一种用于多发性骨髓瘤的生物标志物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于多发性骨髓瘤的生物标志物，具体的所述生物标志物为drap1。

背景技术：

多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,mm)是一种起源于骨髓浆细胞的血液系统恶性肿瘤，其特点是骨髓中浆细胞克隆性增殖积聚，并分泌单克隆免疫球蛋白或其片段。mm是第二常见的血液系统恶性瘤，好发于60-70岁的老年人，发病原因仍不明确，患者存活期一般为3-5年。其临床表现很多，主要包括贫血、高钙血症、肾损伤、反复感染、以及溶骨性损伤等。造血干细胞移植是治疗mm最有效的方法，但由于受骨髓来源、hla配型以及高医疗费用等因素的影响，限制了它在临床上的应用。近年来，随着对mm研究的深入，mm药物治疗的总体有效率、缓解率及无病生存率也有较大幅度提高，但随着药物治疗的进程患者容易产生耐药和复发等现象，因此对于mm新型治疗方案的研究具有重要意义。

近年来，随着新药的研发，经沙利度胺、雷利度胺和硼替佐咪等治疗的mm患者预后获得了极大的进展，为该病的治疗提供了新的选择。然而，多发性骨髓瘤的复发率依然高居不下，因此，研究开发更多治疗mm的新药及治疗方案，仍为基础研究和临床工作者努力的一个方向。

目前在世界范围内，肿瘤仍然是威胁人类健康的主要杀手，对其发病机制及其新型诊断、治疗手段的研究一直是全世界医学研究的重点。肿瘤的形成是一个多阶段、多基因损伤、长时间累积的复杂过程，但究其根本，无外乎是细胞增殖失控、分化受阻和凋亡被抑制等三大方面的问题，因此，对于肿瘤的治疗策略也主要是针对这三点来设计完成的。目前为止，化疗仍然是治疗肿瘤的基本策略，化疗药物发展至今，虽然取得了很大成就，但就其总体来说，其严重的毒副作用限制了它的疗效发挥。

近年来，随着多学科综合治疗(multidisciplinaryteam，mdt)的发展，多发性骨髓瘤的治疗取得了一定的进展。精准医疗的提出，为肿瘤的治疗提供了新的手段和方向，精准医疗的关键是利用有效的生物标志物，进行特异性个体化治疗。现有技术如专利201610602127.x、201610599598.x、201610602019.2公开了基因在多发性骨髓瘤发生发展中的重要作用，为多发性骨髓瘤的精准医疗提供了一定的基础，但是其在临床上应用的效率还有待进一步研究。因此，寻找多发性骨髓瘤新的有效分子标志物以及潜在治疗靶点，阐明多发性骨髓瘤的发生发展机制，成为多发性骨髓瘤临床诊断和治疗以及研究的热点。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与多发性骨髓瘤发生发展相关的生物标志物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种drap1基因的用途，用于制备预防或治疗多发性骨髓瘤的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括drap1的下调剂。所述下调剂选自：以drap1或其转录本为靶序列、且能够抑制drap1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物；或特异性与drap1编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制drap1蛋白活性的抗体或配体)。

进一步，所述的下调剂选自下组序列的sirna：seqidno.9、seqidno.10。

本发明提供了一种用于预防或治疗多发性骨髓瘤的drap1的下调剂，所述下调剂选自：

核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调drap1基因或其编码的蛋白的表达或活性。

在本发明中，所述drap1的下调剂还可用于抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。

本发明提供了一种用于预防或治疗多发性骨髓瘤的药物组合物，所述药物组合物含有：

上面所述的drap1的下调剂；和

药学上可接受的载体。

本发明提供了一种drap1基因的用途，用于筛选预防或治疗多发性骨髓瘤的潜在物质。

本发明提供了一种筛选预防或治疗多发性骨髓瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达或含有drap1基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中drap1基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低drap1基因的表达或活性，(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗多发性骨髓瘤的潜在物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括但不限于：针对drap1基因或其编码的蛋白或其上游或下游基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。

在本发明中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗多发性骨髓瘤有用的物质。

本发明提供了一种drap1基因的用途，用于制备诊断多发性骨髓瘤的产品。其中，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂或试剂盒。

进一步，所述产品包括检测drap1基因表达的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别drap1的探针；或

特异性扩增drap1的引物；或

特异性结合drap1编码的蛋白的抗体或配体。

较佳的，所述的特异性扩增drap1基因的引物是引物对，序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

