一种沙棘黄酮的提取方法及其抗氧化作用与流程

本发明涉及一种沙棘中提取黄酮的方法，具体涉及一种乙醇热回流提取黄酮和含量测定的方法，属于有机化学和分析化学
技术领域：
。
背景技术：
：沙棘又名醋柳、黄酸刺、酸刺柳、黑刺和酸刺等，属胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木。其耐旱，抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持，具有很高的生态价值。沙棘果实中维生素c含量高，素有维生素c之王的美称。沙棘为药食同源植物，其根、茎、叶、花和果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。中华亚种长白山27号沙棘，是经过不断选育后培育的新型沙棘果，种植地为吉林省蛟河市，其地处吉林省东部长白山区，野生资源十分丰富，沙棘果等中草药原料可加工成为长白山系列保健品，目前有关中华亚种长白山27号沙棘的研究较少，该研究成果将为新品种沙棘的开发提供一定的科学依据。目前，大量的研究都是基于以前品种的沙棘，药理活性，抗氧化活性研究较多，对于新型沙棘的研究未见报道。由于合成抗氧化剂存在潜在的副作用，近几年，人们普遍关注生理功能和毒性的氧自由基，以及清除自由基抗氧化作用的研究。沙棘果提取物的抗氧化性能的研究报道很少，主要集中在沙棘果粉、叶渣中提取黄酮类化合物，通过一定处理后的原材料，抗氧化活性会有所下降。回流提取法提取黄酮由于没有使用腐蚀性、易燃易爆物品，所以相比较其他方法安全，无污染，易掌握且设备要求低，可以大量提取，适合工业化生产。本发明的提取优化和含量测定方法比一般提取法生物活性好，提取率较高。技术实现要素：本发明涉及沙棘黄酮的制备方法及抗氧化活性，其特征在于经过以下几个步骤：步骤1：取适量的沙棘鲜果去除梗，然后用水洗去杂质，将其研碎，再将研碎的沙棘鲜果倒入大烧杯中，加8倍石油醚进行脱脂，一般脱脂时间为12~16h，重复脱脂两次。处理后的沙棘备用；步骤2：每次称取沙棘果汁和果渣用乙醇进行回流提取，用50-95%的乙醇，料液比1:10-1:70，在50-85℃温度下回流，提取1-3次，每次提取时间为2h，进行单因素实验选取最佳工艺条件；步骤3：称取沙棘果，在最佳工艺条件90%乙醇，料液比1:60，温度80℃，提取次数3次，以沙棘粗黄酮的提取率为响应值，采用响应面分析法，对沙棘粗黄酮乙醇热回流提取工艺参数进行优化，利用实验设计软件design-expert,根据box-behnkendesign，设计得到的四因素三水平的响应面分析实验方案；步骤4：芦丁绘制标准曲线，用亚硝酸钠法；步骤5：建立同时测定沙棘黄酮中芦丁、芹菜素和木樨草素三种成分含量的hplc方法。采用kromasilc18（4.6mm×250mm，μm)色谱柱为固定相，甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测长为323nm，柱温25℃。结果显示，该方法提取的沙棘粗黄酮中含有芦丁、芹菜素和木樨草素，其中木樨草素含量最多；步骤6：沙棘黄酮的清除dpph、还原力、清除羟基自由基、abts清除力的实验。表明沙棘黄酮具有很好的抗氧化活性。根据权利要求1的所述的工艺，所述原料为中华亚种长白山27号沙棘，是经过不断选育后培育的新型沙棘果；根据步骤2的所述工艺，所述响应面优化与单因素法相比，提取率从2.02%提高到2.67%，比普通单因素提取率高0.5~5倍；根据步骤5所述的工艺，沙棘黄酮的清除羟基自由基力高于vc，并且还原力和对dpph均有很强的清除力。附图说明图1是单因素条件下沙棘黄酮的液料比与提取率的关系图；图2是单因素条件下沙棘黄酮的提取次数与提取率的关系图；图3是单因素条件下沙棘黄酮的乙醇浓度与提取率的关系图；图4是单因素条件下沙棘黄酮的温度与提取率的关系图；图5是沙棘黄酮提取液在相同条件下的液相色谱图；图6是木樨草素在相同条件下的液相色谱图；图7是芦丁在相同条件下的液相色谱图；图8是芹菜素在相同条件下的液相色谱图。具体实施方式以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。步骤1：取适量的沙棘鲜果去除梗，然后用水洗去杂质，将其研碎，再将研碎的沙棘鲜果倒入大烧杯中，加8倍石油醚进行脱脂，一般脱脂时间为12~16h，重复脱脂两次。处理后的沙棘备用；步骤2：每次称取沙棘果汁和果渣用乙醇进行回流提取，用50-95%的乙醇，料液比1:10-1:70，在50-85℃温度下回流，提取1-3次，每次提取时间为2h，进行单因素实验选取最佳工艺条件。如说明书附图1、2、3、4。步骤3：根据单因素实验结果，最终确定在提取次数3次、提取温度80℃、乙醇浓度90%、液料比1:60（g:ml）的条件下，沙棘粗黄酮提取效果最好，此时的提取率最大。响应面试验中选取提取次数a、提取温度b、乙醇浓度c、液料比d四个因素作为自变量，以沙棘粗黄酮的提取率为响应值，采用响应面分析法，对沙棘粗黄酮热回流提取工艺参数进行优化；实验因素水平见下表：表1实验因素与水平利用实验设计软件design-expert,根据box-behnkendesign，设计得到的四因素三水平的响应面分析实验方案及结果见下表：表2响应面分析实验方案及结果使用design-expert8.0.5软件bb设计，定义提取率为y，经多元回归拟合，得出沙棘粗黄酮提取率的预测值对a、b、c、d编码值的二次回归模型方程y=2.5-0.099a-4.235*10-3b+0.088c+0.14d-0.061ab+0.064ac-0.15ad+0.15bc-0.077bd+0.087cd-0.039a2-0.24b2-0.23c2-0.47d2(-1≤a≤1，-1≤b≤1，-1≤c≤1，-1≤d≤1)；回归模型方差分析结果见下表：表3回归模型方差分析结果注：*代表显著；**代表极显著；由表中的方差分析结果可见，实验因子与响应值间存在的不是简单的线性关系。