无毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。聚乳酸是一种高分子材料，用聚乳酸良好的加工性和优良的柔韧性和断裂伸长性可以弥补磷灰石的不足，是一种新型的生物降解材料。纳米纤维素具有很多优良的性能，如高纯度、高结晶度、高杨氏模量，还具有高强度、高生物降解性和良好的生物相容性等，能够弥补复合材料仍然存在机械性能差、孔隙率低、孔隙交通性能差的缺点。角蛋白是构造头发、羊毛、指甲等的结构纤维状蛋白，并已证明其对成纤维细胞和成骨细胞的生长有促进作用。此外，它们在体外 (通过胰蛋白酶)和在体内是可以生物降解的。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种胶原-羟基磷灰石人工骨的制备方法。本发明将胶原蛋白、角蛋白、羟基磷灰石、纳米纤维素和壳聚糖进行复合，制得的胶原-羟基磷灰石人工骨具有良好的机械性能、可降解性和生物相容性，能更好地促进骨髓间充质干细胞的黏附与增殖，为骨髓间充质干细胞提供了更适于其生长的空间结构与环境。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种胶原-羟基磷灰石人工骨的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将聚乳酸用溶剂配制成1~3wt%的溶液；
（2）制备壳聚糖，并将制得的壳聚糖用稀醋酸配制成0.02~0.05wt%的溶液；
（3）用蒸馏水分别配制浓度为8~12g/L的胶原蛋白溶液和浓度为1~5g/L的角蛋白溶液；
（4）将羟基磷灰石加入到8~12g/L的胶原蛋白和1~5g/L的角蛋白的混合溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联2小时得混合溶液A，冷冻干燥制得胶原蛋白、角蛋白和羟基磷灰石质量比为0.4~0.6:0.15~0.25:1的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A总质量的1~1.5wt%；
（5）将步骤（4）制得的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末按照质量比为1:10的比例分散到步骤（2）配制的壳聚糖溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，随后加入8~12g/L的胶原蛋白溶液和1~5g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联12小时得混合溶液B；所述胶原蛋白溶液占混合溶液B总质量的15~20wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的6~10wt%，京尼平水溶液占混合溶液B总质量的0.5~1wt%；
（6）将步骤（5）得到的混合溶液B冷冻干燥成复合粉末后，将所得复合粉末B与纳米纤维素加入到步骤（1）配制的聚乳酸溶液中，搅拌共混后经冷冻干燥、研磨后制得所述胶原-羟基磷灰石人工骨；所述复合粉末B、纳米纤维素和聚乳酸溶液的质量比为7~9:0.5~1:3~5。
步骤（1）所述溶剂为四氢呋喃。
步骤（2）中所述壳聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取橡胶木犀金龟成虫，用水洗干净后进行冷冻干燥，粉碎并过25目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15， 40℃下搅拌6小时，随后离心分离20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为7.5，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度50℃下反应8h，随后离心分离20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明将胶原蛋白、角蛋白、羟基磷灰石、纳米纤维素和壳聚糖进行复合，制得的胶原-羟基磷灰石人工骨具有良好的机械性能、可降解性和生物相容性，能更好地促进骨髓间充质干细胞的黏附与增殖，为骨髓间充质干细胞提供了更适于其生长的空间结构与环境；
（2）本发明的壳聚糖制备中的脱乙酰过程采用微波法与酶解法相结合，避免了使用高浓度碱液造成的污染及浪费，通过微波先脱去部分乙酰基，同时使得化学键以及取代位点活化，随后在甲壳素脱乙酰酶作用下发生发应，大大提高了脱乙酰度，脱乙酰度高达96.7%，获得了良好品质的壳聚糖，其在本发明人工骨合成过程中起到了良好的分散作用，对羟基磷灰石的结晶起着电位互补作用。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种胶原-羟基磷灰石人工骨的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将聚乳酸用四氢呋喃配制成1wt%的溶液；
（2）制备壳聚糖，并将制得的壳聚糖用稀醋酸配制成0.02wt%的溶液；
（3）用蒸馏水分别配制浓度为8g/L的胶原蛋白溶液和浓度为1g/L的角蛋白溶液；
（4）将羟基磷灰石加入到8g/L的胶原蛋白和1g/L的角蛋白的混合溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联2小时得混合溶液A，冷冻干燥制得胶原蛋白、角蛋白和羟基磷灰石质量比为0.4:0.15:1的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A总质量的1wt%；
（5）将步骤（4）制得的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末按照质量比为1:10的比例分散到步骤（2）配制的壳聚糖溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，随后加入8g/L的胶原蛋白溶液和1g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联12小时得混合溶液B；所述胶原蛋白溶液占混合溶液B总质量的15wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的6wt%，京尼平水溶液占混合溶液B总质量的0.5wt%；
（6）将步骤（5）得到的混合溶液B冷冻干燥成复合粉末后，将所得复合粉末B与纳米纤维素加入到步骤（1）配制的聚乳酸溶液中，搅拌共混后经冷冻干燥、研磨后制得所述胶原-羟基磷灰石人工骨；所述复合粉末B、纳米纤维素和聚乳酸溶液的质量比为7:0.5:3。
实施例2
一种胶原-羟基磷灰石人工骨的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将聚乳酸用四氢呋喃配制成3wt%的溶液；
（2）制备壳聚糖，并将制得的壳聚糖用稀醋酸配制成0.05wt%的溶液；
