人参二醇皂苷Rb组分在制备防治疼痛药物中的应用的制作方法
本发明属医药领域，涉及人参二醇皂苷rb组分(后简称rb组分)在制备减轻疼痛，特别是防治各种病因引起的神经病理性疼痛的药物中的应用。
技术背景
躯体感觉神经末梢的感受器(包括温度感受器、机械性刺激感受器、化学感受器等伤害型感受器)分布在皮肤、肌肉、关节、筋膜等，可感受局部有害刺激并向脊髓发送信号，而后此信息被传递给大脑进行进一步的处理，最后产生痛觉。这类疼痛称为损伤性疼痛，包含临床多见的炎症性疼痛。众所周知，急性炎症状态下，外周组织释放的炎症因子刺激躯体感觉神经末梢导致急性炎性疼痛，而组织退化如关节炎和类风湿关节炎则常伴随着慢性炎性疼痛。还有一类给患者带来更大痛苦的疼痛即神经病理性疼痛也称神经痛(neuropathicpain，npp)，是由神经系统(包括外周纤维和中枢神经元)原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛，包括外周神经痛和中枢神经性疼痛(由于脊髓和/或脑的病变或疾病引起)。多种侵犯神经系统疾病(包括自身免疫性疾病、炎症、第二信使系统或离子通道的病理状态)都会引起神经纤维或神经元功能损伤。在临床上，与神经疼痛相关的常见疾病包括带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、神经根型颈椎病、糖尿病外周神经病变，艾滋病、麻风病、截肢、外周神经损伤疼痛、癌症(即癌性疼痛)，神经退化性疾病(多样硬化和帕金森氏病等)以及中风(即脑卒中后中枢性疼痛)(natrevdisprimers.)。神经痛表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征，类型包括针刺样、电击样、烧灼样、撕裂样、刀割样疼痛等，往往伴随有睡眠障碍、焦虑、抑郁等症状，因此严重影响患者生活质量和生理功能的发挥。
慢性疼痛发病率高、危害大，是一个日益严重的全球性健康问题。慢性疼痛包括组织损伤后炎性疼痛(如关节炎)，癌性疼痛，神经病理性疼痛(natrevdrugdiscov.；science.)。目前，慢性疼痛影响到全球30％的成年人(natrevdisprimers.)。我国至少有1亿以上疼痛患者；据2011年一个医学研究所的报道，三个美国人中就有一个受到慢性疼痛的折磨，这个比例要高于受到心脏病、癌症和糖尿病的总和；在欧洲，慢性疼痛的发生率为25-30％(bmj.)。据估计，在澳大利亚和新西兰，慢性疼痛影响到400万人。而其中神经病理性疼痛影响总人口的7％-10％，占到了各类慢性疼痛的30％以上。据统计，在德国40％的慢性疼痛患者至少经历神经病理性疼痛的一些特性(如烧灼感、麻木和刺痛感)。估计中国约有1600万神经病理性疼痛患者。腰椎和颈椎神经根疼痛可能是慢性神经病理性疼痛的最常见的原因。(natrevdisprimers.)
而神经病理学疼痛中，与外周神经痛有关的疾病主要有带状疱疹、糖尿病周围神经病变和癌症化疗引起的外周神经病变(chemotherapy-inducedperipheralneuropathicpain，cipnp)，其他还包括三叉神经痛和坐骨神经痛(natrevdisprimers.)。特别是，化疗药引起的外周神经病变是多种化疗药物的共同而严重的不良反应，可影响到80％的癌症患者。癌症治疗引起的疼痛主要包括放射治疗后疼痛、化学治疗后疼痛、激素治疗后疼痛、免疫治疗后疼痛。常用抗癌药紫杉醇类、顺铂类、长春花属生物碱类、硼替佐米和来那度胺等新上市的化疗药均可引起感受神经元异常和神经痛(natrevneurol.)。外周神经病变已成为肿瘤化疗中最主要的剂量限制因素之一，严重影响了化疗药的疗效和患者的生存质量。激素治疗后的疼痛又叫类固醇性假性风湿病，是指癌症患者在接受糖皮质激素治疗后，全身肌肉、肌腱、关节和骨头出现烧灼样疼痛，特别是肋间肌出现痉挛性疼痛，同时伴全身不适，软弱无力和发热，有时还伴有心理和精神障碍。由于全球人口的老龄化，糖尿病发病率和癌症发病率的增加以及和化疗的结果，外周神经源性疼痛将变得越来越普遍(natrevdisprimers.)。
还要指出的是，慢性疼痛还是许多神经退化性疾病常见的组成部分，影响到20-40％神经系统疾病患者，有些严重的神经病变患者神经痛的发病率提高到60％(natrevdisprimers.)。帕金森氏病(pd)是继老年性痴呆之后的第二大神经退化性疾病，40-60％pg患者被报告出现慢性疼痛(brain.)。多发性硬化(multiplesclerosis，ms)是欧美国家的常见恶性神经退化性疾病，疼痛是其一种常见和致残症状，依据评价方法和定义的不同有29％至86％的患者出现疼痛症状(inflammopharmacology.)。中枢脱髓鞘、神经炎证和轴突损伤导致了ms患者的慢性疼痛，是一种最折磨患者和最难治疗的疼痛类型(inflammopharmacology.；brain..)。神经性疼痛患者常出现睡眠障碍，焦虑和抑郁，神经疼患者的生活质量降低要严重于其它慢性疼痛的患者如类风湿关节炎患者(natrevdisprimers.)。
缺乏有效治疗药物是慢性疼痛特别是神经病理性疼痛高发率的重要原因(bmj.)。阿片类药物(局部麻醉药)和非甾体类抗炎药是治疗伤害性疼痛(或称炎性疼痛)的基石药物，但对神经痛(特别是糖尿病神经痛和癌症治疗性神经痛)效果不佳，其它作为补加药物(包括抗惊厥药和抗抑郁药单胺重摄取抑制剂，如卡马西平、加巴喷丁、普瑞巴林、阿米替林、度洛西汀等)也仅对不到50％患者具有一定的疗效(natrevneurol.；science.；natrevdisprimers.；diabetescare.)。且各类药物都有各自的局限性，如副作用大、具有成瘾性，耐受性差等，临床上仍缺少一种真正有效且使用方便的治疗药物(science.；diabetescare.)。
