一种ERK和JNK信号通路抑制剂Mce2E的制作方法

本发明涉及一种erk和jnk信号通路抑制剂mce2e，是一种能同时抑制erk和jnk信号通路的结核分枝杆菌分泌蛋白，属于细胞生物学领域。

背景技术：

结核分枝杆菌是一种兼性胞内致病菌，以巨噬细胞为主要的宿主细胞，并在其中存活和生长。哺乳动物细胞入侵蛋白(mammaliancellentry，mce)mce是由mce基因编码的一组分泌或者膜表面粘附蛋白，已被证明具有促进分枝杆菌入侵宿主细胞的功能。其中mce2操纵子就与分枝杆菌的毒力和肉芽肿形成有关，但是，mce2操纵子编码的mce2e蛋白在炎症和免疫相关信号通路的相关功能尚不清楚。

c-jun氨基末端激酶(c-junn-terminalkinase,jnk)和细胞外信号调节蛋白激酶(erk)p42/p44通路属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,mapks)信号转导通路。因此，erk和jnk信号通路是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。

jnk信号通路在细胞应激中发挥重要作用。目前，jnk的研究与肥胖和胰岛素抵抗有密切关系，具体的分子机制研究也比较清楚。越来越多的证据表明jnk1和jnk2的活化能促进肥胖和胰岛素抵抗的发展，在特定的疾病发展阶段，jnk引起的细胞应激与肥胖和二型糖尿病有关。

erk1/2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通常与细胞生长和增殖有关。分子量分别为44kd和42kd的蛋白，二者之间有90％的同源性。在静止的细胞中，erk通过与各种锚定蛋白(包括mek)的相互作用被固定在细胞质中，当细胞受到刺激，erk1/2通路被激活后，p-erk1/2由于构象的变化脱离锚定蛋白，相关的研究表明，erk1/2信号通路的活性与炎症反应、肝脏疾病、肥胖症和糖尿病等代谢性疾病，尤其是erk信号的激活能够促进肿瘤的发展。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种erk和/或jnk信号通路抑制剂，可以抑制erk1/2和jnk蛋白的磷酸化，并且通过与erk1/2和jnk相互作用使其定位于内质网无法入核，从而抑制了erk和jnk信号通路的活化。

所述抑制剂含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：

(a)seqidno：1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有结合erk1/2活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；

(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物；

或者，含有氨基酸序列包括如seqidno：2所示氨基酸序列的多肽作为活性成分。

本发明要解决的另一个技术问题是提供所述抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建含有编码seqidno.1所示蛋白的基因的重组质粒pgex-6p-1-mce2e，并将质粒转化到大肠杆菌中进行表达；

(2)收集菌体，破碎后离心收取上清液，将上清液流过填充好的glutathione-sepharosebeads中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有谷胱甘肽的洗脱液洗脱蛋白，将收集的洗脱液加入到10kd的蛋白浓缩管中，离心浓缩；

(3)在蛋白浓缩管中加入pbs混匀后离心、分装蛋白，-80℃保存待用。

本发明发现seqidno.1所示蛋白(mce2e)中的关键模序rtlasvalil可与erk和jnk相互作用。进一步研究发现mce2e定位在内质网，并通过与erk和jnk的直接互作将其隔离到内质网，从而阻止erk1/2和jnk蛋白的磷酸化及入核。本发明找到了可以抑制erk和jnk信号通路的seqidno.1所示蛋白及其关键模序。由于erk和jnk信号通路与多种疾病的发生，发展有密切相关，因此抑制这两种信号通路的活化这对于很多疾病都有控制作用。本发明成果将来可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，也可以直接应用于科研领域或指导开发erk1/2和jnk通路的抑制剂。

附图说明

图1：(a)mce2e能抑制erk信号通路；(b)mce2e抑制jnk信号通路；

图2：(a)mce2e与erk2相互作用，阻断erk与上游信号mek1的作用，抑制erk信号通路；(b)mce2e与jnk1相互作用，阻断mce2e与上游信号通路mmk4的作用，抑制jnk信号通路；

