本发明属于粒毛盘菌胞内黑色素在制药中的应用技术领域，具体涉及菌种保藏编号为cctccno:m2011054的粒毛盘菌的胞内黑色素(简称lim30)作为治疗急性肝损伤药物的应用。
背景技术：
急性肝损伤是一种严重的临床综合征，可在短时间内损害肝功能并导致肝细胞死亡。细菌脂多糖(lps)与d-氨基半乳糖(d-galn)引起的急性肝损伤通常伴随大量的炎症反应，临床上使用的治疗药物如地塞米松是一类糖皮质激素，可以快速有效的起到抗炎功效，但是长时间使用易引起不良反应，如类肾上腺皮质亢进综合征，还可能会进一步加重病情。因此，从天然产物中寻找急性肝损伤的治疗药物具有重要的意义。
黑色素广泛分布在生物界。据《色素细胞研究》(pigmentcellresearch，2005,18(2):130–135.)介绍，黑色素是由多羟基酚、多羟基吲哚与吡咯氧化而成的构造不规则的化合物。本发明人课题组于2011年3月2日已将一种粒毛盘菌菌株保藏于武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2011054，已收到保藏菌株成活的证明通知；并公开了名称为“一种水溶性粒毛盘菌黑色素及其作为促排铅药物的用途”、专利申请号为zl201410306301.7的发明专利，该粒毛盘菌黑色素具有促排铅功效。《国际生物大分子》(internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2014,63:170-176.)报道了一种粒毛盘菌黑色素lem404的提取方法，并发现其具有抗辐射活性。但至今未见有文献公开提及将粒毛盘菌黑色素作为对lps/d-galn诱导的小鼠急性肝损伤的保护剂方面的应用报道。
技术实现要素：
本发明提供一种粒毛盘菌胞内黑色素作为急性肝损伤的抗炎保肝药物的用途，以满足人们对抗炎保肝药物的需求。
本发明粒毛盘菌胞内黑色素作为急性肝损伤药物的用途，其特征在于：所述粒毛盘菌胞内黑色素，是将菌种保藏编号为cctccno:m2011054的粒毛盘菌的菌株子实体接种于发酵罐，培养基配方为：葡萄糖20g/l，酵母膏5.0g/l，蛋白胨5.0g/l，ph自然，装料系数体积比为0.7，接种量体积比为5％，培养温度为28℃，通气量为1.0l/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为12d；将发酵液抽滤，收集菌丝体，60℃烘干，按菌丝体的质量(g)与浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液的体积(ml)比为1:50(g/ml)混匀，室温静置24h，抽滤得浸提液；向上述浸提液加入浓度1mol/l的hcl调节ph为1～2，静置12h后将上述悬浮液离心，所得到的沉淀经去离子水洗涤至ph为7后，真空冷冻干燥，即得黑色素粗品；再将该黑色素粗品加入6mol/lhcl后于100℃酸解6h。酸解后，抽滤得沉淀，沉淀经双蒸水洗涤至上清液ph值为7时重新溶于0.5mol/lnh3·h2o溶液，水浴蒸去nh3至溶液ph为中性后，依次经氯仿、乙酸乙酯萃取，加入无水乙醇，旋转蒸发除去有机相，使用200da透析袋流水透析48h，去离子水透析24h，真空冷冻干燥，所得到的粒毛盘菌胞内黑色素lim30(本发明人课题组自己的命名代码)，通过将该粒毛盘菌胞内黑色素lim30对lps/d-glan诱导的急性肝损伤治疗作用的药理实验，确认其具有抗炎保肝活性，并确定其有效剂量，从而将其用于治疗急性肝损伤的抗炎保肝药物----可按药剂学的常规制备方法，将有效量的粒毛盘菌胞内黑色素lim30与药用辅料混合，加工制备成片剂或胶囊。
本发明通过药理学试验，首次证实粒毛盘菌胞内黑色素lim30可以通过降低炎性因子水平、提高抗炎因子水平、降低炎性介质水平达到抗炎保肝的作用，并且无毒，该种药物可以通过胶囊、片剂形式给药，是一种优良的抗炎保肝药物。同时，使用粒毛盘菌发酵生产，为大规模生产该黑色素及相关产品提供可能，不产生污染，能产生较好的规模效益。
附图说明
图1给出了作比较的小鼠肝脏组织病理学检查放大400倍的光学显微镜照片(400×)。
具体实施方式
实施例1：
(一)粒毛盘菌胞内黑色素lim30的制备