现有镇痛药对神经痛疗效有限的主要原因是药物不能靶向引起疼痛的病理机制(bmj.natrevdrugdiscov.)。躯体感觉神经系统(包括外周纤维和中枢神经元)原发性损害或病变是神经痛的根本原因。越来越多的研究证明，神经炎症、氧化应激损伤、线粒体功能障碍、神经兴奋性毒性均参与了躯体感觉神经系统的原发性损害和退化性病变(natrevdrugdiscov.；natrevdisprimers.；neuron.)。这些致病因素不是“孤军作战”，而是相互作用，从而形成一个相互放大的恶性循环，最终导致躯体感觉神经系统损害和退化。外周免疫细胞、小胶质细胞(神经系统的巨噬细胞)和星形胶质细胞均参与了这个病理过程(science.)。免疫细胞浸润外周和中枢神经系统并释放炎症介质而激活小胶质细胞和星形胶质细胞，从而启动上述恶性循环(natrevdrugdiscov.)。星形胶质细胞的慢性激活可导致其生理功能的丢失(包括清除胞外兴奋性神经递质谷氨酸、维持细胞还原状态以及为神经提供营养支持)并释放有害于神经的炎症因子和相应的恶性结果包括兴奋性毒性、氧化应激损伤和进一步恶化神经炎症，而小胶质细胞的慢性激活势必将原本的炎症状态推高到一个新的高度，而损伤神经系统。特别是，原发性(如存在糖尿病患者)或继发性(如化疗治疗引起)代谢异常尤其是线粒体功能障碍势必导致氧化应激和能量缺乏，从而引起免疫细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的功能紊乱，从而诱发或加重这些细胞的病理变化。在此还要特别指出的是，这种神经疼痛的多因素交互作用，特别是神经炎症，也参与了慢性炎症性疼痛(bmj.)。综上所述，感觉神经系统病变的多因素交互作用的复杂机制不仅解释了为何现有镇痛药物对神经痛药效不佳的原因，也指示针对治病因素进行系统治疗对防治慢性疼痛的重要性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种人参二醇皂苷rb组分在制备防治疼痛药物中的应用，所述药物以人参二醇皂苷rb组分(rb组分)为唯一活性成分或活性成分之一，所述rb组分包括人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc和rd这五种人参二醇皂苷,可选用这五种成分中的一种或两种及以上成分为活性成分。所述疼痛包括炎症性疼痛和神经痛，所述神经痛包括各种疾病和疾病治疗引起的外周神经痛和中枢神经痛。
当rb组分为药物的活性成分之一时,其它活性成分包括降糖药或抗癌药效确切但具有神经毒副作用的抗癌药。本专业技术人员也可以理解，以rb组分为唯一活性成分的药物制剂在临床使用时也可与降糖药或化疗药联合使用。
本发明使用的rb组分采用zl201210242928.1中提供的方法制备获得。所述人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc和rd五种人参二醇皂苷的总含量占rb组分的50～98％之间，优先≥90％，而rb1、rb2、rb3、rc和rd这五种单体化合物各自的含量分别占rb组分的3～50％之间，优先在≥10～30％之间，但不包括这五种单体化合物的含量同时大于20％的情况。本领域专业人员应该理解，以这五种成分中的一种、两种或多种成分为药效成分制备的药物在治疗疼痛中的应用也在本专利保护范围之内。
人参二醇皂苷结构式为：
人参皂苷rb1(ginsenosiderb1):r＝–d–glucopyranosyl
人参皂苷rb2(ginsenosiderb2):r＝–l–arabinopyranosyl
人参皂苷rb3(ginsenosiderb3):r＝–d–xylopyranosyl
人参皂苷rc(ginsenosiderc):r＝–l–arabinofuranosyl
人参皂苷rd(ginsenosiderd):r＝h。
所述含rb组分的药物是指rb组分或rb组分与所述其它活性成分与药学上可接受的载体组成的各种药物制剂。这些药物制剂对防治炎症性疼痛和神经痛的医药用途受到以下研究发现的支持。
一、rb组分可通过非依赖血糖水平的机制改善糖尿病的代谢紊乱、提高线粒体功能和抗氧化能力，与胰岛素联合药效更好。
糖尿病神经病变是由与糖尿病相关的代谢失衡引起的复杂事件引起的。其中，多元醇通路激活和糖基化终产物以及胰岛素抵抗或胰岛素信号丢失，最终构成了对线粒体功能和基因表达的有害效应以及炎症和氧化应激。
1.rb组分不降低糖尿病动物的血糖水平，但能显著对抗糖尿病相关的多元醇和糖基化代谢通路的激活，而且与低于临床有效剂量的胰岛素联合可进一步加强此作用。多元醇和糖基化代谢通路的激活不仅是糖尿病患者胞内糖水平长期升高的结果，也是糖尿病代谢紊乱的重要标志，并直接参与了包括神经病变在内的多种糖尿病并发症的发生和发展。众所周知，体内过量糖基化产物(age)不仅可以与蛋白质交联，影响蛋白质性能，还可以通过与受体特异结合来改变细胞功能，引发氧化应激和炎症反应，从而导致机体病理变化。因此，体内age的蓄积与糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变、动脉粥样硬化、失眠、阳痿、坏疽、胃轻瘫(胃排空缓慢)等糖尿病并发症息息相关。而多元醇代谢通路的激活大量消耗nadph，从而导致no合成减少和谷胱苷肽含量减少，结果导致血管的血流量下降和大量自由基产生，造成躯体感觉神经系统损伤。另外，由于神经组织内不含果糖激酶，不能利用葡萄糖通过多元醇通路形成的中间代谢产物果糖，其结果造成细胞内大量山梨醇和果糖堆积，细胞内高渗，引起神经细胞肿胀、变性、坏死。综上所述，rb组分可通过血糖非依赖的机制抑制糖基化和多元醇代谢通路，从而可减少糖基化和多元醇通路激活引起的功能分子失活和氧化应激损伤，因此有利于防治糖尿病各种并发症包括神经痛。
