本发明属于医药技术领域，具体地说涉及硫辛酰胺在延缓和治疗糖尿病肾病中的用途。
背景技术：
糖尿病的发病率在不断上升，糖尿病的严重并发症之一——糖尿病肾病的发病率也呈逐年升高趋势，已成为导致慢性肾衰竭的主要病因及糖尿病致死的主要原因之一。大约有30％的1型糖尿病患者和25％～40％的2型糖尿病患者会并发糖尿病肾病。然而，糖尿病肾病的发病机制十分复杂，目前的研究结果提示代谢紊乱、血流动力学改变、炎性反应机制、细胞因子、氧化应激、遗传因素、激肽系统及自噬等多种因素参与了糖尿病肾病的发病，但其确切机制尚未明确，因此对糖尿病肾病的治疗一直是较为棘手的医学难题，一直缺乏有效的治疗药物。以往的治疗思路主要集中在控制血糖、血压、血脂等外围危险因素，但治疗效果并不理想。因此，找寻预防和阻止肾功能进行性减退的有效方法，延缓和治疗糖尿病肾病，成为当今糖尿病肾病防治刻不容缓的任务。
糖尿病肾病发病机制及病理表现较复杂，主要包括肾小球硬化及肾小管间质的纤维化。肾小管间质纤维化表现为正常的肾小管和肾间质结构被大量聚集的细胞外基质(ecm)代替，间质中出现肌成纤维细胞。同时肾小管上皮细胞(rtecs)作为主要的肾实质细胞，出现肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化(emt)。肌成纤维细胞具有很强的分泌ecm的能力，同时还释放抑制ecm分解的酶类，使ecm分解减少而堆积，直接导致间质的纤维化和肾功能的损伤。
转化生长因子β1(tgf-β1)被公认为糖尿病肾病组织纤维化发展的关键性致病因子，其通过下游丝/苏氨酸激酶受体(smad)信号通路在糖尿病肾病进行性病变发展中起着重要作用。ski相关的新蛋白n(snon)是ski原癌基因家族成员之一，其最初研究集中在胚胎发育和致肿瘤作用方面。近期研究发现snon是tgf-β1/smad信号通路中重要的核转录抑制因子。其通过与tgf-β1信号下游的smads蛋白相互作用，负调控tgf-β1信号通路，起到阻断纤维化进程的作用。发明人曾经对糖尿病肾病发病过程中snon表达的变化进行了研究(《中国病理生理杂志》，2008年，24卷6期，1188页)，发现随着糖尿病肾病病程进展snon表达减少，且高糖刺激可引起大鼠原代肾小管上皮细胞snon蛋白表达减少，并呈时间依赖性，表明snon蛋白水平的表达减少是糖尿病肾病肾纤维化的重要发病机制。因此通过药物等手段增加snon的表达对于干预糖尿病肾病肾纤维化进程非常重要。但当前这方面的药物应用非常有限。
另一方面，若能通过药物作用增加snon蛋白的稳定性，或许将有助于干预糖尿病肾病纤维化进程。但迄今没有报道过药物对于snon蛋白稳定性的干预以及进一步对肾脏纤维化的影响。
还受到转化生长因子β激活激酶(tak-1)的调控(jbiolchem.2007年13卷，9475页)。tak1是丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinase,mapkk)家族成员之一，可被tgf-β1磷酸化激活。既往的研究发现随着肾脏病理损害的进展，tak1mrna和蛋白的表达及活性均增高，并可介导肾小管上皮发生表型转化。而应用tak1抑制剂治疗db/db小鼠能明显降低尿蛋白、减轻病理学改变、减少巨噬细胞浸润等。但是以往文献中没有报道过snon蛋白稳定性与肾小管上皮细胞发生向肌成纤维细胞转分化(emt)之间的关系，也没有
α-硫辛酸是含有二硫键五元环的脂溶性结构，电子密度高，具有的亲电子性和与自由基反应的能力，因此具有显著的抗氧化性。临床上用于治疗糖尿病周围神经病变引起的感觉异常。在糖尿病肾病的干预和治疗中，2015年周俭玲报道了硫辛酸对早期糖尿病肾病临床疗效的影响(《中国实用医药》，2015年，10卷6期，143页)，在病人身上用二甲双胍治疗的同时给予硫辛酸胶囊，连续给药28天，能降低尿微量白蛋白排泄率作用，对治疗早期糖尿病肾病效果显著。王晖等在2011年报道了硫辛酸对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的影响研究(《辽宁医学院学报》，2011年，32卷6期，489页)，硫辛酸连续灌胃给药12周，结果表明硫辛酸能通过抑制肾组织tgf-β1等的表达而发挥其抗纤维化的作用，从而延缓stz糖尿病大鼠肾脏纤维化的发展。但尽管如此，由于硫辛酸对糖尿病肾病的干预和保护作用不够突出，因此迄今为止也未成为糖尿病肾病治疗中的重要药物进行使用。当前硫辛酸对糖尿病肾病的干预机制研究上多集中于抗氧化机制，该类药物是否还有干预糖尿病肾病的其它作用机制则研究较少。
