一种胶原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/纳米银涂层制备方法与流程

本发明涉及材料科学与纳米材料技术领域，特别涉及一种胶原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/纳米银涂层制备方法。

背景技术：

生物医用材料是用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官或增进其功能，且对生物体组织不会产生不良影响的材料。它是研究人工器官和医疗器械的基础，已成为当代材料学科的重要分支。医用钛金属耐蚀性能优异，弹性模量接近于自然骨，生物相容性优良，目前常用于制造植入人体内的医疗器件、假体或人工器官和辅助治疗设备。

然而由于医用植入体所引起的细菌感染给病人带来巨大的伤害,一旦发生不仅会带来更多的痛苦和经济损失,甚至还会使人截肢或死亡。医用钛基材料植入同样存在细菌感染的问题。为了减少细菌感染同时又不影响植入体的功能，我们希望对植入体进行改性，使其能在短时间里消灭感染的细菌，同时还能进一步促进细胞的粘附，增殖及分化。

纳米银具有较好的光催化性能，可以在可见光照射下产生活性氧，同时其本身也具有优异的抗菌性能，从而作为一种广谱抗菌材料对需氧、厌氧、革兰氏阳性、革兰氏阴性、真菌和病毒都具有抗菌效果，在医疗和其他产品中的应用在逐渐增加。而纳米银由于其纳米尺寸获得了更大的比表面积，增加了与细菌接触面积或者吸收光子的能力从而增加了抗菌活性。但是单独的纳米银很容易团聚，从而降低抗菌活性，而过量的纳米银又对细胞具有一定的毒性。但是通过与氧化石墨烯的结合可以很好的解决其分散性问题，同时氧化石墨烯可以促进纳米银的光催化性能增加材料的抗菌活性。

氧化石墨烯作为石墨烯的衍生材料具有高的机械强度、大的表面积和优良的生物相容性已被广泛应用于生物医学，如支架基质、药物或基因传递载体等。特别的是具有很好的导电性，在于纳米银结合后，能够快速将纳米银产生的电子转移到氧化石墨烯表面产生活性氧。同时还可以提高干细胞的增殖和分化，具有较小的细胞毒性低。而且氧化石墨烯具有许多含氧活性官能团，可以很容易地与其他材料结合，进一步促进其生物相容性或者连接其他抗菌药物用于抗菌，另一方面也可作为一种纽带将各种功能材料连接到钛植入体上，从而改善其性能。

胶原蛋白主要存在高阶动物特别是在皮肤，肌腱和骨中，具有优良的生物相容性、可促进细胞粘附、影响细胞形状和增强，以及骨生成。但是胶原蛋白的机械性能低且降解速度快。同样的通过与氧化石墨稀的相互作用可以改善这些缺点，从而获得更加优异的功效。以氧化石墨烯为基础三者协调作用可以制备出一种基于氧化石墨烯的杂化生物功能涂层。

技术实现要素：

本发明提供了一种胶原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/纳米银涂层制备方法，所述方法将氧化石墨烯，纳米银和胶原蛋白三者有机地结合起来，通过氧化石墨烯使纳米银以几纳米的尺寸均匀负载在氧化石墨烯片上，并且改善胶原蛋白易降解的缺陷。所述方法制备出既具有抗菌活性，又具有良好生物相容性的杂化涂层材料，通过可见光照着杂化涂层产生活性氧，从而杀灭细菌。

本发明的技术方案为：

一种胶原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/纳米银涂层制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤一，在氧化石墨烯表面负载纳米银

制备氧化石墨烯/硝酸银溶液，所述氧化石墨烯/硝酸银溶液中氧化石墨烯的浓度为0.8-1.2mg/ml，所述硝酸银的浓度为0.006-0.010mol/l，将制备好的氧化石墨烯/硝酸银溶液真空室温放置1-3天，然后在持续搅拌下用275nm的紫外光照射0.8-1.2小时原位还原得到表面负载有纳米银的氧化石墨烯；

步骤二，碱热处理钛片

将钛片用砂纸逐级表面打磨后，依次在丙酮、蒸馏水、酒精中超声清洗，再将所述钛片放入化学刻蚀液中进行刻蚀，随后将钛片放入盛有浓度为3.5-4.5mol/l的koh溶液的反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在75-85℃下反应80-100分钟，取出钛片洗涤干燥；