2.rb组分可改善糖尿病的能量代谢状态和线粒体的功能，与低剂量胰岛素联合药效更好。糖尿病的代谢紊乱以线粒体功能障碍、高活性氧生成和低水平atp为特征。rb组分能升高糖尿病动物的atp和adp水平至正常水平，低剂量胰岛素(1/2临床剂量)能升高atp但不能显著影响adp水平，而二者联合小鼠atp和adp水平被进一步升高到显著高于正常动物的水平。在线粒体氧化磷酸化过程中，1分子adp获得1个分子磷酸产生atp。因此，这些研究数据证明，rb组分可完全逆转糖尿病线粒体氧化磷酸化和产生atp能力的降低；特别是，rb与低剂量胰岛素联合可将线粒体氧化磷酸化的功能提高到远超过正常水平，这将有利于各种量能依赖性的生理功能的发挥，包括耗能的日常行走活动、心脏活动和耗能极高的中枢神经活性，从而提高糖尿病患者的机体功能和生活质量。
3.更加重要的是，rb组分可治疗糖尿病引起的氧化还原系统相关疾病，极大地提高糖尿病动物的抗氧化能力，而胰岛素无此作用，这就进一步增强了rb组分促进糖尿病动物线粒体氧化磷酸化的药理学意义。
还原型谷胱甘肽(gsh)和将氧化型谷胱甘肽(gssg)还原为gsh的还原型辅酶ⅱ(nadph)是体内最重要的内源性抗氧化损伤物质。在糖尿病患者体内中，多元醇通路激活大量消耗nadph将葡萄糖转化为山梨醇，从而减弱还原gssg的能力，同时出现半胱氨酸和甘氨酸(gsh合成的两个重要底物)水平降低，可见gsh再生和从头合成的减少共同导致了2型糖尿病的gsh低水平。与降低糖尿病动物的山梨醇水平一致，rb组分可升高糖尿病动物的gsh和nadph水平，而且其作用强度不仅是逆转糖尿病的gsh减少，而是提高它们到显著超过正常动物的水平，但不升高gssg和nadp+的水平。这些研究结果说明，rb组分显著增强糖尿病动物的内源性抗氧化的能力。而低剂量胰岛素无此作用。特别要指出的是，rb组分不仅可通过抑制多元醇通路减少nadph地消耗来提高了还原gssg的能力；更重要的是，rb组分可加强糖尿病动物的丝氨酸代谢介导的谷胱甘肽(gsh)的从头生物合成，突出表现在合成通路各环节关键中间产物(包括丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸)水平的升高；rb组分提高nadph加nadp+的水平，说明rb组分也可提高核苷酸的生物合成。
另外，rb通过调控糖代谢的网络的作用提高糖尿病的nadph再生能力。糖代谢活动与nadph的再生密切相关，其中丝氨酸介导的一碳单位代谢不仅关联着核苷酸的合成也关联着nadph的再生，磷酸戊糖旁路中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、苹果酸酶和三羧酸循环中依赖nad的异柠檬酸脱氢酶(idh)和在再生nadph中也均扮演着重要的角色。然而，这些酶活力的降低导致了2型糖尿病nadph再生能力的降低和nadph水平低下，并关联着ros生成、dna断裂、脂质过氧化、线粒体损伤和atp水平显著降低。特别是，idh对糖基化极为敏感，糖基化导致2型糖尿病的idh活力受损特别，是nadph降低的重要原因。rb组分抑制多元醇通路的作用可减少nadph的消耗，抑制糖基化的作用可保护idh及其介导nadph再生活动，加强丝氨酸代谢通路介导的nadph再生。
综上所述，rb组分可从多个关节环节和通路系统调控糖尿病的代谢网络，并能抑制糖尿病的糖基化对代谢网络的损伤，提高线粒体氧化磷化能力和抗氧化能力,从而逆转糖尿病的代谢紊乱。基于代谢紊乱对糖尿病并发症的关键作用，有理由预测rb组分可防治糖尿病的各种并发症包括神经疼痛，从而提高糖尿病患者的工作质量和生活质量。
二、rb组分改善糖尿病的神经功能和“三多、一少”的症状并促进伤口愈合，与低剂量胰岛素联合药效更好。
rb对糖尿病代谢紊乱的纠正作用势必赋予rb组分从根本上防治糖尿病神经病及相关症状的药效特性。rb组分也可显著改善糖尿病的“三多一少”的典型症状并显著促进糖尿病动物的伤口愈合。“三多,一少”即多尿、多饮、多食和体力和体重下降不仅是糖尿病的典型症状，也是糖尿病代谢紊乱的宏观反应。多食反映了身体不能有效地利用葡萄糖，机体试图通过摄取更多的食物获得能量，而体力和体重下降进一步反映能量不足，机体通过增加对脂肪及蛋白质消耗来产生能量。代谢功能紊乱和/或其他病理状态导致了糖尿病患者对损伤组织的修复功能的减弱甚至消失也是导致糖尿病足的主要原因。因此，rb组分改善糖尿病“三多一少”症状和促进糖尿病动物伤口愈合的药效进一步证明其系统改善糖尿病代谢紊乱的作用。
此外，rb组分还可以改善糖尿病动物的运动平衡能力和认知能力。糖尿病患者运动平衡能力的降低既反映了糖尿病外周感觉神经病变，又是糖尿病患者容易跌倒而骨折的重要原因。而糖尿病患者对新生事物失去兴趣以及探索能力和认知能力的降低反映了糖尿病患者中枢神经功能紊乱或减退。因此，rb组分改善糖尿病动物运动平衡能力、探索和认知能力的药效强烈地支持了rb组分防治糖尿病外周和中枢神经病变及相关症状包括神经痛和糖尿病脑病(记忆减退、睡眠障碍和精神行为障碍)的医药用途。
