一种骨组织工程用多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法与流程

本发明涉及一种骨组织工程用多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，属于生物医用人工骨移植材料技术运用领域。

背景技术：

组织工程作为一门近年来兴起的多学科交叉的新兴学科，成为生命科学发展史上的一个新的里程碑，标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代，它将带动和促进相关高技术领域的交叉、渗透和发展，并由此演化出新的高技术产业。就目前而言，制备出完全符合条件的理想支架是组织工程学发展的重要方向之一，而理性的骨组织工程支架材料必须满足以下几条基本要求：（1）良好的细胞相容性，不仅要求该支架材料本身无细胞毒性，同时，其降解产物对人体和细胞也无毒性，在体内讲解过程中午免疫排斥反应。（2）具有适宜的孔洞结构和孔隙尺寸，有利于细胞的粘附与增殖，以及体液的循环进而为材料内部细胞提供足够的养分。（3）具有与宿主骨组织相匹配的机械性能，在植入初期为骨重建提供力学支撑。（4）具有良好的生物可降解性，理想支架的降解速率应与预期骨组织再生速率相匹配，且植入材料在完成其作为新骨生长支架的承重作用后能慢慢的被人体吸收。生物活性陶瓷作为一种骨组织工程材料，它已经是目前骨组织工程材料研究的重点。

目前最常用骨组织工程支架材料双相磷酸钙是不同比例的β-tcp/ha两相复合材料，具有比单一钙磷陶瓷材料更好的可控降解性能和成骨性能，但是双相磷酸钙支架存在一定的缺陷。首先，其降解速率过慢，无法与新生的骨组织生长速率相匹配，就双相磷酸钙中的羟基磷灰石而言，其在溶液中最为稳定，几乎无降解性，而磷酸三改虽然在溶液中具有一定的溶解度，被认为是可降解材料，但其降解速率速率非常慢，一般需要一到两年的时间。虽然，不同的修复部位对材料的降解性能要求也是不同的，比如，颅颌面骨骼修复部位一般需要支架材料在3-6个月的降解，而脊柱融合部位的修复需要支架材料在9-11个月的时间内降解，因此单一双相磷酸钙支架的降解速率无法满足骨组织修复的需要。其次，由双相磷酸钙制备出的支架其抗压强度较低，无法承受负载，不能作为承重材料植入体内。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种骨组织工程用多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，采用激光成型技术与泡沫浸渍工艺制得双相硫酸钙多孔支架，再用硫酸钙灌浆的方法最终制备出多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架，其制备方法简单易操作，原料来源广泛，而且成本低廉，具体包括以下步骤：

（1）按蒸馏水和硅溶胶（分子式为msio2·nh2o，主要成分为二氧化硅）质量比为1:0-1:3的比例将蒸馏水和硅溶胶混合均匀得到溶液a，将双相磷酸钙粉体与粘结剂混合均匀，得到浆料b；

（2）按溶液a和浆料b体积比为2:1-2:7的比例将溶液a加入到浆料b中，搅拌均匀后得到浸渍浆料c；

（3）将具有规则通孔的有机泡沫载体置于浸渍浆料c中，浸渍1-5次，其每次浸渍均在30-60℃的温度中加热1-5min，最后置于40-60℃的烘箱中干燥6-18小时后得到浸渍坯体，浸渍坯体进行热处理后得到双相磷酸钙多孔支架；

（4）将硫酸钙与蒸馏水混合均匀后得硫酸钙溶液；

（5）快速将步骤（3）得到的双相磷酸钙多孔支架放入硫酸钙溶液中，进行灌浆，摇晃并超声震荡5-20s取出支架常温干燥，然后在40-60℃的条件下封口水化18-30h，再开口干燥18-30h，最终得到多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架。

本发明步骤（1）中双相磷酸钙的成分为：β-磷酸三钙占75-85wt%，羟基磷灰石占15-25wt%。

本发明步骤（1）中所述粘结剂为鸡蛋清或者硅胶，其中双相磷酸钙与粘结剂的质量比为1:3-1:7。

本发明步骤（1）中所述粘结剂为魔芋葡甘聚糖或者纤维素，其中双相磷酸钙与它们的质量比为5:1-5:2。

本发明步骤（3）中具有规则通孔的有机泡沫载体采用激光加工成型技术制备，其材质为聚氨酯泡沫，密度为15-50kg/m³，激光成型后其直通孔孔径范围在0.6-2mm之间。