步骤三，钛片的氨基化

将步骤二制得的钛片浸入硅烷偶联剂甲苯溶液中，70-90℃下回流10-14小时，钛片取出后用乙醇洗涤干燥；

或将步骤二制得的钛片在黑暗条件下浸入含有盐酸多巴胺的缓冲溶液中放置22-26小时，取出钛片洗涤干燥；

步骤四，在钛片表面负载氧化石墨烯/纳米银复合材料

将步骤三制得的钛片浸入步骤一制得的负载了纳米银的氧化石墨烯溶液中，真空室温放置20-24小时，取出钛片洗涤干燥；

步骤五，在钛片表面覆盖一层胶原蛋白薄膜

将胶原蛋白溶于体积浓度为1.5-2.5％的乙酸溶液中制成浓度为1-2mg/ml的胶原蛋白溶液，随后将步骤四制得的钛片浸入所述胶原蛋白溶液22-26小时，所述钛片上即制得胶原蛋白包裹的氧化石墨烯/纳米银涂层。

步骤二中所述的化学刻蚀液为h2o2和浓h2so4的混合溶液，所述混合溶液中h2o2和浓h2so4的体积比为1:3,；所述h2o2的体积浓度为30％，所述浓h2so4的质量浓度为98％。

或步骤二中所述的化学刻蚀液为hf、hno3和纯水的配比溶液，所述配比溶液中hf、hno3和纯水的体积比为1:4:5；所述hf的质量浓度为40％，所述hno3的浓度为1mol/l。

所述刻蚀的时间为20-40分钟。

或所述刻蚀的时间为1-3分钟。

步骤三所述的硅烷偶联剂为kh550、kh560或kh570中的一种。

步骤三所述的硅烷偶联剂甲苯溶液中硅烷偶联剂的体积浓度为2-4％。

步骤三中所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲液，所述tris-hcl缓冲液的ph值为8-9。

步骤三中所述含有盐酸多巴胺的缓冲溶液中，盐酸多巴胺的浓度为1-3mg/ml。

本发明所述的一种胶原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/纳米银涂层制备方法，相比较现有技术，具有如下优点：

(1)通过静电吸附使氧化石墨烯和银离子结合，再原位还原纳米银粒子，可以使纳米银以极小的尺寸均匀的分散在氧化石墨烯表面，此法投入设备投入少，实施难度小，制备方法简单易行，并且对环境并无太大影响；

(2)以氧化石墨烯为基础可以使氧化石墨烯、胶原蛋白和纳米银三者有机地结合起来，并且通过三者的协调作用可改善其各自的缺点，使其具有更加优异的生物功能；

(3)本发明技术制备的杂化涂层具有很好的光动力抗菌活性，既在可见光照射下能快速高效的产生活性氧，从而杀灭细菌。

附图说明

图1为实施例1中各步骤样品的sem图；

图中，a：钛片经过件热处理后的图片；b：样品用硅烷偶联剂氨基化的图；c：样品接枝氧化石墨烯/纳米银后的样品图；d：样品包裹胶原蛋白后的图。

图2为实施例1中样品的接触角图；

图3为实施例1中杀死的细菌sem图；

图4为实施例2中钛片表面的细胞荧光图；

图5为实施例3中接枝氧化石墨稀后拉曼图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

本发明实施例中所用的硅烷偶联剂为kh550，kh550在甲苯溶液中的体积浓度为3％；所用h2o2的体积浓度为30％；所用h2so4的质量浓度为98％；hf的质量浓度为40％；所用hno3的浓度为1mol/l。

实施例1：

(1)将氧化石墨烯超声分散成1mg/ml的溶液，取50ml加入0.0679g硝酸银，搅拌30分钟，黑暗条件下真空放置2天。最后将溶液在持续搅拌条件下，用275nm紫外光照射溶液1小时，备用。

(2)将医用钛片分别用规格为240#、400#、600#、800#、1200#的砂纸在抛光研磨机上打磨至光滑镜面，而后用1:3的h2o2:h2so4(浓)的混合溶液化学刻蚀30分钟。

(3)随后放入盛有4mol/l的koh溶液的反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在80℃下反应90分钟，最后取出洗涤干燥。

(4)将上述处理后的钛片浸入3％的硅烷偶联剂甲苯溶液中，80℃下回流12小时，取出用乙醇洗涤干燥。再浸入上述制备好的氧化石墨烯/纳米银溶液中真空放置24小时。取出洗涤干燥。

(5)将胶原蛋白溶于2％的乙酸溶液中制成浓度为1.5mg/ml的胶原蛋白溶液，随后将接枝了氧化石墨烯/纳米银的钛片浸入其中24小时，制的胶原蛋白包裹的氧化石墨烯/纳米银杂化涂层。

