一种雷公藤红素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种雷公藤红素的应用，特别涉及雷公藤红素用于制备治疗及延缓椎间盘退变药物中的应用。

(二)

背景技术：

下腰痛是骨科常见疾病，好发于40岁到80岁人群。严重下腰痛可使患者失去工作能力，给社会和家庭造成严重负担。40％以上的下腰痛是由椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,ivdd)引起。但是目前为止，临床上尚无针对椎间盘退变的治疗药物可用。

椎间盘退变可由多种因素引起，如异常受力、局部营养缺乏以及先天基因异常等，其中炎症是椎间盘退变最重要的致病机制之一。由炎症因子介导的髓核细胞过度凋亡被认为是椎间盘退变进程中重要的一环，因此针对髓核细胞凋亡的研究可能是治疗椎间盘退变的重要途径。

雷公藤红素(celastrol)是一种广泛存在于卫矛科植物雷公藤、南蛇藤以及独子藤等内的三萜类化合物。雷公藤红素在多项药理学研究中展示出了良好的生物活性，例如抗肿瘤、免疫抑制、抗神经退行性疾病等。但是其对椎间盘退变疾病是否具有治疗作用尚不清楚。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种雷公藤红素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用。相比西药较大的副作用，雷公藤红素作为一种中药，可以更加温和地缓解椎间盘退变。此新功效的发现，也推动了我国中医药事业的发展。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种雷公藤红素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，所述雷公藤红素(cel)分子结构式为式(ⅰ)所示：

进一步，所述药物还包括药用载体，所述药用载体为微乳、纳米脂质体等。

进一步，所述药物为片剂、乳剂、胶囊等。

进一步，所述药物中雷公藤红素的用量为4mg/kg～0.213g/g的用量为4mg/kg～0.213g/g，优选含量为纳米脂质体4mg/kg、微乳(油酸乙酯)0.213g/g。所述雷公藤红素的用量为1～3mg/kg体重。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：雷公藤红素作为一种具有良好的生物活性的植物提取物，具有用药剂量低，抗炎效果明显的特点。相比西药，雷公藤红素作为一种中药，其抗炎作用比较缓和，可以为椎间盘退变疾病的综合治疗提供一种替代治疗药物。

(四)附图说明

图1雷公藤红素对大鼠尾椎椎间盘退变针刺模型的治疗效果的磁共振对照图；2w是指培养2周，6w代表培养6周，control为对照，idd为椎间盘退变组，cel为椎间盘退变+雷公藤红素组。

图2雷公藤红素的cck8药物毒性试验对照图。

图3雷公藤红素在缓解il-1β对髓核细胞功能指标影响的qpcr试验对照图；a为mmp3在mrna水平的表达情况；b为mmp9在mrna水平的表达情况；c为mmp13在mrna水平的表达情况；d为adamts-4在mrna水平的表达情况；e为adamts-5在mrna水平的表达情况。

图4髓核细胞在il-1β刺激下，雷公藤红素改善其细胞外基质合成功能的对照图；a为ii型胶原在mrna水平的表达情况；b为蛋白聚糖在mrna水平的表达情况；c为ii型胶原(collagenii)在蛋白水平的表达荧光图；d为蛋白聚糖(aggrecan)在蛋白水平的表达荧光图。

图5雷公藤红素在缓解il-1β对髓核细胞炎性指标影响的qpcr、elisa和westernblot试验对照图；a为il-6在mrna水平的表达情况；b为tnf-α在mrna水平的表达情况；c为il-6在细胞外的分泌情况；d为tnf-α和il-6在蛋白水平的表达情况；e为tnf-α和β-actin灰度值比值统计图；f为il-6和β-actin灰度值比值统计图；g为cox-2在mrna水平的表达情况；h为inos在mrna水平的表达情况。

图6髓核细胞在il-1β刺激下，雷公藤红素对其nf-κb通路的westernblot试验对照图；a为nf-κb信号通路在蛋白水平的表达情况；b为p-p65与p65灰度值比值的统计图；c为p-iκbα与β-actin灰度值比值的统计图；d为iκbα与β-actin灰度值比值的统计图。

图7髓核细胞在il-1β刺激下，雷公藤红素对p65入核情况的细胞免疫荧光试验对照图；p65为p65的分布情况，dapi为细胞核，merge为每个细胞内p65的分布情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、实验步骤：