硫辛酰胺(lipoamide)，是α-硫辛酸的一种衍生物。
硫辛酰胺可清除体内自由基，促进内源性的抗氧化剂的生成，因其高效的抗氧化作用引起了研究者的兴趣。li等研究发现硫辛酰胺可以通过抑制氧化应激，改善线粒体功能保护视网膜色素上皮细胞(freeradicbiolmed.2008年44卷，1465页)。zhao等研究发现硫辛酰胺可以通过激活线粒体再生和ⅱ期抗氧化酶发挥间接抗氧化作用(plosone.2015年10卷，e0128502)。硫辛酰胺现已经作为肝保护用药在国外上市，但尚未见到硫辛酰胺在延缓和治疗糖尿病肾病的药效方面的报道，也未见其作用机制研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供硫辛酰胺在延缓和治疗糖尿病肾病中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备延缓和治疗糖尿病肾脏并发症的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备改善肾纤维化病变、改善大鼠肾功能和代谢的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备降低糖尿病大鼠肾重/体重比、24h尿蛋白、总胆固醇、甘油三酯的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备抑制糖尿病大鼠肾组织氧化应激的效应，恢复肾组织总抗氧化能力(totalantioxidantcapacity，t-aoc)、总超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase，t-sod)、过氧化氢酶(catalase，cat)的活性，并显著降低肾组织丙二醛(malondialdehyde，mda)水平的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备减少肾间质胶原蛋白ⅰ(collagenⅰ)的表达而发挥抗糖尿病肾脏纤维化作用，明显改善肾纤维化病变的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备促进肾纤维化关键调控的核转录共抑制因子snon蛋白的表达水平的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺在用于制备减少肾纤维化关键调控的核转录共抑制因子snon蛋白泛素化水平、提高snon蛋白稳定性的组合物中的用途。
本发明的硫辛酰胺的光学对映体、水合物、氢化加成物或前体，具有与硫辛酰胺相同或接近的改善肾纤维化病变、改善大鼠肾功能和代谢的功能，以延缓和治疗糖尿病肾脏并发症。
所述的“氢化加成物”指的是结构式(i)中的二硫键氢化开环形成的巯基化合物；所述的“前体”指在哺乳动物体内进行代谢或化学反应能转变成结构式(i)的一种化合物或其类似物。
本发明的组合物包括药物组合物和饮食补充剂(如保健品组合物)，只要它们含有硫辛酰胺作为改善肾纤维化病变、改善肾功能和代谢的活性成分。
本发明的硫辛酰胺或其光学对映体、水合物、氢化加成物或前体用于制备能改善肾纤维化病变、改善大鼠肾功能和代谢的组合物中的用途。
本发明通过建立糖尿病肾病的sd大鼠模型，以硫辛酸作为阳性对照，将硫辛酰胺和硫辛酸灌胃给予大鼠。结果表明6周后硫辛酰胺能明显降低糖尿病大鼠肾重/体重比(kw/bw)、血总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、24h尿蛋白(24hup)；t-aoc、t-sod、cat活性显著高于dm组，而mda水平显著降低，且硫辛酰胺治疗组的t-aoc和t-sod的活性较硫辛酸组恢复更显著，且mda水平降低也比硫辛酸组更明显；h&e、masson染色结果显示硫辛酰胺组肾纤维化病变明显改善，且硫辛酰胺组肾间质胶原蛋白ⅰ(collageni)的表达明显低于硫辛酸组；硫辛酰胺治疗组snon蛋白水平的表达增加；泛素化的snon蛋白减少，snon蛋白的稳定性增加，且发现转化生长因子β激活激酶(tak-1)的表达和活化减少。上述结果表明硫辛酰胺可以改善大鼠肾功能和代谢，并具有增加snon蛋白表达水平的作用；同时还能通过抑制tak1的表达和活化，提高snon蛋白的稳定性，进而减少collageni的表达而发挥抗糖尿病肾脏纤维化效应。