本发明步骤（3）中热处理的条件为：按1-3℃/min的升温速率将温度从室温升到130-160℃，4-6℃/min从130-160℃上升到280-320℃，0.5-2.5℃/min从280-320℃上升到550-650℃，以4-8℃/min上升到800-850℃，然后保温3-6h，最后随炉冷却。

本发明的有益效果：

（1）本发明所述方法通过有机泡沫浸渍法制备出更能满足骨组织工程要求的孔洞结构和孔隙大小，能够提供一个组织生长的三维支架结构，在软骨组织工程领域中具有很大的应用前景。

（2）所得复合多孔支架植入体内后，在体内能够逐步降解为钙磷，产生游离的ca²⁺、po4^3-，为身体带入一定量的活性成分，钙磷沉积可促进骨的生长。

（3）本发明所述多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架和现有的单一的双相磷酸钙支架相比，其在抗压强度和降解速率上有明显的优势。首先，该复合多孔支架因硫酸钙的加入，可以适当的调节其降解速率，弥补单纯的双相磷酸钙支架降解速率过慢的不足。其次，所得复合多孔支架因硫酸钙的加入，其抗压强度由0.01-0.04mpa提升到现在的0.7-1.6mpa，为支架植入初期骨组织的再生和重建提供足够的力学性能。

附图说明

图1是本发明实施例1多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的xrd图；

图2是本发明实施例1和实施例2多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的ftir图；

图3是本发明实施例1多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的sem图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

本实施例所述多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）采用激光加工成型技术制备具有规则通孔的有机泡沫载体，得到有机泡沫载体；

（2）将5g蒸馏水和10g硅溶胶混合均匀，得溶液a；

（3）将5g的含15wt%ha和85wt%β-tcp双相磷酸钙粉体与25g鸡蛋清混合均匀，得到浆料b；

（4）将溶液a按体积比2:5加入到浆料b中，用玻璃棒搅拌均匀得到浸渍浆料c；

（5）将步骤（1）制备的有机泡沫载体置于浸渍浆料中，浸渍2次，其每次浸渍均通过微波加热器在50℃范围内加热2min，最后置于50℃的烘箱干燥12小时，得到浸渍坯体；

（6）将浸渍坯体置于马弗炉中进行热处理，热处理工艺为2℃/min从室温升到150℃，5℃/min从150℃上升到300℃，2℃/min从300℃上升到600℃，以6℃/min上升到830℃，保温4h，最后随炉冷却得到磷酸钙多孔支架。

（7）将20g硫酸钙与40g蒸馏水混合均匀，在磁力搅拌器上搅拌均匀，得硫酸钙溶液；

（8）快速将双相磷酸钙多孔支架放入硫酸钙溶液中，进行灌浆，摇晃并超声震荡15s取出放于称量纸上，常温干燥15min，得到支架；

（9）将支架放入烧杯中，置于烘干箱中，在50℃的条件下封口水化24h，再开口干燥24h，最终得到多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架。

本实施例多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的xrd分析，如图1所示，通过与标准pdf卡片对比分析可知，多孔复合支架的成分为caso4、caso4·2h2o、β-tcp和hap四相，与试验所用物料相同。另外，为进一步了解该支架的成分，对本实施例多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架进行ftir分析，如图2中的1所示，由图可看出3500cm^-1附近的两个吸收峰对应结晶水中o-h的不对称伸缩振峰，1622cm^-1处的峰为水的h-o-h弯曲振动峰，这三个红外吸收峰是二水硫酸钙中结晶水的特征峰；1686cm^-1处的弱窄峰为p-o的伸缩振动峰；1065cm^-1处的弱峰为po4^3-不对称伸缩振动峰；603cm^-1的吸收峰对应po4^3-的弯曲振动峰；1122cm^-1处的宽强吸收峰和671cm^-1处的窄强吸收峰对应so4^2-的吸收振动峰，说明硫酸钙成分的存在。

本实施例制备得到的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的sem图如图3所示，a图为复合支架放大50倍的截面图，b图为中密度复合支架放大1000倍的截面高倍细节图；从该图中可以看出，支架的形貌为棒状硫酸钙和颗粒状双相磷酸钙颗粒相结合，同时，可看出硫酸钙以堵孔的形式贯穿在多孔双相磷酸钙骨架的孔隙间，规则直通孔达到200-400um。