(1)造模方法：取8周龄sd大鼠(约200-220g)，10％水合氯醛麻醉后(3.5ml/kg)，碘伏消毒，取大鼠7、8节尾椎(co7/8)，30g穿刺针刺入，刺入长度为5mm，刺入后旋转360°并留置30s后拔出，即获得大鼠尾椎椎间盘退变模型。将15只sd大鼠分成3组：组1(正常椎间盘对照组，图1中control)，组2(单纯椎间盘退变组，图1中idd)，组3(椎间盘退变后雷公藤红素治疗组，图1中cel，造模成功后每天行雷公藤红素(双蒸水配制)灌胃治疗，3mg/kg/d)。分别在损伤后第2及第6周，以大鼠7、8节尾椎为中心，包括与其相邻的椎间盘，进行大鼠尾椎磁共振检测，比较正常椎间盘与退变椎间盘磁共振信号的差异。

(2)选取临床上由于症状强烈而影像学情况较轻的，希望通过手术缓解症状的患者的髓核进行培养。一次髓核取出量约为一个成年人小拇指第一指节大小，取出后放于生理盐水中保存，30分钟运送到实验室。先用无菌pbs将髓核洗2次，除去杂质与血迹。再用无菌器械将其剪碎成1mm×1mm×1mm大小，转移到15ml离心管。再次用无菌的pbs洗一次，离心。弃去上清液，往髓核碎片内加入0.2％ii型胶原酶(vetec)20ml，放置在37℃细胞培养箱内消化5个小时，每隔1小时摇晃试管一次，以便充分消化。随后离心，用10ml的pbs清洗髓核细胞一遍。再离心，加入含体积浓度15％fbs(hyclone)+质量浓度1％的青霉素链霉素(索莱宝)的dmem/f12基础培养基(gibco)混悬细胞，接种到2个底面积为25cm²的培养瓶内。7天后可见髓核细胞基本贴壁，即可更换培养基。随后2-3天换一次培养基。

(3)cck8法测定药物细胞毒性以及药物抗炎效果：取选取步骤(3)中前3代髓核细胞以5～6×10³个/孔的量播种在96孔板内，待其贴壁后，分成组1至组7共7个组，其中组1为对照组(以100μl基础培养基为对照)，组2添加用dmem/f12基础培养基配制的10^-5mg/ml雷公藤红素100μl(雷公藤红素添加量为10nm)，组3添加用dmem/f12基础培养基配制的5×10^-5mg/ml雷公藤红素100μl(雷公藤红素添加量为50nm)，组4添加用dmem/f12基础培养基配制的10^-4mg/ml雷公藤红素μl(雷公藤红素添加量为100nm)，组5添加用dmem/f12基础培养基配制的2×10^-4mg/ml雷公藤红素100μl(雷公藤红素添加量为200nm)，组6添加用dmem/f12基础培养基配制的4×10^-4mg/ml雷公藤红素100μl(雷公藤红素添加量为400nm)，组7添加用dmem/f12基础培养基配制的8×10^-4mg/ml雷公藤红素100μl(雷公藤红素添加量为800nm)。随后在每孔加入用dmem/f12基础培养基配置含质量浓度10％(基础培养基：cck8工作液＝9:1)的cck8(dojindo)工作稀释液100μl。在37℃培养箱内孵育2h，其各孔吸光度由酶标仪测得。

(4)步骤(2)的髓核细胞倍分成4组，组1为对照组(以100％的dmem/f12基础培养基为对照)，组3添加10^-4mg/ml雷公藤红素(雷公藤红素添加量为100nm)+dmem/f12基础培养基，组4添加2×10^-4mg/ml雷公藤红素(雷公藤红素添加量为200nm)+dmem/f12基础培养基，37℃培养2h后，组2、组3、组4弃培养基后再分别加入终浓度10ng/ml的il-1β+dmem/f12基础培养基，37℃作用24小时后，收集上清液用以炎症因子的elisa检测，细胞沉淀分离细胞蛋白和细胞rna分别进行westernblot和qpcr，以检测髓核细胞在炎症刺激下其细胞内nf-κb的表达变化情况，并用elisa检测细胞分泌炎症因子的情况。

(5)westernblots：取步骤(4)作用24h后的细胞沉淀用ripa法提蛋白，并用bca法测蛋白浓度。取蛋白提取液加入loadingbuffer与水，使蛋白量定量为30μg，100℃加热5min使蛋白变性。在sds-page凝胶的每个孔内加入20μl变性后的蛋白液，sds-page凝胶电泳后转膜至pvdf膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，一抗(一抗：一抗稀释液体积比＝1:1000)4℃过夜，tbst洗涤pvdf膜5min×4次，二抗(二抗：tbst体积比＝1：1000)室温孵育2h，tbst洗涤5min×4次，ecl系统显影。β-actin作为内参，imagelab3.0采集条带灰度值，取目的条带吸光度与内参条带比值作为相对表达量。抗p-p65,p65,p-iκbα,iκbα一抗购置于cellsignalingtechnology,inc.(beverly,ma,usa)，抗tnf-α和il-6一抗购置于santacruzbiotechnology(santacruz,ca,usa)，抗collagen-ii和aggrecan一抗购置于abcam(cambridge,ma,usa)。二抗购置于santacruzbiotechnology(santacruz,ca,usa)。