附图说明

图1是利用qpcr检测drap1基因在多发性骨髓瘤组织中的表达情况图；

图2是利用qpcr检测drap1在多发性骨髓瘤细胞中的转染情况图；

图3是用mtt法检测drap1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的基因芯片，检测标本中基因在多发性骨髓瘤组织和正常骨髓组织的表达水平，发现其中具有明显表达差异的基因片段，探讨其与多发性骨髓瘤的发生之间的关系，从而为多发性骨髓瘤的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了多发性骨髓瘤中drap1显著性上调。实验证明，通过降低drap1的表达水平，能够有效地抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，提示检测drap1基因的表达水平可成为多发性骨髓瘤早期诊断的辅助诊断指标之一，干扰drap1基因表达可成为预防或治疗多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤转移的新途径，或多发性骨髓瘤的精准化治疗的新方向。

drap1基因

drap1是位于11号染色体长臂1区3带上，一种代表性的人drap1基因的核苷酸序列和氨基酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。本发明中的drap1包括野生型、突变型或其片段。

本发明的人drap1核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。

因此，本发明的多核苷酸与seqidno.1优选具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％同源性。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

下调剂和药物组合物

基于本发明人的发现，本发明提供了一种drap1的下调剂的用途，用于制备抑制多发性骨髓瘤的药物组合物。如本文所用，所述的drap1的下调剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。

所述的drap1基因或蛋白的下调剂是指任何可降低drap1蛋白的活性、降低drap1基因或蛋白的稳定性、下调drap1蛋白的表达、减少drap1蛋白有效作用时间、或抑制drap1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调drap1有用的物质，从而可用于预防或治疗多发性骨髓瘤。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调drap1蛋白或其编码基因的表达。

作为本发明的一种选择方式，所述的drap1的下调剂是一种特异性与drap1结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用drap1蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达drap1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。抗体的“特异性”是指抗体能结合于drap1基因产物或片段。较佳地，指那些能与drap1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab’或(fab)²片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子；或嵌合抗体。抗drap1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的drap1蛋白含量，还可以作为用于预防多发性骨髓瘤转移和侵袭的特异性治疗剂。血样或尿液中的drap1蛋白的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。抗体可以通过elisa、westernblot印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。

作为本发明的一种优选方式，所述drap1的下调剂是一种drap1特异性的小干扰rna分子。如本文所用，所述的“小干扰rna”是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rnainterference)过程。小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。

在筛选有效的sirna序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种sirna序列，并将它们分别通过转染试剂转染多发性骨髓瘤细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的sirna，它们分别具有seqidno.9、seqidno.10所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞试验而言抑制效率非常高。

作为本发明的一种可选方式，所述的drap1的下调剂也可以是一种“小发夹rna(smallhairpinrna，shrna)”，其是能够形成发夹结构的非编码小rna分子，小发夹rna能够通过rna干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shrna可以由双链dna模板来表达。双链dna模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shrna在真核细胞内dicer酶的作用下，可被切割成小干扰rna分子，从而进入rnai途径。“shrna表达载体”是指一些本领域常规用于构建shrna结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shrna(或类似物)相应的dna序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该dna序列转录后的rna可形成shrna(shorthairpin)结构。所述的“shrna表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的drap1的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制多发性骨髓瘤。任何前述的drap1的下调剂均可用于组合物的制备。

本发明中所述的药学上可接受的载体(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

药物组合物还可以不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂；同时还可以包括药学上可接受的涂层材料。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的drap1基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将drap1的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带drap1的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或sirna或shrna)递送到靶点上，并使之表达活性的drap1下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

术语“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos、或293细胞的动物细胞等。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明中的药物组合物包括drap1的下调剂、和/或与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的药物组合物还可与其他治疗多发性骨髓瘤的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

药物筛选

本发明提供了一种筛选预防或治疗多发性骨髓瘤药物的方法，即：

在实验组中，向细胞培养体系中加入待测化合物，并测定drap1的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定drap1的表达水平；其中，如果实验组中drap1的表达水平大于对照组，则说明该候选化合物为drap1的下调剂。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选化合物进一步测试其抑制多发性骨髓瘤的效果，若测试化合物对多发性骨髓瘤有显著的抑制效果，则说明该化合物为预防或治疗多发性骨髓瘤的潜在物质。

芯片、试剂盒

本发明的所述的基因芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于drap1所示的部分或全部序列。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中针对drap1基因的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述的drap1芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测drap1基因或蛋白的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取rna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，drap1基因实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与多发性骨髓瘤相关的基因标志物

1、样品收集

收集多发性骨髓瘤患者和正常人的骨髓液标本各6例，其中确诊的多发性骨髓瘤患者男性3例，女性3例，中位年龄55岁。多发性骨髓瘤的诊断根据who诊断多发性骨髓瘤的标准，上述所有标本的取得都获得病人的知情同意以及通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

抽取病例组及对照组人骨髓液5-10ml，放入抗凝管中。提取骨髓细胞后，加入1mltrizol试剂(invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于rna提取。