如下表1为用mtt法对实施例1制备得到的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的细胞毒性分析的细胞增殖度（rgr）值，本实验将293t细胞（转染腺病毒e1a基因的人肾上皮细胞）作为实验细胞，依据国家标准（gb/t16886.12-2005），检测细胞在待测材料的培养液中的增殖情况，根据国家标准（gb/t14233.2-2005）从而判定其毒性等级，细胞毒性结果表明，支架浓度在0.05-0.4g/ml时，细胞增殖度均在80-120之间，细胞毒性为0级或1级，证明该支架材料无毒性。

表1双相磷酸钙/硫酸钙复合多孔支架的细胞增殖度

本实施例制备的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的抗压强度达到了1.36mpa，满足软骨组织要求；另外，采取称重法测出其孔隙率为62.3%，证明该支架具有较高的孔隙率。其次，该支架完全降解的周期为7-8个月。

实施例2

本实施例多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）采用激光加工成型技术制备具有规则通孔的有机泡沫载体，得到有机泡沫载体；

（2）将5g的含25wt%ha和75wt%β-tcp双相磷酸钙粉体与15g鸡蛋清混合均匀，得到浆料b；

（3）将10g蒸馏水按体积比2:1加入到浆料b中，用玻璃棒搅拌均匀得到浸渍浆料c；

（5）将步骤（1）制备的有机泡沫载体置于浸渍浆料中，浸渍1次，其每次浸渍均通过微波加热器在30℃范围内加热1min，最后置于40℃的烘箱干燥6小时，得到浸渍坯体；

（6）将浸渍坯体置于马弗炉中进行热处理，热处理工艺为1℃/min从室温升到130℃，4℃/min从130℃上升到280℃，0.5℃/min从280℃上升到550℃，以4℃/min上升到800℃，保温3h，最后随炉冷却得到磷酸钙多孔支架；

（7）将20g硫酸钙与20g蒸馏水混合，在磁力搅拌器上搅拌均匀，得硫酸钙溶液；

（8）快速将双相磷酸钙多孔支架放入硫酸钙溶液中，进行灌浆，摇晃并超声震荡5s取出放于称量纸上，常温干燥15min，得到支架；

（9）将支架放入烧杯中，置于烘干箱中，在40℃的条件下封口水化18h，再开口干燥18h，最终得到多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架。

本实施例制备的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的抗压强度为1.62mpa，达到了软骨的强度要求；采取称重法测出其孔隙率为60.21%，说明该支架具有一定的孔隙率。其次，该支架完全降解的周期为7-8个月。

实施例3

本实施例多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）采用激光加工成型技术制备具有规则通孔的有机泡沫载体，得到有机泡沫载体；

（2）将10g蒸馏水和20g硅溶胶混合均匀，得溶液a；

（3）将5g的含20wt%ha和80wt%β-tcp双相磷酸钙粉体与35g硅溶胶混合均匀，得到浆料b；

（4）将溶液a按体积比2:4加入到浆料b中，用玻璃棒搅拌均匀得到浸渍浆料c；

（5）将步骤（1）制备的有机泡沫载体置于浸渍浆料中，浸渍3次，其每次浸渍均通过微波加热器在50℃范围内加热3min，最后置于50℃的烘箱干燥12h，得到浸渍坯体；

（6）将浸渍坯体置于马弗炉中进行热处理，热处理工艺为2℃/min从室温升到150℃，5℃/min从150℃上升到300℃，2℃/min从300℃上升到600℃，以6℃/min上升到850℃，保温4h，最后随炉冷却得到磷酸钙多孔支架；

（7）将硫酸钙与蒸馏水按质量比为1:2混合，在磁力搅拌器上搅拌均匀，得硫酸钙溶液；

（8）快速将双相磷酸钙多孔支架放入硫酸钙溶液中，进行灌浆，摇晃并超声震荡10s取出放于称量纸上，常温干燥15min，得到支架；

（9）将支架放入烧杯中，置于烘干箱中，在50℃的条件下封口水化24h，再开口干燥24h，最终得到多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架。