具体实施方式
下列实验中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的常规条件实施。
1.材料
健康清洁级雄性sprague-dawley(sd)大鼠，体重(180±20)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，批号为scxk(京)2009-0004。稳步倍加型血糖仪(强生公司)，超低温冰箱(sanyo)，高速低温离心机(beckman)，bayer1650全自动生化分析仪(beckman)，电泳系统及电转移装置(amersham)，凝胶成像系统(bio-rad)。阳性对照药硫辛酸为购买获得(西安泽邦生物科技有限公司)；受试化合物硫辛酰胺根据下列方法合成。
硫辛酰胺的制备方法：于圆底烧瓶中加入硫辛酸30.0g和300ml二氯甲烷，搅拌溶解后室温下加入1-羟基苯并三唑20.8g，加毕搅拌0.5h后，分三批加入二环己基碳二亚胺28g，加完室温搅拌10h后停止反应，反应液用水洗涤三次(150ml/次)后分液浓缩，得黄色固体40克。取该固体15.0g溶解于90ml四氢呋喃中，搅拌下加入40ml浓氨水，室温搅拌8h后减压蒸除有机溶剂，残留物中加入50ml水，室温搅拌2h后，抽滤，滤饼40℃减压干燥，得硫辛酰胺粗品。粗品用乙醇重结晶两次后得硫辛酰胺为淡黄色粉末状固体，收率84.7％。结构表征数据：1hnmr(d-dmso，400mhz)，δ:7.21(s,1h)；6.68(s,1h)；3.58-3.54(m,1h)；3.14-3.06(m,1h)；2.77(s,1h)；2.46-2.36(m,1h)；2.03-1.98(m,2h)；1.81-1.62(m,1h)；1.56-1.28(m,6h)。13cnmr(d-dmso，100mhz)，δ:174.66，56.69，40.05，38.63，35.46，34.70，28.92，25.40。esi-ms：m/z:228.1[m+na]+。
2.方法
2.1动物模型复制及分组：sd大鼠适应性喂养一周后，尾静脉注射溶于ph4.5的0.01mol/l无菌柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液的链佐脲菌素(剂量为55mg/kg)构建糖尿病大鼠模型。72h后测大鼠空腹血糖，血糖≥16.7mmol/l且尿糖阳性则造模成功。大鼠随机分成糖尿病组(dm组)、硫辛酸治疗组(ala组)和硫辛酰胺治疗组(alm组)。成模2周后，采取灌胃方式给予硫辛酸和硫辛酰胺治疗，硫辛酸和硫辛酰胺分别浑悬于5％的羧甲基纤维素钠(cmc-na)水溶液中，灌胃剂量为150mg/kg/d，每周给药6天；并设鼠龄相同的正常对照组(nc组)，灌胃同等浓度同等剂量的cmc-na水溶液。所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水，每周监测一次血糖和体重。6周后处死所有大鼠。
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，应用spss17.0软件，组间比较采用方差齐性检验，作单因素方差分析，p<0.05时表示有统计学意义。
2.2标本收集：大鼠处死前1天用代谢笼收集24h尿，记录尿量，取部分尿液离心后－20℃保存；处死前禁食6-8h，乙醚麻醉后称重，股动脉穿刺采血，分离血清－20℃保存；开腹取双侧肾脏，去掉包膜及周围脂肪组织，称重记录肾重/体重比(kw/bw)，分别用4％多聚甲醛固定及－80℃保存。
实验例1：硫辛酸与硫辛酰胺对大鼠肾重/体重比、血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、尿蛋白的影响的对比实验