图3：mce2e主要通过模序rtlasvalil抑制erk和jnk信号通路；

图4：(a)mce2e将erk隔离到内质网，阻止erk入核；(b)mce2e将jnk隔离到内质网，从而阻止jnk入核；

具体实施方式

实施例1结核分枝杆菌分泌蛋白mce2e

结核分枝杆菌分泌蛋白mce2e，其氨基酸序列如seqidno:1所示。mce2e及其结构类似物可用于erk1/2和jnk活性抑制剂的开发。erk2基因序列如geneid:5594所示，jnk1基因序列如geneid:5602所示。

实施例2mce2e能够抑制erk和jnk通路的活化

(a)采用双荧光报告基因技术检测mce2e对erk1/2通路活化的影响

1)构建含有编码mce2e基因的重组质粒pcdna6a-mce2e；

2)构建含有编码mek1-ed基因的重组质粒pcs2ha-mek1-ed，采用重叠延伸pcr法将mek1蛋白中的218位丝氨酸以及222位丝氨酸分别突变为谷氨酸和天冬氨酸后获得mek1-ed基因片段；

3)采用磷酸钙转染法将重组质粒pcdna6a、pcdna6a-mce2e和检测erk通路活化情况的质粒pgal4-elk(0.6μg)、pgal4-luc(0.6μg)、prl-tk(50ng)(购买自promega公司)以及表达erk1/2通路组成型激活剂的pcs2ha-mek1-ed转染进293t细胞；

4)转染6h后换新鲜培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量仪检测mce2e对erk通路活化的影响。

(b)采用双荧光报告基因技术检测mce2e对jnk通路活化的影响

1)采用磷酸钙转染法将重组质粒pcdna6a、pcdna6a-mce2e和检测jnk通路活化情况的质粒pfa-cjun(0.3μg),pgal4-luc(0.9μg),prl-tk(50ng)(购买自promega公司)以及表达jnk通路组成型激活剂racl61的质粒转染进293t细胞；

2)转染6h后换新鲜培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量仪检测mce2e对jnk通路活化的影响。

(c)实验结果分析

双荧光报告基因实验结果表明elk的活性明显降低，从而揭示erk活化收到抑制，mce2e可以显著抑制由mek1-ed激活的erk通路(见图1a)；ap-1的活性明显降低，从而揭示jnk活化收到抑制，mce2e可以显著抑制racl61激活的jnk通路(见图1b)；因此mce2e是同时抑制erk1/2和jnk信号通路的活化。

实施例3mce2e蛋白能够与erk2和jnk蛋白互作，并抑制erk和jnk的磷酸化

(a)mce2e和erk2相互作用，阻断erk2与mek1相互作用。

1)构建含有erk2(geneid:5594)基因的重组质粒p3xflag-cmv14-erk2和含有mek1(geneid:5604)基因的重组质粒pcdna6a-mek1。

2)用pei转染试剂在两个10cm细胞盘293t细胞中共转p3xflag-cmv14-erk2，分别转染空载pcdna6a，pcdna6a-mce2e转染4-6h后换液；

3)转染24h后，收集细胞，分别将1/20的细胞置冰上用western及ip细胞裂解液(p0013；碧云天)裂解，高速离心收集上清后，用westernblot检测两组细胞中各个质粒的表达情况；

4)当两组细胞中质粒表达正常时，分别将剩余的细胞用相同的方法裂解并收集上清；

5)取20μl小鼠抗flagm2亲和凝胶颗粒(f3165；sigma-aldrich)，用100μl细胞裂解液洗涤后加入上步细胞裂解上清中，在4℃旋转孵育6h使flag标签蛋白能够与亲和凝胶颗粒充分结合；

6)4℃离心收集凝胶颗粒，用细胞裂解液洗涤凝胶颗粒5次(1ml/次)用以除去非特异结合的杂蛋白；

7)用50μl1×sds-page上样缓冲液重悬凝胶颗粒，90℃煮样10min后，用westernblot检测结合在凝胶颗粒上的蛋白。

(b)mce2e和jnk1相互作用，阻断jnk1和map2k4的相互作用。

1)构建含有jnk1(geneid:5602)基因的重组质粒p3xflag-cmv14-jnk1和含有map2k4(geneid:6416)基因的重组质粒pegfp-n1-map2k4；