本实施例制备的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的抗压强度高达1.03mpa，满足软骨组织要求；采取称重法测出其孔隙率为69.23%，说明该支架具有较高的孔隙率。其次，该支架完全降解的周期为8-9个月。

实施例4

本实施例多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）采用激光加工成型技术制备具有规则通孔的有机泡沫载体，得到有机泡沫载体；

（2）将10g蒸馏水和20g硅溶胶混合均匀，得溶液a；

（3）将5g的含20wt%ha和80wt%β-tcp双相磷酸钙粉体与1g魔芋葡甘聚糖混合均匀，得到浆料b；

（4）将溶液a按体积比2:6加入到浆料b中，用玻璃棒搅拌均匀得到浸渍浆料c；

（5）将步骤（1）制备的有机泡沫载体置于浸渍浆料中，浸渍4次，其每次浸渍均通过微波加热器在60℃范围内加热4min，最后置于60℃的烘箱干燥18小时，得到浸渍坯体；

（6）将浸渍坯体置于马弗炉中进行热处理，热处理工艺为3℃/min从室温升到150℃，5℃/min从150℃上升到310℃，1.5℃/min从310℃上升到620℃，以7℃/min上升到840℃，保温5h，最后随炉冷却得到磷酸钙多孔支架；

（7）将硫酸钙与蒸馏水按质量比为1:3混合，在磁力搅拌器上搅拌均匀，得硫酸钙溶液；

（8）快速将双相磷酸钙多孔支架放入硫酸钙溶液中，进行灌浆，摇晃并超声震荡15s取出放于称量纸上，常温干燥15min，得到支架；

（9）将支架放入烧杯中，置于烘干箱中，在60℃的条件下封口水化30h，再开口干燥30h，最终得到多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架。

本实施例制备的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架抗压强度高达0.87mpa，满足软骨组织要求；采取称重法测出其孔隙率为72.4%，说明该支架具有较高的孔隙率。其次，该支架完全降解的周期为9-10个月。

实施例5

本实施例多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）采用激光加工成型技术制备具有规则通孔的有机泡沫载体，得到有机泡沫载体；

（2）将10g蒸馏水和30g硅溶胶混合均匀，得溶液a；

（3）将5g的含25wt%ha和75wt%β-tcp双相磷酸钙粉体与2g纤维素混合均匀，得到浆料b；

（4）将溶液a按体积比2:7加入到浆料b中，用玻璃棒搅拌均匀得到浸渍浆料c；

（5）将步骤（1）制备的有机泡沫载体置于浸渍浆料中，浸渍5次，其每次浸渍均通过微波加热器在60℃范围内加热5min，最后置于60℃的烘箱干燥18小时，得到浸渍坯体；

（6）将浸渍坯体置于马弗炉中进行热处理，热处理工艺为3℃/min从室温升到160℃，6℃/min从160℃上升到320℃，2.5℃/min从320℃上升到650℃，以8℃/min上升到850℃，保温6h，最后随炉冷却得到磷酸钙多孔支架；

（7）将硫酸钙与蒸馏水按质量比为1:3混合，在磁力搅拌器上搅拌均匀，得硫酸钙溶液；

（8）快速将双相磷酸钙多孔支架放入硫酸钙溶液中，进行灌浆，摇晃并超声震荡20s取出放于称量纸上，常温干燥15min，得到支架；

（9）将支架放入烧杯中，置于烘干箱中，在60℃的条件下封口水化30h，再开口干燥30h，最终得到多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架。

本实施例制备的多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架抗压强度高达0.91mpa，满足软骨组织要求；采取称重法测出其孔隙率为76.9%，说明该支架具有较高的孔隙率。其次，该支架完全降解的周期为10-11个月。

由泡沫浸渍法制备出的单独的双相磷酸钙生物支架，其抗压强度为0.01-0.04mpa，而从实施例1-5可以看出，多孔双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的抗压强度高达0.8-1.6mpa。另外，该复合支架的降解可控性也比单一的双相磷酸钙支架好，单一的双相磷酸钙支架降解周期一般为1-2年，而双相磷酸钙/硫酸钙复合支架的降解周期可以根据硫酸钙与双相磷酸钙的比例进行调控，使得复合支架的降解速率可以调控，根据实施例1-5可知，该复合支架的降解周期可以调控为7-11月。