三、rb组分可显著对抗线粒体功能障碍(线粒体抑制剂)诱导的血脑屏障破坏和神经炎证及神经功能障碍。
与其保护糖尿病的线粒体功能一致，rb组分对线粒体呼吸链复合物i的抑制剂鱼藤酮引起的脑血管损伤、外周免疫细胞侵入脑内、胶质细胞激活、星形胶质细胞和神经元损伤具有显著的对抗作用。与此一致，rb可显著对抗鱼藤酮诱导的运动障碍。所述研究结果不仅证明rb可显著保护线粒体功能障碍引起的血脑屏障破坏和神经炎症，而且进一步说明rb对不同治病因素引起的线粒体功能障碍关联的病理变化和疾病症状具有显著的防治作用。所述研究结果不仅进一步支持了rb组分防治外周神经痛的医药用途，也支持了其防治中枢疼痛的医药用途。
四、rb组分显著抑制化疗药诱导的外周神经痛的发生和发展。
前面所述的rb组分靶向疼痛共性病理机制的分子机制预测rb可防治化疗药引起的外周神经痛。的确，rb组分对紫杉醇类引起的小鼠和大鼠外周疼痛模型均有非常显著的对抗作用。而且，rb组分对白血病细胞和实体瘤癌细胞不仅没有保护作用，反而具有细胞毒性。可见，rb组分在防治癌症治疗引起的神经痛的同时并不会减弱化疗药的抗癌药效。所述研究结果强烈地支持了rb组分防治癌症治疗引起的外周神经痛和中枢毒副反应的医药用途。
所述以rb组分为唯一活性成分或活性成分之一的药物制剂包括:口服固体或液体制剂、注射制剂、缓释剂、控释剂、靶向制剂、泡腾剂或以软膏或者乳膏用于局部给药，也可以是例如以栓剂直肠给药，还可以是经鼻腔喷雾制剂。口服制剂包括口服片、含片、咀嚼片、丸剂、滴丸、胶囊、软胶囊、颗粒、口服液、糖浆、乳剂、合剂；针剂包括小针剂、大针剂、粉针剂、乳剂、混悬液。
通常本发明所述的药物成分可以以常规方法使用本技术领域已知的常规赋形剂或者载体制备。
药学上可以接受的固体赋形剂或者载体包括：淀粉、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二醇、碳酸钙、藻酸、微晶纤维素、明胶；药学上可以接受的液体载体包括例如无菌水、聚乙二醇、非离子表面活性剂(如羟丙基纤维素、吐温)、羟丙基-β-环糊精和油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄榄油或者液体石蜡；只要适合活性成分的特性和所需要的特定给药方式。在制备所述药物组合物中通常使用的佐剂也可以包括，例如调味剂、色素、防腐剂(如乙基或丙基-羟基苯甲酸酯)和抗氧化剂例如维生素e、维生素c、bht和bha；以上各种情况还包括药学上可接受的高分子材料。
片剂可以不包衣或者包衣以改变它们的崩解和随后活性成分在胃肠道内的吸收或者增强它们的稳定性和/或外观，在所述后两种情况下可以使用本技术领域已知的常规包衣剂和方法。
用于口服的药物组合物还可以是硬胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体赋形剂例如碳酸钙、磷酸钙、微晶纤维、高岭土或者包裹介质，或是软胶囊的形式，其中活性成分与水或者油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄榄油、液体石蜡混合或者药学上可接受的高分子材料。
适于注射的药物组合物形式包括无菌水溶液、分散液或者无菌粉(用于临时制备无菌注射液或者分散液)。载体可以是溶剂或者分散介质或者包裹介质，例如水、醇、它们的适当混合物和植物油以及药学上可接受的高分子材料。
本发明的要点及产生的有益效果在于：
代谢紊乱特别是线粒体功能失常、氧化应激损伤、神经炎症及其相互作用是各种病因引起的神经痛的共同病理机制，也参与了慢性炎性疼痛。为此，本发明提供了一种可针对此共性病理机的新型防治疼痛的药物，即以rb组分为活性成分或活性成分之一的药物制剂。
本发明提供的一组新型防治疼痛得药物，不仅可以更好的治疗疼痛，而且可填补全球预防疼痛无药可用的空白。至今全球缺乏有效控制慢性疼痛特别是神经痛的药物，也没有预防疼痛的药物。由于现有治疗疼痛的药物是以控制疼痛症状为目的，而且具有显著毒副作用，因此不能用于预防疼痛的发生，这就使无数的糖尿病患者和接受化疗的癌症患者无法避免神经病变和神经痛的结局。所述rb组分为活性成分的药物制剂不仅可为临床提供一种系统治疗疼痛病理机制的全新类型的治疗疼痛的药物，而且可填补国内外无预防神经痛药物的空白，因此将为防治糖尿病神经痛和化疗药引起的神经痛做出重要贡献。再者，rb组分对代谢网络的调控以及维持稳态的作用可与降糖药控制血糖水平的作用形成协同作用，从而能更加全面、系统地治疗糖尿病，这种协同作用可全面提高糖尿病患者的功能状态和生活质量，为全球的糖尿病患者创造新的希望。
附图说明
图1是半剂量胰岛素及其与rb组分合用组能引起糖尿病小鼠短时间内血糖降低。
图2是长期治疗，胰岛素、rb组分单用及其二者联用皆不能降低糖尿病小鼠血糖水平。
图3是rb组分及其与胰岛素联用可降低糖尿病小鼠红细胞多元醇通路关键物质山梨醇和糖基化代谢通路标志物糖化血红蛋白。
图4是rb组分及其与胰岛素联用可升高糖尿病小鼠atp/adp水平。
图5是rb组分及其与胰岛素联用可升高糖尿病小鼠氧化还原系统关键物质谷胱甘肽(gsh)，和其原料物质半胱氨酸(cys)。
图6是rb组分及其与胰岛素联用可升高糖尿病小鼠多元醇代谢关键辅酶nadph水平。
图7是rb组分与胰岛素联用能恢复糖尿病小鼠体重。
图8是rb组分及其与胰岛素联用能降低糖尿病小鼠饮水量。