酶分析法检测血清总胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)；邻苯三酚红比色法测尿蛋白(urineprotein，up)，均按试剂盒说明书操作，尿蛋白浓度与尿量乘积为24h尿蛋白量(24hup)。
表1实验6周后各组大鼠肾重/体重比、24h尿蛋白、总胆固醇、甘油三酯的变化(x±s)
与正常组相比，*p<0.05；与糖尿病组相比，#p<0.05；与硫辛酸组相比，δp<0.05
由表1可见，硫辛酰胺组(alm)和硫辛酸组(ala)的kw/bw、tc、tg及24hup均降低(p<0.05)，且硫辛酰胺对tc、tg的降低作用明显强于硫辛酸。
实验例2：硫辛酸或硫辛酰胺对大鼠总抗氧化能力(t-aoc)、过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(t-sod)、丙二醛(mda)的影响
所有指标均采用比色法参照试剂盒说明书测定。
表2实验六周后各组大鼠氧化应激水平的比较(x±s)
与正常组相比，*p<0.05；与糖尿病组相比，#p<0.05；与硫辛酸组相比，δp<0.05
由表2可见，糖尿病组大鼠肾脏t-aoc、t-sod和cat活性与正常组相比降低(p<0.05)，硫辛酸和硫辛酰胺均能上调dm大鼠肾脏t-aoc、t-sod和cat活性(p<0.05)，并且硫辛酰胺上调糖尿病大鼠肾脏t-aoc及t-sod的活性较硫辛酸更显著(p<0.05)；而糖尿病组大鼠肾脏mda含量较正常组相比升高(p<0.05)，硫辛酸和硫辛酰胺均能下调糖尿病大鼠肾脏mda含量，尤其以硫辛酰胺的作用更明显(p<0.05)，说明硫辛酸和硫辛酰胺均具有抗氧化应激的作用，从而减轻或延缓糖尿病肾病的发生发展，而且硫辛酰胺的抗氧化作用明显强于硫辛酸。
实验例3：硫辛酸(ala)或硫辛酰胺(alm)对大鼠肾组织形态结构变化的影响
多聚甲醛固定肾组织，制成3μm厚的石蜡切片，行h&e及masson染色，光镜观察肾组织形态结构变化。h&e染色评估小管间质的损害方法如下：在肾皮质随机选取10个20倍镜下视野进行系统评估(1–6级)。损伤评分判分级标准包括肾小管扩张，肾小管萎缩，管型形成，间质单核细胞和细胞外基质沉积的范围占总视野的百分比(1＝不到10％；2＝10-25％；3＝26-50％，4＝51-75％，5＝76-95％，6＝95％以上)。
h&e及masson染色可见正常大鼠肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，间质未见炎性细胞浸润；dm组大鼠肾小管腔扩张明显，肾小管基底膜不规则增厚，肾小管上皮细胞出现空泡状改变，间质出现炎性细胞浸润，肾小管间质masson染色阳性物质增多；ala和alm组大鼠肾脏病变有不同程度的改善，肾小管间质masson染色阳性物质明显减少，炎性细胞浸润减轻。h&e染色后系统损伤评级alm组低于ala组，可见硫辛酰胺对肾组织的损伤保护作用强于硫辛酸。
实验例4：硫辛酸(ala)和硫辛酰胺(alm)对大鼠collageni的影响
采用免疫组织化学染色法，sp两步法检测collageni在各组大鼠肾组织的分布和表达。石蜡切片脱蜡水化，经胰酶修复抗原及5％bsa封闭后，collageni(1∶100)，4℃孵育过夜加入生物素化二抗，室温下孵育30min，滴加sp试剂3-氨基-9-乙基卡唑(3-amino-9-ethylcarbozole，aec)显色显色，苏木素复染，pbs代替一抗，作阴性对照。collageni的沉积采用定量图像分析系统(image-pro+v6.0)进行分析：在肾皮质随机选取10个40倍镜下含有肾小球的视野进行分析，确定阳性染色的区域，动脉腔被排除在研究之外，计算得出阳性染色的面积占总面积的比例。
结果表明正常大鼠肾组织collageni阳性染色主要存在血管周围和细胞间质，而在糖尿病大鼠其阳性染色明显增多，可见肾小管基底膜强阳性染色。硫辛酸和硫辛酰胺治疗后collageni的表达均明显减少，尤其是硫辛酰胺治疗后collageni的表达较硫辛酸组减少更明显(p<0.05)，表明硫辛酸和硫辛酰胺可通过减少collageni的表达而发挥抗糖尿病肾脏纤维化效应，且硫辛酰胺的作用较硫辛酸更强。
实验例5：硫辛酰胺(alm)对大鼠肾组织转化生长因子β1表达、tak1蛋白表达和活化的影响