(6)实时荧光定量pcr：取步骤(4)作用24h后的细胞沉淀用trizol法提rna，并测定浓度。用primescript^tm逆转录试剂盒进行反转录，用sybr(上海生工)试剂盒进行试验，并且统计数据，进行表达差异分析。

表1目的基因引物序列

(7)elisa检测细胞炎症因子：取步骤(4)作用24h后获得的上清液，按照il-6试剂盒(r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)操作步骤加入试剂，并用酶标仪检测吸光度。

(8)细胞免疫荧光：将步骤(4)作用24h后的细胞沉淀播种于6孔板玻片，通过细胞免疫荧光检测各组(分组同步骤(4))胶原蛋白ii和蛋白聚糖的表达情况以及p65的细胞内定位情况。用pbs洗涤5分钟×3次，再用4％多聚甲醛固定。用pbs洗涤5min×3次后加入0.5％的tritonx-100处理10min。用pbs洗涤5min×3次，再用5％的bsa封闭30min。吸干pbs，滴加p65(1:200，cst)和ii型胶原抗体(1:200，abcam)，4℃过夜。次日，pbs洗涤5min×3次后，用细胞用绿色荧光二抗(1:400，bioworld)室温避光孵育1h。用pbs洗涤后，再用dapi染核。再用pbs洗涤5min×3次后，滴加抗荧光淬灭剂，封片。取玻片于荧光显微镜下观察并拍摄。

2、实验结果：

(1)单纯椎间盘退变组(图1中idd)的磁共振t2加权像显示，退变的椎间盘呈现明显的低信号。而雷公藤红素治疗后(图1中cel)，椎间盘的信号相对于椎间盘退变组(图1中idd)有明显的提升，证明了雷公藤红素能显著延缓椎间盘退变的程度(图1)。

(2)通过cck8试验得出吸光度后，我们统计各组吸光度/对照组吸光度的比值，结果显示10、50、100、200nm雷公藤红素作用下，髓核细胞吸光值与0nm组(无雷公藤红素组)无显著统计学差异，表明10、50、100、200nm雷公藤红素对细胞无显著毒性；而400、800nm雷公藤红素组髓核细胞吸光值显著低于0nm组，表明400、800nm雷公藤红素具有显著的髓核细胞毒性。通过本实验，确定了雷公藤红素对髓核细胞的安全浓度，即0～200nm(图2)。

(3)通过qpcr试验，我们发现在il-1β刺激下，髓核细胞内的细胞外基质分解酶表达上升，并且发现在雷公藤红素处理后，mmp与adamts的表达呈现剂量依赖性下降，即mmp3(图3中a)、mmp9(图3中b)、mmp13(图3中c)与adamts-4(图3中d)、adamts-4-5(图3中e)的表达量在il-1β的刺激下上调，在加入100nmcel后出现下降，在加入200nmcel后进一步下降，表明了雷公藤红素可以减少细胞外基质的炎性降解。另外，细胞免疫荧光试验还证明了雷公藤红素可以缓解il-1β对髓核细胞外基质的影响(图4)。

(4)通过westernblot、qpcr以及elisa试验，雷公藤红素可以降低在il-1β刺激下髓核细胞细胞炎症因子的含量，证实了雷公藤红素确实具有抗炎作用(图5)。

(5)通过进一步蛋白印记试验分析，我们发现雷公藤红素可以通过抑制nf-κb信号通路的激活来起到抗炎作用(图6)，这一结果也在p65的细胞免疫荧光试验中得以验证(图7)。

另外，本实施例作为已知结构的雷公藤红素，可直接从市场采购或者化学合成，含雷公藤红素的药物组合物可以是一些长效或者局部缓释制剂，例如，可以利用现代医学的一些生物材料，包括聚已酸内酯，聚乳酸-聚乙二醇，聚乙烯醇等等，包载雷公藤红素，形成复合制剂。也有研究表明，雷公藤具有具有一定的细胞毒性。在中医理论指导下通过中药配伍降低雷公藤的毒性，是雷公藤减毒的一个重要方法，例如与白芍配伍用药可以减轻肝毒性，与淫羊藿配伍用药可降低其对男性的生殖毒性等。中药配伍减毒的研究需将传统的中医理论与现代疾病发病机制结合，建立适当的理论评价指标，应用现代的检测手段及方法，开展雷公藤配伍减毒机制研究，筛选出减毒增效的最佳配伍，深入认识雷公藤的毒性作用与规避措施，从而更好地提高雷公藤应用的安全性和临床应用价值。