D‑色氨酸在抑制铜绿假单胞菌产弹性蛋白酶中的应用的制作方法

本发明涉及d-色氨酸在抑制铜绿假单胞菌产弹性蛋白酶中的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

d-色氨酸(d-tryptophan，d-trp)是一种浅褐色的晶体，分子式是c11h12n2o2，分子量204.23g/mol，熔点是282-285℃。d-色氨酸的分子结构图如图1所示。

铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是临床常见的多重耐药菌，除了顽强的耐药性，铜绿假单胞菌自身还能产生产生多种毒力因子，包括绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、凝集素等，对患者有明显的毒副作用。其中弹性蛋白酶主要由基因lasb编码合成，其毒性作用主要体现在降解免疫系统中的蛋白成分物质，包括补体c3、激肽原、抗菌肽、细胞因子、免疫球蛋白、表面活性蛋白、蛋白多糖、细菌鞭毛蛋白等，大大破坏机体的免疫机制；能损伤组织细胞，抑制纤维母细胞的生长，导致pa的感染患者慢性溃疡的产生；可通过降解调理素来抵抗表面活性蛋白-a介导的自噬作用。

技术实现要素：

本发明的目的之一，是提供d-色氨酸在抑制铜绿假单胞菌产弹性蛋白酶中的应用。d-色氨酸可有效降低铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的产生，降低铜绿假单胞菌感染的毒性作用，这将为临床上治疗铜绿假单胞菌感染性疾病提供新的有效途径。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：d-色氨酸在抑制铜绿假单胞菌产弹性蛋白酶中的应用。

发明的申请人经过试验发现，d-色氨酸对铜绿假单胞菌产弹性蛋白酶抑制率：d-色氨酸浓度为5mm时的抑制率>20％，d-色氨酸浓度为10mm时的抑制率>23％。由此可见，d-色氨酸可有效降低铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的产生，降低铜绿假单胞菌感染的毒性作用，为临床上治疗铜绿假单胞菌感染性疾病提供新的有效途径。

本发明的目的之二，是提供一种辅助抗铜绿假单胞菌的药物。d-色氨酸可用于辅助抗铜绿假单胞菌的药物中，可以广泛应用于创伤、烧伤、供皮区以及其它的铜绿假单胞菌感染治疗，且安全性高，应用人群广。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种辅助抗铜绿假单胞菌的药物，所述药物中含有d-色氨酸。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述药物的剂型为乳剂、膏剂或溶液剂。

采用上述进一步的有益效果是：将d-色氨酸制成更多剂型，并应用在医用材料上，能更广泛的发挥d-色氨酸抑制铜绿假单胞菌感染后弹性蛋白酶的产生，减少铜绿假单胞菌的毒性作用，为铜绿假单胞菌感染更优选的治疗方法。

本发明的有益效果是：

1.d-色氨酸可有效降低铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的产生，降低铜绿假单胞菌感染的毒性作用。

2.d-色氨酸对铜绿假单胞菌产弹性蛋白酶抑制率：d-色氨酸浓度为5mm时的抑制率>20％，d-色氨酸浓度为10mm时的抑制率>23％。

3.d-色氨酸可作为一种抗菌辅剂起效剂量小，安全性高。

4.d-色氨酸可用于辅助抗铜绿假单胞菌的药物中，可以广泛应用于创伤、烧伤、供皮区以及其它的铜绿假单胞菌感染治疗，且起效剂量小，安全性高，应用人群广。

附图说明

图1是本发明d-色氨酸的分子结构图。

图2是本发明d-色氨酸对铜绿假单胞菌pao1产弹性蛋白酶的影响。

图3是弹性蛋白酶的标准工作曲线。

图4是本发明d-色氨酸对铜绿假单胞菌pao1中lasb基因表达的影响。

具体实施方式

以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

将-80℃保存的铜绿假单胞菌pao1划板接种至lb固体培养基，37℃培养24h。挑取约1mm²的单克隆菌落至lb液体培养基中，200r/min，37℃培养6-8h。用新鲜ptsb液体培养基(胰蛋白胨50g、tsb培养基2.5g，加超纯水定容至1000ml，调节ph至7.2-7.4，121℃高温灭菌30min),将d-色氨酸溶至10mm，再用培养基依次稀释。将含不同浓度的d-色氨酸10、5、1、0.1、0mm的lb培养基分别取2ml于12孔细胞培养板中，每孔加入2μl0.5麦氏浊度的铜绿假单胞菌pao1菌液，各浓度做3个复孔。37℃培养24h。吸取待测菌液，4℃、12000rpm离心5min，吸取200μl上清液于新的ep管，加入800μl弹性蛋白酶反应缓冲液(tris-hcl0.1m，cacl21mm)及2mg刚果红底物。30℃振荡培养24h后离心去除多余的刚果红底物，取200μl液体测od495。按上述操作进行弹性蛋白酶标准品工作曲线的测定(图3)，经浓度换算后，d-色氨酸对铜绿假单胞菌pao1产弹性蛋白酶的影响见图2，d-色氨酸浓度为5mm时的pao1产弹性蛋白酶的抑制率>20％，d-色氨酸浓度为10mm时的抑制率>23％。

实施例2

将铜绿假单胞菌pao1按实施例1中步骤培养，收集菌液后离心，所得沉淀按照rneasyminikit提取试剂盒的标准操作流程提取各组的rna，测定各组rna浓度后，按体系配比(20μl体系：primescriptrtmastermix4μl、cdna1μg、超纯水添至20μl)进行cdna逆转录。经普通pcr验证cdna能扩增弹性蛋白酶编码基因lasb(具体序列见表1)，下一步进行荧光定量pcr。配制20μl体系包括：premixextorqⅱ10μl，上下游引物各0.8μl，cdna稀释10倍后取2μl，超纯水6.4μl。反应条件为：95℃5s，(95℃5s，61℃30s，72℃20s)×40个循环。扩增产物用管家基因rpsl的量归一化后再进行比较，实验重复三次。结果见图4，发现d-色氨酸能下调铜绿假单胞菌中弹性蛋白酶编码基因lasb及其上游控制基因lasi和lasr的表达。

表1pcr相关引物汇总表

由此可见，d-色氨酸可有效降低铜绿假单胞菌绿脓菌素及弹性蛋白酶的产生。

实施例3

一种辅助抗铜绿假单胞菌的药物，所述药物中含有d-色氨酸。

所述药物的剂型为乳剂、膏剂或溶液剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。