利用trizol法提取样品中的rna，用nanodrop2000紫外分光光度计测量rna纯度及浓度，冻存于-70℃。rna质量判定标准：rna样本的od260/od280值为1.7-2.2之间；总rna电泳图谱有清晰的28s、18s条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、逆转录和标记

用lowrnainputlinearamplificationkit将mrna逆转录成cdna，同时用cy3分别标记实验组和对照组。

4、基因芯片杂交及扫描

基因芯片采用aglient公司的人全基因组表达谱芯片。按芯片使用说明书的步骤进行。

5、数据分析

利用agilentgenespring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该基因在多发性骨髓瘤组织与正常骨髓组织中的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的基因。

6、结果

芯片结果显示，共筛选出839个差异表达基因，上调基因530个，下调309个，其中drap1在多发性骨髓瘤组织中的表达量显著高于正常骨髓组织中的表达量。

实施例2qpcr测序验证drap1基因的差异表达

1、对drap1基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式选择多发性骨髓瘤组织和正常骨髓组织各50例。

2、rna提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录

1)逆转录反应

rna模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却；继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，rna酶抑制剂(20u/μl)1μl，10mmdntp混合液2μl，amv反转录酶(200u/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；25℃反应5min，42℃反应60min，70℃5min终止反应。

2)聚合酶链反应

配制pcr反应体系：2×qpcr混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddh2o8.0μl。

pcr反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

设计pcr的引物，drap1基因的正反向引物如seqidno.3和seqidno.4所示；内参gapdh基因的正反向引物如seqidno.5和seqidno.6所示。

5、结果

结果如图1所示，与正常骨髓组织相比，drap1在多发性骨髓瘤组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同芯片检测结果一致。

实施例3drap1基因的沉默

1、细胞培养

复苏冻存的人多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培养基在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化，按1×10⁶个细胞/孔接种在24孔培养板中。

2、转染

将实验分为三组：对照组(rpmi8226)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(sirna1、sirna2、sirna-3)，其中阴性对照组sirna与drap1基因的序列无同源性，浓度为20nm/孔，使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。其中sirna-nc、sirna1、sirna2、sirna-3的序列分别如seqidno.7-8、seqidno.9-10、seqidno.11-12、seqidno.13-14所示。

3、qpcr检测drap1基因的转录水平

3.1细胞总rna的提取按照qiagen试剂盒的提取步骤进行；

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3qpcr扩增步骤同实施例2。

4、结果

结果如图2显示，与非转染组与转染sirna-nc组相比，实验组中的drap1的表达水平显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例4drap1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

采用mtt法实验检测drap1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3，转染后6h换液，放置细胞培养箱过夜。

2、分别取各组细胞以每孔1×10⁴个接种于96孔板中，每组均设置三个复孔。

3、分别取培养24h、48h、72h、96h各组细胞加入新鲜配置的浓度为5mg/ml的mtt20μl，继续培养4h，离心去上清，每孔加入dmso100μl，轻轻震荡，用酶标仪选择490nm波长测其吸光度，每组重复试验3次。

4、以时间为横坐标，各细胞组od值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

5、结果

结果如图3所示，与对照相比，实验组在转染sirna-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(p<0.05)说明drap1具有促进细胞增殖的作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>刘志国王思奎孙长法

<120>一种用于多发性骨髓瘤的生物标志物

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1022

<212>dna

<213>人源

<400>1

gggcgggagcggcggtccagactggggagggacgcgcaccggccaggaggcttcaagagg60

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cgcggaacgcgaagaccatgaccacatcccacctgaagcagtgcatcgagctggagcagc480

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caccccaggccagccacccctctgcccactttcagagccccccgacacccttcctgccct780

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gttttagttgctctggggggaggagagaaggtagagctgttcttaaatttattaaaaaaa960

aaaataaaagggaatctcagtgtctgttccaggctctgcgcaggaaaaaaaaaaaaaaaa1020

aa1022

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<212>prt

<213>人源

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metproserlyslyslyslystyrasnalaargpheproproalaarg

151015

ilelyslysilemetglnthraspglugluileglylysvalalaala

202530

alavalprovalileileserargalaleugluleupheleugluser

354045

leuleulyslysalacysglnvalthrglnserargasnalalysthr

505560

metthrthrserhisleulysglncysilegluleugluglnglnphe

65707580

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859095

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100105110

lysproglyserglyglyarglysasnglyglymetglythrlysser

115120125

lysasplyslysleuserglythraspsergluglngluaspgluser

130135140

gluaspthraspthraspglygluglugluthrserglnpropropro

145150155160

glnalaserhisproseralahispheglnserproprothrprophe

165170175

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195200205

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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aatcccatcaccatcttccag21

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gagccccagccttctccat19

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<212>rna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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cuuuuaguugguuuuaguugc21