图9是rb组分及其与胰岛素联用能降低糖尿病小鼠排尿量。
图10是rb组分及其与胰岛素联用可加速糖尿病小鼠创面伤口愈合。
图11是rb组分及其与胰岛素联用可促进糖尿病小鼠创面伤口恢复。
图12是rb组分及其与胰岛素联用可改善糖尿病小鼠平衡能力。
图13是rb组分及其与胰岛素联用可改善糖尿病小鼠认知能力和自主探索能力。
图14是rb组分及其与胰岛素联用可改善糖尿病小鼠好奇心探索能力。
图15是rb组分对抗线粒体损伤引起的星型胶质细胞、小胶质细胞激活和神经细胞损伤。
图16是rb组分对抗鱼藤酮诱导的帕金森大鼠外周免疫细胞入侵脑内。
图17是rb组分防治化疗药引起的神经疼痛(小鼠热敏仪实验)。
图18是rb组分防治化疗药引起的神经疼痛(大鼠热敏仪实验)。
图19是rb组分抑制骨髓瘤细胞生长。
图20是rb组分减轻化药奥沙利铂对神经细胞的毒性。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是，本发明不限于这些实施例。
实施例1rb组分通过非血糖依赖性的调控糖尿病相关的多元醇和糖基化代谢通路治疗糖尿病并发症
方法:用链尿佐菌素(150mg/kg)一次性腹腔注射(i.p.)造成昆明小鼠i型糖尿病模型，并用此模型观测rb组分单独或与胰岛素合用对i型糖尿病动物多饮、多尿和身体消瘦等病理特征的改善作用。将合格的35只小鼠分为正常动物对照组、i型糖尿病模型对照组、胰岛素组(2.5iu/kg)、rb组分(40mg/kg)治疗组，胰岛素和人参皂苷合用组(2.5iu/kg+40mg/kg)治疗组，每组7只。胰岛素每天腹部皮下注射给药一次，rb组分每天灌胃给药一次，合用组在皮下注射胰岛素后半小时灌胃人参皂苷，直至实验结束。对照组灌胃等量生理盐水。每周测定一次血糖。在药物治疗8周后，最后一次给药后24小时，对小鼠眼眶取血后离心，取下层压积红细胞测定山梨醇含量以及糖化血红蛋白含量，以考察糖尿病动物多元醇和糖基化代谢通路的激活情况以及rb组分的作用。以吸光度值(od)表示蛋白糖基化水平。测定结果以正常组为单位“1”进行换算。
结果：stz大剂量注射造模后，模型组动物血糖水平均大于16.7mmol/l，证明造模成功。单次给药后2小时，2.5iu/kg剂量胰岛素及其40mg/kgrb组分合用能快速降低i型糖尿病小鼠血糖水平(***p<0.001vs给药前)，但药效只能短时间维持。长期给药2周后，各给药组动物空腹血糖水平并没有显著改善(p>0.05vs给药前)。(图1-2)
如图3所示，模型组小鼠红细胞内山梨醇蓄积(15.98±0.66mmol/l)，显著高于正常组红细胞山梨醇含量(10.12±2.21mmol/l)(**p<0.01**p<0.01vs正常组)，糖基化血红蛋白水平(35.64±5.73)也显著高于正常动物(16.59±6.56)(**p<0.01vs正常组)。研究数据与糖尿病患者山梨醇通路和糖基化激活现象一致，说明本模型动物很好地模拟了糖尿病的代谢紊乱状态。胰岛素治疗可显著降低山梨醇蓄积以及一定程度改善糖基化血红蛋白水平，rb组分治疗也有同样的药理作用，而且二者联合药效进一步加强，特别是二者联合可将山梨醇水平(9.02±2.77)降到正常动物的水平(++p<0.01vs模型组)。基于多元醇通路和蛋白糖基化激活为糖尿病代谢紊乱状态的典型指标，以上研究结果证明rb组分特别是与胰岛素联合治疗可改善糖尿病代谢紊乱状态，对抗多元醇通路和糖基化代谢通路来治疗糖尿病小鼠并发症，并由此推断rb组分对糖尿病代谢紊乱的全面调控作用。但rb组分对血糖水平既没有急性作用也不存在慢性作用，可见rb组分这种代谢调控治疗不依赖血糖水平的改变，rb潜在的这种作用特点对防治糖尿病并发症具有特殊意义。
为了进一步观测rb组分在治疗糖尿病模型中全面调控代谢紊乱的可能机制，在实施例1的试验体系里增加了实施例2至实施例7的研究内容。
实施例2rb组分可改善糖尿病小鼠的能量代谢状态
方法：线粒体功能紊乱和atp水平降低是糖尿病的共同病理特征，也是进一步引发和加重糖尿病并发症的重要原因。因此，在糖尿病模型中，atp水平既可反映药物对代谢状态的作用结果也可反映防治糖尿病并发症的作用机制。给药8周后，取肌肉组织匀浆，匀浆液采用高效液相-质谱联用方法测定小鼠肌肉能量代谢物质水平。测定结果以正常组为单位“1”进行换算。
结果：如图4所示，糖尿病小鼠能量代谢物质atp水平(0.52±0.32)、adp水平(0.61±0.35)相较正常组动物atp(1±0.41)、adp(1±0.38)呈一定程度下降。胰岛素治疗能显著提高糖尿病动物的atp水平(1.22±0.30)(+p<0.05vs模型组)，不显著影响adp水平，说明胰岛素可提高线粒体氧化磷酸化水平，即促进adp转化为atp。研究结果符合胰岛素的生理功能。有趣的是，rb组分能同时显著上调atp(0.88±0.59)和adp(1.48±0.66)(++p<0.01vs模型组)，而且上调的幅度有超过正常动物的趋势。而胰岛素和rb组分联合治疗进一步升高糖尿病的atp(2.92±0.37)和adp(2.72±0.30)水平至超于正常动物的水平(+++p<0.01vs模型组，***p<0.01vs正常对照组)，说明二者的协同作用。有理由认为，adp水平的升高为线粒体氧化磷酸化提供了更充足的反应底物，也就是说adp和atp水平的同时升高指示着线粒体氧化磷酸化活动和线粒体产能容量的升高。综上所述，rb组分不仅可完全逆转胰岛素缺乏导致的线粒体氧化磷酸化活动受损，而且可增加糖尿病动物线粒粒产能的容量。因此，rb组分不仅可完全逆转糖尿病患者的atp缺乏，从而足以为患者的工作、日常活动和各器官的功能维持和执行提供能量支持，而且可避免能量缺乏诱导的各种病理事件和恶性循环。