整体模型的p=0.0016<0.05，表明该二次模型具有显著性。二次项因子中a、b、c、d显著，而一次项因子d显著，交互项不显著。根据模型的确定系数r2=0.8435可知，模型的可靠性较好，可以用来解释84.35%的数据。失拟项p=0.1261>0.05，表明该模型失拟检验不显著，说明模型与实际实验拟合较好。所以，从以上数据来看，该模型适用于沙棘果粗黄酮的提取结果的分析和预测。步骤4：绘制标准曲线。取沙棘芦丁标准品0.0020g溶入乙醇，定容到50ml容量瓶。分别加入5%亚硝酸钠1ml，静止6min后加入10%硝酸铝1ml，静止6min后加10%氢氧化钠10ml，静止15min，通过全波长扫描确定最大波长392nm处测吸光度，标准曲线方程为y=0.4487x-0.0183，r2=0.9992；步骤5：建立同时测定沙棘黄酮中芦丁、芹菜素和木樨草素三种成分含量的hplc方法。采用kromasilc18（4.6mm×250mm，μm)色谱柱为固定相，甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测长为323nm，柱温25℃。结果显示，该方法提取的沙棘粗黄酮中含有芦丁、芹菜素和木樨草素，其中木樨草素含量最多；表4梯度系统程序时间（min）流动相a（%）流动相b（%）0~15495115~2549→5951→4125~3059→6941→3130~4069→4931→5140~454951如说明书附图5、6、7、8。步骤6：沙棘黄酮的清除dpph、还原力、清除羟基自由基、abts清除力的实验。表明沙棘黄酮具有很好的抗氧化活性。总还原力的测定：依次在10ml试管中加入系列浓度（0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml）的沙棘黄酮样品溶液1.0ml，磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l，ph=6.6）2.5ml和1%铁氰化钾2.5ml，置于50℃水浴中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸（tca）2.5ml，混匀后以3000r/min离心10min，取上清液2.5ml，加入0.1%三氯化铁溶液0.5ml和2.5ml的蒸馏水，摇匀后在700nm处测定吸光值，每个浓度三个平行，取平均值。实验数据如下表：表5总还原力浓度（mg/ml）沙棘黄酮vc0.028.4%10.4%0.0413.1%23.8%0.0621.8%38.2%0.0826.1%45.3%0.1034.9%59.0%羟基自由基的测定：取0.75mmol/l邻二氮菲1ml于试管中，依次加入pbs（ph7.40）2ml，蒸馏水1ml，充分混匀后，加入0.75mmol/l硫酸亚铁1ml，混匀，加质量分数为0.12%的h2o21ml，37℃水浴60min，于536nm处测定其吸光度ap值；用蒸馏水代替h2o2，测定其吸光度ab值；取0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml不同质量浓度的沙棘黄酮溶液溶液代替蒸馏水1ml，测定其吸光度as值。计算样品对羟自由基的清除率：清除率（%）=（as－ap）/（ab－ap）×100实验数据如下表：表6清除羟基自由基浓度（mg/ml）沙棘黄酮vc0.0296.92%93.83%0.0499.29%94.37%0.06109.85%98.10%0.08110.22%98.38%0.10111.13%99.65%dpph清除力的测定取0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml不同质量浓度的沙棘黄酮溶液2ml，加入等体积的浓度为0.1mmol/l的dpph溶液（用无水乙醇配制），混匀后在室温下避光反应30min，在517nm下测定吸光度；并以4ml无水乙醇和蒸馏水（二者分别为2ml）作为空白调零。空白对照组为2ml样品液加上2ml无水乙醇，其在517nm处的吸光值为，设置空白对照组目的是为了去除黄酮样品本身的吸光值。模型对照组为2mldpph溶液加上2ml无水乙醇，其在517nm处的吸光值为。平行测定3次取平均值；公式：清除率（%）=[1-（ai－aj）/ao]×100实验数据如下表：表7dpph清除力浓度（mg/ml）沙棘黄酮vc0.0210.41%42.89%0.0414.77%51.78%0.0628.38%59.16%0.0850.18%77.13%0.1059.34%89.91%由表可知，随者沙棘黄酮提取物浓度的增加,清除白由基能力呈逐渐上升趋势。由表可知，沙棘黄酮提取物具有较强的抗氧化能力，能明显地清除dpph、abts自由基。通过对沙棘黄酮提取物的抗氧化活性的研究，为其在食品、药品等领域开发新的天然抗氧化剂提供了参考。当前第1页12