取-80℃保存的各组大鼠肾皮质，每只样本取200mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆离心取上清，用bca试剂盒(碧云天)测定各组蛋白质浓度，按所测得浓度计算每泳道所需体积，加入加样缓冲液煮沸10min，经8％的sds-page凝胶电泳分离，再转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入β-actin、tgf-β1、tak1、p-tak1一抗，工作浓度分别为1:4000、1:300、1:1000、1:1000，4℃孵育12-24h；次日，tbst洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度均为1∶4000)室温孵育1h，加ecl荧光显色液，凝胶成像仪曝光，imagelab软件分析各条带调整体积值，每个样本重复操作3次以β-actin蛋白条带作为内参，结果用目标蛋白/β-actin值表示。
结果显示，正常对照组(nc)中tgf-β1及tak1、p-tak1表达均较少；而糖尿病组(dm)中tgf-β1及tak1、p-tak1较正常组显著增加(p<0.05)；硫辛酰胺(alm)治疗后tgf-β1及tak1、p-tak1与dm组相比均明显减少(p<0.05)。表明硫辛酰胺可抑制tgf-β1表达，同时抑制tak1的表达和活化。
实验例6：硫辛酰胺(alm)对大鼠ski相关的新蛋白n(snon)蛋白表达水平的影响
snon蛋白水平的检测：取-80℃保存的各组大鼠肾皮质，每只样本取200mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆离心取上清，用bca试剂盒(碧云天)测定各组蛋白质浓度，按所测得浓度计算每泳道所需体积，加入加样缓冲液煮沸10min，经8％的sds-page凝胶电泳分离，再转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入β-actin、snon一抗，工作浓度分别为1:4000、1:300，4℃孵育12-24h；次日，tbst洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度均为1∶4000)室温孵育1h，加ecl荧光显色液，凝胶成像仪曝光，imagelab软件分析各条带调整体积值，每个样本重复操作3次以β-actin蛋白条带作为内参，结果用目标蛋白/β-actin值表示。正常对照组中，snon高表达；糖尿病组(dm)中snon表达水平较正常组显著下调(p<0.05)；硫辛酰胺组中snon表达水平与糖尿病组相比均明显上调(p<0.05)，。表明硫辛酰胺可以恢复肾纤维化的关键调控蛋白snon的表达。
实验例7：硫辛酰胺(alm)对大鼠ski相关的新蛋白n(snon)泛素化水平的影响
snon泛素化水平的检测：取-80℃保存的各组大鼠肾皮质，每只样本取200mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆离心取上清，用bca试剂盒(碧云天)测定各组蛋白质浓度。通过免疫沉淀(immunoprecipitation，ip)分离纯化snon，将提取的snon加入加样缓冲液煮沸10min，经8％的sds-page凝胶电泳分离，再转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入泛素、snon，igg一抗，工作浓度分别为1:1000、1:300，4℃孵育12-24h；次日，tbst洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度均为1∶4000)室温孵育1h，加ecl荧光显色液，凝胶成像仪曝光，比较印迹结果可检测snon蛋白泛素化水平。正常对照组(nc)中，泛素化的snon蛋白表达较少；而糖尿病组(dm)中泛素化的snon蛋白较正常组显著增加；硫辛酰胺组(alm)中泛素化的snon蛋白与糖尿病组相比明显减少。表明硫辛酰胺可以减少snon蛋白的泛素化降解，增加snon蛋白的稳定性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。