实施例3rb组分可增强糖尿病内源性氧化还原的能力，从而可增强对抗内外环境来源的氧化损伤
方法：谷胱甘肽(gsh)和nadph在维持体内氧化还原的动态平衡中扮演着至关重要的角色。给药8周后，取肌肉组织匀浆，匀浆液采用高效液相-质谱联用方法测定小鼠肌肉氧化还原系统关键物质谷胱甘肽(gsh)和氧化型谷胱甘肽(gssg)水平，以及谷胱甘肽前体物质甘氨酸(gly)和半胱氨酸(cys)。同时还测定了nadph和nadp+水平，以了解山梨醇通路激活可能代谢的nadph的大量消耗和机体氧化还原状态以及rb组分的作用。测定结果以正常组为单位“1”进行换算。
结果：如图5所示，与正常动物比较，糖尿病小鼠的gsh水平(0.65±0.43)和合成原料半胱氨酸水平(0.66±0.20)显著降低，而gssg未见明显变化。由此可见，糖尿病小鼠合成gsh的功能被减弱。对于nadph水平(图6)，模型组较正常组有降低趋势(0.83±0.56vs1.00±0.52)，但nadp+水平显著低于正常动物(0.69±0.27vs1.00±0.6352，)，说明糖尿病代谢紊乱状态下可能出现了还原nadp+能力的降低。综上所述研究结果，说明糖尿病动物合成和使用抗氧化物质的能力均受到破坏。，而多元醇通路的激活引起的nadph降低进一步挑战了糖尿病动物的抗氧化能力。rb组分治疗可全面逆转糖尿病动物的这种氧化还原系统功能的障碍，而胰岛素无此作用。对于gsh水平，rb组分治疗动物及其与胰岛素合治疗动物均能显著高于糖尿病动物(+++p<0.01vs模型组)甚至超过正常动物(rb组分组为1.78±0.41，联合治疗组为1.40±0.32)，rb组分治疗及其与胰岛素合治疗还也显著升高cys的水平(+++p<0.01vs模型组)，但各治疗组不影响糖尿病动物的gssg水平。对于nadph及nadp+水平，rb组分治疗动物显著高于糖尿病小鼠的nadph(1.58±0.36)和nadp+(1.09±0.64)的水平，但rb组分与胰岛素联合治疗可进一步显著升高糖尿病动物的nadp+水平((1.88±0.68)到超过正常动物。胰岛素治疗不能升高gsh、nadph和nadp+的水平，但能一定程度增加cys含量。综上所述，rb组分能通过调控gsh从头合成以及nadph引起的gssg还原全面逆转糖尿病引起的抗氧化物质gsh的降低，恢复糖尿病患者的氧化还原系统功能。
实施例4rb组分改善糖尿病小鼠“三多、一少”的症状
方法：“三多,一少”即多尿、多饮、多食和体力和体重下降，不仅是糖尿病的典型症状，也是糖尿病代谢紊乱的宏观反应。我们用此模型观测rb组分单独或与胰岛素合用对i型糖尿病动物多饮、多尿和身体消瘦等病理特征的改善作用。治疗过程中每天记录各组动物体重、饮水情况并拍摄动物饲养垫料的潮湿程度，并每周测定一次小鼠空腹血糖。
结果：如图7-9所示，糖尿病模型动物出现了临床i型糖尿病患者的代谢紊乱的“三多，一少”的典型症状，即多饮多尿，身体消瘦。糖尿病模型组小鼠饮水量和排尿量显著高于正常动物，而体重明显低于正常组。
rb组分和胰岛素单独治疗均降低糖尿病动物的饮水量(++p<0.01vs模型)和排尿量，但对糖尿病的体重丢失未见改善作用，而二者联合治疗则可显著改善各种指标(图7-9)。24小时内，正常动物的垫料基本干燥，而模型组动物垫料80％潮湿。各给药组的动物垫料潮湿度相较于模型组有明显改善，其中胰岛素与rb组分合用组动物的饲料最为干燥(图9)。值得强调的是，各种指标的改善作用随着治疗时间的延长而不断加强，这就说明了这些指标的改善是rb组分和胰岛素联合治疗产生的稳定药效，是一种代谢状态质变的药效反应。可见，研究结果支持了rb组分与胰岛素以及其它降糖药联合防治糖尿病的医药用途。
实施例5rb组分改善糖尿病小鼠损伤修复功能
方法：为了揭示rb组分以及其与降糖药联合治疗对防治糖尿病足的潜在药用价值，利用糖尿病慢性全面创伤模型观测了各组动物的伤口修复情况。在给药治疗5周后，用戊巴比妥钠麻醉动物，而后用电推剪减去较长鼠毛，脱毛膏脱去背部毛发。然后用碘伏消毒背部皮肤,在无菌条件下于背部正中用剪刀造成1.5cm×l.5cm全层皮肤损伤创面，剪至皮下筋膜，创周皮肤酒精消毒后用纱布覆盖。术毕小鼠单笼喂养，自由饮食、饮水，各组动物继续相应药物治疗或处理。分别于造模后(也是伤口治疗后)的第1、3、6、9、12、15天观察伤口愈合情况，统计创伤面积。
结果：如图10所示，随着给药时间延长，给药组动物伤口都在快速愈合中。rb组分、胰岛素单用及其两者联合始终保持一个较高的愈合速率，其中rb组分单用优于胰岛素单用，二者合用组愈合速率最快。到给药第10天，rb组分与胰岛素合用组创口愈合率(78±7.3％)与模型组(53±7.2％)已有显著差异(++p<0.01vs模型)。
在创口愈合后期(给药第14天)，观察小鼠伤口皮肤状态发现正常组与合用组皮肤基本愈合，动物表面毛发已经长出，覆盖伤口，但模型组和胰岛素组仍未完全愈合，呈创口暴露及结痂状态(图11)。说明rb组分可改善糖尿病动物的创口愈合速度和伤口愈合状态。
实施例6rb组分可改善糖尿病动物的平衡能力