将本发明人课题组2011年3月2日保藏于武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为cctccno:m2011054的粒毛盘菌的菌株子实体接种于发酵罐，培养基配方为：葡萄糖20g/l，酵母膏5.0g/l，蛋白胨5.0g/l，ph自然，装料系数体积比为0.7，接种量体积比为5％，培养温度为28℃，通气量为1.0l/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为12d；将发酵液抽滤，收集菌丝体，60℃烘干，按菌丝体的质量与浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液体积比为1:50混匀，室温静置24h，抽滤得浸提液；向上述浸提液加入1mol/lhcl调节ph为1～2，静置12h后将上述悬浮液离心，所得到的沉淀经去离子水洗涤至ph为7后，真空冷冻干燥，即得黑色素粗品；再将该黑色素粗品加入6mol/lhcl后于100℃酸解6h。酸解后，抽滤得沉淀，沉淀经双蒸水洗涤至上清液ph值为7时重新溶于0.5mol/lnh3·h2o溶液，水浴蒸去nh3至溶液ph为中性后，依次经氯仿、乙酸乙酯萃取，加入无水乙醇，旋转蒸发除去有机相，使用200da透析袋流水透析48h，去离子水透析24h，真空冷冻干燥，即得到粒毛盘菌胞内黑色素lim30(本发明人课题组自己命名的名称代码)。
(二)药理实验
(1)实验小鼠选用雄性昆明小鼠(20±2g)在室温25±1℃下在12h光照/黑暗循环下饲养在动物护理设施中，并给予自由饮食和饮水。在治疗之前，将小鼠放置7d以适应新的环境。
(2)模型药物为脂多糖(lps)，d-氨基半乳糖(d-galn)；阳性药物为地塞米松注射液(购自江西博莱大药厂)。
(3)将小鼠随机分为以下7组：
正常组：生理盐水，灌胃；
模型组：500mg/kgd-galn+25μg/kglps，腹腔注射；
阳性组：lps+galn+地塞米松1mg/kg，腹腔注射；
lim30低剂量实验组：(50mg/kglim30，灌胃)+(lps+d-galn，腹腔注射)；
lim30高剂量实验组：(100mg/kglim30，灌胃)+(lps+d-galn，腹腔注射)；
lim30低剂量对照组：50mg/kglim30，灌胃；
lim30高剂量对照组：100mg/kglim30，灌胃。
所有组每天灌胃一次，连续7d。在第7d灌胃后1h腹腔内注射溶解在生理盐水中的lps、d-galn，注射阳性药物。5h后，眼球取血，收集血清和肝组织用于随后的分析。
(4)检测指标有：
小鼠体重和器官指数测定：
称量小鼠体重；小鼠取血后处死，取其肝脏、脾脏及胸腺并称重，分别计算脏器指数。脏器指数＝脏器质量/体质量×100。
小鼠生化指标测定：
血清谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、inos合酶(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-8(il-8)、白介素-1β(il-1β)、白介素-4(il-4)、白介素-10(il-10)、no含量和肝脏核转录因子kappab(nf-κb)含量(试剂盒购自上海研生生物技术有限公司)。no的含量通过格瑞斯(griess)比色反应检测和定量。
肝脏病理学观察：
将肝组织在10％多聚甲醛中固定48h，并包埋在石蜡中并切成5μm切片。然后切片进行h&e染色，并通过光学显微镜观察
(5)采用spss17软件对所有实验数据进行分析。多组之间进行邓肯多重范围检验(duncan'smultiple-rangetests)，p<0.05即为差异显著，相同字母间差异不显著。实验结果用
(三)药理实验结果：
(1)lim30对小鼠体重和器官指数的影响
如表1所示，小鼠的体重范围在45.77±3.33与41.66±3.67之间，实验组与模型组小鼠体重整体小于正常组体重，但各组小鼠体重之间并无显著性差异。小鼠肝脏指数范围在4.65±0.22到5.74±0.10之间，由表1可以看出模型组肝脏指数显著高于正常组小鼠(p<0.05)，lim30实验组肝脏指数高于正常组小鼠，但并不具备显著性差异。各组脾脏、胸腺指数均有不同程度升高。
表1lim30预处理对小鼠体重及器官指数的影响
(2)lim30对小鼠血清alt和ast含量的影响
如表2所示，建模后小鼠血清中alt和ast的含量显著升高(p<0.05)，表明本研究中lps/d-galn联合诱导的急性肝损伤小鼠模型建立成功。通过表2我们可以看出，lim30实验组可以有效降低血清中alt和ast的含量，且呈剂量依赖性。lim30对照组与正常组相比alt和ast略有升高但并无统计学差异。
表2lim30对小鼠血清中alt和ast的含量的影响
(3)lim30对小鼠血清炎性因子的影响
如表3所示，与正常组相比模型组中tnf-α、il-1β和il-8水平均显著升高(p<0.05)，lim30实验组显著降低了小鼠血清中炎性因子的含量(p<0.05)并呈剂量依赖性。
表3lim30对小鼠血清炎性因子的影响
(4)lim30对小鼠血清抗炎因子的影响