（3）用蒸馏水分别配制浓度为12g/L的胶原蛋白溶液和浓度为5g/L的角蛋白溶液；
（4）将羟基磷灰石加入到12g/L的胶原蛋白和5g/L的角蛋白的混合溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联2小时得混合溶液A，冷冻干燥制得胶原蛋白、角蛋白和羟基磷灰石质量比为0.6:0.25:1的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A总质量的1.5wt%；
（5）将步骤（4）制得的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末按照质量比为1:10的比例分散到步骤（2）配制的壳聚糖溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，随后加入12g/L的胶原蛋白溶液和5g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联12小时得混合溶液B；所述胶原蛋白溶液占混合溶液B总质量的20wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的10wt%，京尼平水溶液占混合溶液B总质量的1wt%；
（6）将步骤（5）得到的混合溶液B冷冻干燥成复合粉末后，将所得复合粉末B与纳米纤维素加入到步骤（1）配制的聚乳酸溶液中，搅拌共混后经冷冻干燥、研磨后制得所述胶原-羟基磷灰石人工骨；所述复合粉末B、纳米纤维素和聚乳酸溶液的质量比为9:1:5。
实施例3
一种胶原-羟基磷灰石人工骨的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将聚乳酸用四氢呋喃配制成2wt%的溶液；
（2）制备壳聚糖，并将制得的壳聚糖用稀醋酸配制成0.03wt%的溶液；
（3）用蒸馏水分别配制浓度为10g/L的胶原蛋白溶液和浓度为3g/L的角蛋白溶液；
（4）将羟基磷灰石加入到10g/L的胶原蛋白和3g/L的角蛋白的混合溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联2小时得混合溶液A，冷冻干燥制得胶原蛋白、角蛋白和羟基磷灰石质量比为0.5:0.2:1的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A总质量的1.2wt%；
（5）将步骤（4）制得的胶原蛋白/角蛋白/羟基磷灰石复合粉末按照质量比为1:10的比例分散到步骤（2）配制的壳聚糖溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，随后加入10g/L的胶原蛋白溶液和3g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交联12小时得混合溶液B；所述胶原蛋白溶液占混合溶液B总质量的18wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的8wt%，京尼平水溶液占混合溶液B总质量的0.8wt%；
（6）将步骤（5）得到的混合溶液B冷冻干燥成复合粉末后，将所得复合粉末B与纳米纤维素加入到步骤（1）配制的聚乳酸溶液中，搅拌共混后经冷冻干燥、研磨后制得所述胶原-羟基磷灰石人工骨；所述复合粉末B、纳米纤维素和聚乳酸溶液的质量比为8:0.7:4。
实施例1~3的步骤（2）中所述壳聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取橡胶木犀金龟成虫，用水洗干净后进行冷冻干燥，粉碎并过25目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15， 40℃下搅拌6小时，随后离心分离20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为7.5，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度50℃下反应8h，随后离心分离20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖。
胶原-羟基磷灰石人工骨性能测试实验
1. 机械性能测试
①根据 GB1040-79 分别将羟基磷灰石颗粒（对比例），以及实施例1~3得到的胶原-羟基磷灰石人工骨制成弯曲强度测试试样。用Instron1341材料试验机对试样进行弯曲性能测试，试样检测环境为：加载速度10mm/分钟，室温：25℃，湿度：65％，
计算公式：，
其中-弯曲强度，MPa；P-破坏载荷，N；L-试样的跨距，mm；b-试样宽度，mm；h-试样厚度，mm。
②根据 GB1040-79 分别将羟基磷灰石颗粒（对比例），以及实施例1~3得到的胶原-羟基磷灰石人工骨制成拉伸强度测试试样。用Instron1341材料试验机对试样进行拉伸强度性能测试，试样检测环境为：加载速度10mm/分钟，室温：25℃，湿度：75％，
计算公式：，
其中-拉伸强度，MPa；P-破坏载荷，N；a-试样的中间宽度，mm；h-试样厚度，mm。
弯曲强度和拉伸强度的具体测试结果如表1所示：
表1 胶原-羟基磷灰石人工骨的机械强度
从表1可以看出，与对比例相比，本发明的胶原-羟基磷灰石人工骨弯曲强度和拉伸强度都有了显著提高。
2. 体外降解实验
将实施例1~3的胶原-羟基磷灰石人工骨制成圆形样品，所有样品 (Φ10mm×13mm) 放入pH值为7的模拟体液SBF溶液中，于37℃的恒温摇床内，低速摇动，每隔7-10d取出，放于烘箱内40℃干燥、称重。
溶胀过程中样品的质量损失率为：，
式中：m1为降解前的质量；m2为降解后的质量；结果表明材料的抗压强度较高、3个月后质量损失率较低，弥补了单用亲水性的胶原蛋白、角蛋白和壳聚糖降解速度过快的缺点，满足骨修复所达到的要求。
3. 生物相容性研究
当胶原蛋白、角蛋白、羟基磷灰石、纳米纤维素和壳聚糖复合时，能更好地促进骨髓间充质干细胞的黏附与增殖，为骨髓间充质干细胞提供了更适于其生长的空间结构与环境。
4. 壳聚糖脱乙酰度的测试实验
采用简单的滴定分析方法测定壳聚糖的脱乙酰度。称取制备的壳聚糖（mg），加入v1 mL 0.1mol/L HCl溶液，溶解后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定过量的HCl溶液，消耗NaOH的体积v2，根据下面的公式计算出壳聚糖脱乙酰度。
式中，c1为HCl标准溶液的浓度，v1为加入HCl的体积，c2为NaOH标准溶液的浓度，v2为加入NaOH的体积，m为壳聚糖的质量，M（-NH2）为-NH2的质量摩尔浓度，W（-NH2）为-NH2的质量百分数。
测试得本发明制得的壳聚糖的脱乙酰度为96.7%，粘度为342 mPa•S，说明获得了良好品质的壳聚糖，其在本发明人工骨合成过程中起到了良好的分散作用，对羟基磷灰石的结晶起着电位互补作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。