方法：为了揭示rb组分以及其与降糖药联治疗对防治糖尿病外周神经病变的潜在药用价值，考察了各组动物的运动平衡能力。在给药治疗8周后，用转棒仪测定各组动物的运动平衡能力。动物为了不从转动的转棒上掉落下来，必需保持合适的运动速度，因此在转棒上动物维持时间越长，就说明动物的运动平衡能力和运动肌肉能力越强。给药后12小时，将动物放置在疲劳仪上，转速设定为15转/分，实验时间设定为2分钟，启动仪器后仪器将匀加速至设定转速。先给予15s的适应时间，并确保小鼠的头部朝向与转棒旋转的方向相反，且四肢均附着在转棒上。从启动仪器时开始计时，当小鼠从转棒上跌落时，仪器自动停止计时并显示小鼠在转棒上运动的时间，实验者记录该时间。
结果：如图12所示，糖尿病模型组动物在转棒上运动时间(27.6±7.3)显著少于正常组小鼠在转棒上运动的时间(99.2±37.1)(**p<0.01vs模型)，说明糖尿病动物的运动平衡能力显著降低。胰岛素单独治疗(19.7±14.1)不能改善i型糖尿病小鼠的运动能力(p>0.05vs模型)，rb组分单独治疗(35.8±25.4)呈现出改善小鼠运动平衡能力的趋势，而二者联合用(44.8±11.7)则能显著改善糖尿病动物的运动平衡能力。(+p<0.05vs模型)
实施例7rb组分可改善糖尿病动物的认知、探索能力
方法：为了进一步揭示rb组分及其与降糖药联合防治糖尿病中枢神经病变的潜在药用价值。在给药8周后，对小鼠进行新奇事物识别测试和洞板实验。
新奇事物识别实验：实验第一部分为适应阶段，两个完全相同的事物(物体1和物体2)放在盒子的相对位置，放入小鼠后让小鼠适应10min。间隔1h后进行第二部分测试阶段，物体1不变(旧事物)，物体2更换为物体3(新事物)，随后再次放入小鼠探索3min。每只小鼠探索完用酒精擦拭物体与盒子，以消除小鼠停留在物体与盒子上的气味。记录小鼠在每个物体上探索的次数，以及小鼠在盒子旷场中的探索运动时间。用新事物优先指数(新事物优先指数＝探索新事物次数/(探索旧事物次数+探索新事物次数))反应小鼠的短时记忆能力；用旷场中探索运动时间反应小鼠自主运动能力。
洞板实验：实验要求光线较昏暗。洞板实验装置为76cm×76cm的正方形木板，木板内设有16个直径为5cm间距相等的的圆形小孔，孔下方为高约5cm的空心黑箱，木板四周围有高50cm的不透明透明玻璃板以隔离外界环境的影响，实验开始时将老鼠置于正中心，同时开始计时，观察者记录3min内小鼠对黑洞进行探索的次数。记录的标准为以小鼠将头探入洞内的次数。
结果：如图13所示，模型组相较于正常组有明显的记忆能力、探索兴趣的降低，这与临床上糖尿病病人认知功能损伤是一致的。胰岛素单用组并不能改善i型糖尿病小鼠记忆认知能力(p>0.05vs模型)，rb组分单用及其与胰岛素合用均能起到一定程度作用，其中合用组最为明显，与模型组动物有显著性差异(+p<0.05vs模型)，且与正常动物相近。说明rb组份与胰岛素合用能提高i性糖尿病小鼠的认知功能。此外在认知新事物的过程中，小鼠在盒子旷场中自主运动也反应了小鼠的运动能力。如图13所示，正常组在旷场内运动时间显著长于模型组小鼠，胰岛素、rb组分单用及其二者合用组小鼠自主运动能力均有所改善，其中rb组分单用及其合用组均与模型组达到显著差异(+p<0.05vs模型，++p<0.01vs模型)。说明rb组分可改善糖尿病动自主运动能力。
如图14所示，正常组小鼠在对黑洞的探索能力上显著高于模型组，在洞板中的活动能力较弱，对黑洞的探索能力也显著不如正常组动物。而rb组分与胰岛素合用组相较于模型组能显著改善i型糖尿病小鼠的自由活动以及探索能力(+++p<0.001vs模型)，rb组分和胰岛素组改善作用不明显，与模型组没有统计学差异(p>0.05vs模型)。说明rb组份与胰岛素合用能提高i性糖尿病小鼠自由探索能力。研究结果说明，rb组分特别是与胰岛素联合用药时，可显著改善糖尿病动物的认知记忆功能、探索能力和运动能力。这也支持了rb组分防治糖尿病引起的脑病，即治疗各种中枢神经病变的医药用途。
实施例8rb组分可对抗线粒体损伤引起的星型胶质细胞、小胶质细胞激活、神经细胞损伤和血脑屏障损伤引起的外周免疫浸润
方法：采用皮下注射线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮诱导大鼠线粒体功能失常的动物模型。由于多巴胺能神经元对线粒体损伤特别敏感，模型动物表出现帕金森氏病的症状，因此模型也被用于帕金森疾病模型。注射时采用低剂量开始，而后每5天递增25％的剂量，而且将一天剂量的一次性给药方式改为平均分配到早晚给一次。具体方法如下：第一个5天造模剂量为0.5mg/kg，第二个5天将剂量增至0.625mg/kg，第3个5天造模剂量为0.75mg/kg，每次给药体积均为0.05ml/100g，早(8：00，am)晚(20：00，pm)各一次。正常对照组每次给予等体积的葵花油。实验中规定，模型动物出现4级及以上行为症状时则停止注射鱼藤酮，若第三个5天后大鼠还有未达到4级行为表现的动物，则按第三个5天的给药剂量继续造模。正常对照组
结果：模型组大鼠脑内出现星型胶质细胞和小胶质细胞胞体增大，轴突变粗变短，说明这两种细胞处于应激激活状态(图15)，从而产生神经炎症。特别是，模型动物的脑内出现大面积的血管破坏，大量外周巨噬细胞通过损伤血管浸润到脑内。与此一致的是，模型动物出现黑质纹状体多巴胺通路的损伤，表现为th染色阳性强度减弱，以及纹状体的pv中间神经元丢失(图16)。人参二醇皂苷组分能显著对抗模型动物出现的各种病理变化，甚至维持在正常状态。研究结果说明，线粒体抑制剂可激活脑内小胶质细胞和星形胶质细胞参与的神经炎症，线粒体抑制剂也可破坏血管导致外周免疫细胞侵袭中枢，从而进一步加重神经炎症并引起神经退化和损伤；rb组分可显著对抗线粒体抑制剂诱导的神经炎症、脑血管损伤和神经损伤。这就支持了rb组分保护线粒体和防治线粒体损伤或功能紊乱引起的相关疾病。