如表4所示，各组il-4水平均高于正常组，模型组小鼠血清中il-4含量高于正常组，lim30对照组小鼠血清中含量高于正常组，但并不具有显著性。lim30实验组小鼠血清中il-4含量显著高于模型组(p<0.05)。如图所示，模型组小鼠血清中il-10的含量高于正常组小鼠。各治疗组小鼠血清中il-10含量略高于模型组小鼠。
表4lim30对小鼠血清抗炎因子的影响
(5)lim30对小鼠血清inos和no的影响
结果如表5所示，炎症肝损伤模型组血清中no、inos含量与正常对照组相比，有显著性增加(p<0.05)；lim30实验组小鼠血清中的no、inos含量与模型组相比，有显著性减少(p<0.05)，其中高剂量组效果优于低剂量组。
表5lim30对小鼠血清inos和no的影响
(6)lim30对小鼠肝脏nf-κb的影响
结果如表6所示，肝损伤模型小鼠肝脏nf-κb含量较正常组相比有显著增加，lim30实验组对比于模型组小鼠肝脏nf-κb含量均有显著降低(p<0.05)。lim30对照组nf-κb的含量与正常组相比有略微降低但并不具有显著性。
表6lim30对小鼠肝脏nf-κb的影响
(7)小鼠肝脏组织病理学观察
(8)图1给出了作比较的小鼠肝脏组织病理学检查放大400倍的光学显微镜照片(400×)，按从左至右、从上到下的排列顺序，依次分别为正常组、模型组、lim30低剂量实验组、lim30高剂量实验组、lim30低剂量对照组、lim30高剂量对照组的小鼠肝脏组织的图片。由图1中的照片作相互比较可见，正常组小鼠肝脏组织形态均一，结构较为清晰，细胞核，无变性及坏死，无炎性细胞浸润，无坏死及淤血等现象；从模型组的照片中可见有大量炎性细胞浸润，肝细胞索成条状或者片状排列，部分肝细胞水样性变，肝窦扩张，可见嗜酸性变，可见明显小灶性坏死，可见细胞核浓缩，可见明显充血淤血现象；从实验组的照片可见症状有明显减轻，但与正常组相比仍有明显变化；对照组的照片与正常组对比无差异。
(9)药理学总结：
lps/d-galn诱导的急性肝损伤模型是一种广泛使用的用于研究保肝护肝药物的模型。lps是革兰氏阴性细菌外膜的组成部分，是一种用于免疫炎症研究的物质。d-galn是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，在肝脏中通过半乳糖途径代谢消耗尿苷二磷酸从而影响尿嘧啶核苷的代谢，并干扰rna和蛋白质的合成，使肝细胞的功能出现损伤。
血清中alt、ast含量是常用的检测肝脏损伤程度的指标，本研究发现，建模后小鼠血清alt、ast含量远高于正常组小鼠，而lim30实验组可显著降低该值水平并呈剂量依赖效应，从肝脏病理学观察中也可看出lim30实验组改善了炎性细胞浸润和小造性坏死，说明lim30可以改善模型药物对小鼠造成的肝损伤。
lps/d-galn已被证明可以诱导炎性细胞释放各种炎性因子并引起肝细胞损伤。本研究对模型下小鼠体内nf-κb、炎性因子tnf-α、il-1β、il-8，抗炎因子il-4、il-10，炎症相关因子no、inos水平进行研究，发现lim30可以显著降低模型药物引起nf-κb、炎性因子及炎症相关因子的升高，一定程度提升抗炎因子il-4、il-10的含量，减轻肝脏损伤。说明lim30对lps/d-galn诱导的小鼠急性肝损伤有一定治疗作用。
(四)粒毛盘菌胞内黑色素lim30制剂的加工
1.片剂加工：
将450-550g粒毛盘菌胞内黑色素lim30与药用辅料稀释剂428-451g、助流剂45-65g混匀后280-580ml乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒最后加入润滑剂4-7g混匀后压片，制成1000片片剂。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌
本发明推荐的片剂加工的优选例为：取过80～100目筛的粒毛盘菌胞内黑色素520g、稀释剂糊精238g、助流剂滑石粉36g，混合均匀后加700ml乙醇混合均匀制得软材，软材过筛后干燥整粒，加入润滑剂硬脂酸镁6g混匀后压片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。
2.胶囊剂加工：
将药用辅料稀释剂200-270g、助流剂30-60g、润湿剂10-15g混匀后分别与300-600g的粒毛盘菌胞内黑色素lim30混合均匀，装入空心胶囊，制得胶囊剂1000粒。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。
本发明推荐的胶囊剂加工优选例为：取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉37g，润湿剂十二烷基硫酸钠13g混合均匀再分别与500g粒胞内黑色素lim30混合均匀后装空心胶囊1000粒，黑色素含量0.5g/粒。