实施例1的实验效果从图1可以看出，图a：钛片经过件热处理后的图片，增加钛片的比表面积，同时在金属表面引入大量羟基有利于氨基化，从而增加接枝氧化石墨烯的量；图b：用硅烷偶联剂氨基化的图，氨基化可以在钛片表面引入氨基，通过与氧化石墨烯表面的含氧官能团反应接枝氧化石墨烯；图c：接枝氧化石墨烯/纳米银后的样品图。纳米银具有优异的物理抗菌能力，同时也具有光动力抗菌；氧化石墨烯有助于纳米银的均匀分布，避免团聚使抗菌性能下降细胞毒性增加。同时其优异的电子转移能力可以很大程度上增强光动力抗菌的能力；图d：包裹胶原蛋白后的图，胶原蛋白有利于增加生物活性。

实施例2：

(1)制备浓度分别为1.2mg/l和0.01mol/l的氧化石墨烯/硝酸银溶液，将制备好的氧化石墨烯/硝酸银溶液真空放置1天，此后在持续搅拌下用紫外光照射还原获得均匀负载纳米银的氧化石墨烯复合材料；

(2)将直径6mm、厚度2.5mm的钛金属圆片用砂纸逐级表面打磨后，依次在丙酮、蒸馏水、酒精中超声清洗，而后用1:3的h2o2:h2so4(浓)的混合溶液化学刻蚀30分钟

(3)将上述钛片放入盛有浓度为4mol/l的koh溶液的反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在85℃下反应80分钟，取出洗涤干燥；

(4)将上述处理后的钛片在黑暗条件下浸入5％的硅烷偶联剂甲苯溶液中，90℃下回流8小时，取出用乙醇洗涤干燥。再浸入上述制备好的氧化石墨烯/纳米银溶液中真空放置24小时。取出洗涤干燥。

(5)将胶原蛋白溶于2％的乙酸溶液中制成浓度为1mg/ml的胶原蛋白溶液，随后将接枝了氧化石墨烯/纳米银的钛片浸入其中24小时，制的胶原蛋白包裹的氧化石墨烯/纳米银杂化涂层。

实施例3：

(1)制备浓度分别为1mg/l和0.008mol/l的氧化石墨烯/硝酸银溶液，将制备好的氧化石墨烯/硝酸银溶液真空放置2天，此后在持续搅拌下用紫外光照射还原获得均匀负载纳米银的氧化石墨烯复合材料。

(2)将钛片分别用规格为240#、400#、600#、800#、1200#的砂纸在抛光研磨机上打磨至光滑镜面，而后用1:4:5的hf:1mol/lhno3:h2o的混合溶液化学刻蚀2分钟，随后放入盛有浓度为4mol/l的koh溶液的反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在80℃下反应90分钟，取出洗涤干燥；

(3)将上述处理后的钛片在黑暗条件下浸入含有2mg/ml的盐酸多巴胺的tris-hcl(ph＝8.5)缓冲溶液中，放置24小时，取出洗涤干燥。再浸入上述制备好的氧化石墨烯/纳米银复合材料中24小时。取出洗涤干燥。

(4)胶原蛋白溶于2％的乙酸溶液中制成浓度为1.5mg/ml的胶原蛋白溶液，随后将接枝了氧化石墨烯/纳米银的钛片浸入其中24小时，制的胶原蛋白包裹的氧化石墨烯/纳米银杂化涂层。

对制备后的产品作相应的检测，其检测结果如下：1)吸附在氧化石墨细胞膜上的银离子在原位还原后以几纳米的尺寸均匀的附在氧化石墨烯片上，碱热处理后的钛片表面形成纳米网状结构，在氨基化后网孔被部分覆盖，在接上氧化石墨烯纳米银后被完全覆盖；2)改性后的钛片在可见光的照射下能够在短时间里有效的杀死细菌，而在黑暗条件下短时间没有抗菌能力，但是对细胞影响不大；3)提高硝酸银的量，在可见光的照射下其抗菌性能几乎不变，但生物活性下降，而缩短与氧化石墨烯混合时间后其抗菌能力和生物相容性基本不变；增加胶原蛋白后的样品其抗菌效果有所下降，但生物活性得到提高；4)接枝硅烷偶联剂比接枝多巴胺分散更均匀，有利于氧化石墨烯均匀接枝在钛片表面，而硅烷偶联剂的浓度过高，时间过长不利于接枝氧化石墨烯。

当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。