实施例9rb组分对紫杉醇诱导的小鼠神经痛模型的预防作用
方法：本研究采用紫杉醇(2.8mg/kg)隔日(第1,3,5,7天)腹腔注射共4次的方法诱导体重20-24g的icr雌性小鼠外周神经痛模型，并用此模型观测rb组分对化疗药物引起的外周神经痛的预防作用。在众多抗肿瘤药中，天然植物类抗肿瘤药所占的比重最大，在2007年上半年植物类抗肿瘤药中紫杉醇以44.1％的份额占据了市场的第一位，紫杉醇类抗肿瘤药已成为人类抗击恶性肿瘤的一线药品。紫杉醇的剂量限制性毒性主要为神经毒性和骨髓抑制，后者已成功通过应用粒细胞集落刺激因子予以克服，但表现为神经病理性疼痛的神经毒性至今仍然困扰着全世界的临床医生，因为这种化疗所致的疼痛对目前任何临床上所使用的镇痛药物都不敏感，常导致一部分患者被迫减量直至停药，从而严重影响化疗效果甚至使化疗归于失败，部分紫杉醇化疗痛并不会因为停药而迅速终止，常常迁延数月甚至数年，严重影响肿瘤患者的生存质量。可见，紫杉醇引起的外周神经疼痛对癌症治疗后的疼痛具有代表性，用紫杉醇紫引起的疼痛动物模型也具有代表性。
用热板法筛选热敏感反应相对均匀的小鼠进行实验。将合格的21只小鼠分为空白对照组(生理盐水组，ip)、紫杉醇模型组和rb组分(40mg/kg,ig)预防治疗组，每组7只。rb组分每天灌胃给药一次，每逢给紫杉醇那天rb组分预先给药2小时。在紫杉醇停药后继续给rb组分，直到实验结束。
每次于下午2-4点用热板实验(52℃±0.3)测定小鼠后爪的热敏反应。将小鼠双侧后爪置于热板仪的热板上，当动物感觉热刺激引起的疼痛时，动物则会出现舔后爪或缩回后抓，记录舔后爪或缩回后抓潜伏期，潜伏期越短说明痛阈值越低，延长给紫杉醇动物的疼阈值说明对其化疗药诱导的神经疼痛有对抗作用。在结束紫杉醇注射后继续给rb组分并继续测定各组动物的热敏反应。
结果：rb组分对紫杉醇引起的小鼠外周神经疼痛具有显著的抑制作用。如图17所示，在给紫杉醇前，三组动物的后爪回缩潜伏期相当，在给紫杉醇后的第7天、第9天、第11天和第13天，模型组的后爪回缩潜伏期明显短于空白对照组，说明紫杉醇诱导了显著的外周神经疼痛(**p<0.01，***p<0.001)；rb组分组的第7天和以后各时间点的潜伏期均明显长于模型组(**p<0.01，***p<0.001)。以上实验结果支持了rb组分防治癌症治疗后疼痛特别是化疗药引起的外周神经疼痛的临床使用价值。
实施例10rb组分对紫杉醇诱导的大鼠神经痛模型的预防作用
方法：本研究采用紫杉醇(2mg/kg,ip)隔日(第1,3,5,7天)腹腔注射共4次的方法诱导体重300-330g的sd雄性大鼠神经痛模型，并用此模型观测rb组分对此神经痛的预防作用。用热板法对14只大鼠进行热敏感筛选，将合格的12只大鼠分为紫杉醇模型组和rb组分(30mg/kg,ig)预防治疗组，每组6只。人参皂苷每天灌胃给药一次，每逢给紫杉醇那天rb组分预先给药2小时。
每次于下午2-4点用热板实验(52℃±0.3)测定大鼠后爪的热敏反应。将大鼠双侧后爪置于热板仪的热板上，当动物感觉热刺激引起的疼痛时，动物则会缩回后抓，记录从大鼠后爪接触热板到缩回前抓的时间(秒)即热反应潜伏期，潜伏期越短说明痛阈值越低，延长给紫杉醇动物的疼阈值说明对其化疗药诱导的神经疼有对抗作拥。在结束紫杉醇注射后继续给rb组分并继续测定各组动物的热敏反应。
结果：rb组分对紫杉醇引起的大鼠外周神经疼痛具有显著的抑制作用。如图18所示，在给紫杉醇前，两组动物的后爪回缩潜伏期相当，在给紫杉醇后的第六天、第8天、第11天和第15天，模型组的后爪回缩潜伏期明显短于给紫杉醇前，说明紫杉醇诱导了显著的外周神经疼痛(##p<0.01，###p<0.001)；rb组分组的第6天和以后各时间点的潜伏期均明显长于模型组(**p<0.01，***p<0.001)。以上实验结果进一步支持了rb组分防治癌症治疗后疼痛特别是化疗药引起的外周神经疼痛的临床使用价值。
实施例11rb组分抑制骨髓瘤细胞活力
方法：种板12小时的人骨髓瘤细胞株rpmi8226和u266分别在含50,100,200,300,400,500μm的rb组分或地塞米松培养基中培养72小时，同时设不加药对照组(con)。用mtt比色法测定细胞活力并计算ic50。
结果：如图19所示，rb组分能够抑制骨髓瘤细胞活力，而且对肿瘤细胞的抑制作用的药效优于阳性药物地塞米松。研究结果说明，rb组分用于骨髓瘤患者的骨痛或放化疗引起的疼痛时，不仅不会削减抗癌治疗效果，反而本身具有一定的抗癌活性，这就进一步支持了rb组分在防治骨髓瘤相关疼痛的临床使用价值。
实施例12rb组分减轻化药奥沙利铂对神经细胞的毒性
方法：培养24小时的神经细胞株pc-12和sh-sy5y分别在含不同浓度的rb组分、奥沙利铂(oxa)及二者混合培养基中继续培养72小时，同时设不加药对照组(con)，用srb法测定细胞活力。
结果：如图20所示，单用rb组分组对两者的细胞活力无显著影响，单用奥沙利铂组能够显著抑制神经细胞的细胞活力，而rb组分与奥沙利铂联用组细胞活力要高于奥沙利铂单用组(##p<0.01,###p<0.001)。但在人胶质瘤细胞株shg-44中，rb组分与奥沙利铂联用组细胞活力与奥沙利铂单用组无明显差异。研究结果说明，rb组分能够减轻化药奥沙利铂对神经细胞的毒性而不影响化药奥沙利铂对胶质瘤的抑制作用。
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