2)用pei转染试剂在三个10cm细胞盘293t细胞中共转p3xflag-cmv14-jnk1和gfp-map2k4质粒，分别转染空载pcdna6a，pcdna6a-mce2e转染4-6h后换液；

3)转染24h后，收集细胞，分别将1/20的细胞置冰上用western及ip细胞裂解液(p0013；碧云天)裂解，高速离心收集上清后，用westernblot检测两组细胞中各个质粒的表达情况；

4)当两组细胞中质粒表达正常时，分别将剩余的细胞用相同的方法裂解并收集上清；

5)取20μl小鼠抗flagm2亲和凝胶颗粒(f3165；sigma-aldrich)，用100μl细胞裂解液洗涤后加入上步细胞裂解上清中，在4℃旋转孵育6h使flag标签蛋白能够与亲和凝胶颗粒充分结合；

6)4℃离心收集凝胶颗粒，用细胞裂解液洗涤凝胶颗粒5次(1ml/次)用以除去非特异结合的杂蛋白；

7)用50μl1×sds-page上样缓冲液重悬凝胶颗粒，90℃煮样10min后，用westernblot检测结合在凝胶颗粒上的蛋白。

(c)实验结果分析

从图2中可以看出，mce2e和erk2、jnk1存在相互作用，并且抑制erk和jnk的磷酸化。

实施例4mce2e主要通过“rtlasvalil”模序抑制erk及jnk信号通路

(a)采用双荧光报告基因技术检测mce2eaaa对erk1/2通路活化的影响

1)将“rtlasvalil”模序中的关键氨基酸v、l、l分别突变为a、a、a(pcdna6a-mce2eaaa),将非关键氨基酸位点r突变为e作为阴性对照(pcdna6a-mce2er168e)；

2)采用磷酸钙转染法将重组质粒pcdna6a、pcdna6a-mce2e、pcdna6a-mce2eaaa、pcdna6a-mce2er168e和检测erk通路活化情况的质粒pgal4-elk(0.6μg)、pgal4-luc(0.6μg)、prl-tk(50ng)(购买自promega公司)以及表达erk1/2通路组成型激活剂的pcs2ha-mek1-ed转染进293t细胞；

3)转染6h后换新鲜培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量仪检测mce2eaaa对erk通路活化的影响。

(b)采用双荧光报告基因技术检测mce2e对jnk通路活化的影响

1)采用磷酸钙转染法将重组质粒pcdna6a、pcdna6a-mce2e、pcdna6a-mce2eaaa、pcdna6a-mce2er168e和检测jnk通路活化情况的质粒pfa-cjun(0.3μg),pgal4-luc(0.9μg),prl-tk(50ng)(购买自promega公司)以及表达jnk通路组成型激活剂racl61的质粒转染进293t细胞；

2)转染6h后换新鲜培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量仪检测mce2e对jnk通路活化的影响。

(c)实验结果分析

双荧光报告基因实验结果表明mce2eaaa突变体不能抑制erk信号通路的激活，因此mce2e抑制erk通路依赖“rtlasvalil”模序(见图1a)；同样的，mce2eaaa突变体也丧失了对jnk信号通路的抑制作用。因此mce2e主要通过“rtlasvalil”模序抑制erk，jnk信号通路激活。

抑制erk信号通路并不是mce蛋白家族特有的，有文献报道，mce家族的蛋白mce3a就无法抑制erk信号通路。mce2e蛋白，和已经报道的抑制erk信号通路的mce3e蛋白不属于一个操纵子，并且不是同源蛋白，两者序列的相似度只有47.34％。mce3e只抑制erk信号通路，与erk相互作用的是fxfp模序；mce2e除了抑制erk信号通路，对jnk信号通路也有抑制作用，且作用位点是“rtlasvalil”模序。但该模序并不与p38蛋白结合。

实施例5mce2e蛋白与erk1/2和jnk蛋白共定位

(a)mce2e和erk2在细胞中的共定位

1)构建含有erk2基因的重组质粒p3xflag-cmv14-erk2；

2)通过lipofectamine2000(invitrogen,carlsbad,ca)转染法将重组质粒p3xflag-cmv14-erk2和pegfp-n1-mce2e共转染到铺在盖玻片的hela细胞中；

3)转染6h后，更换新鲜去血清的dmem培养基继续培养；

4)24h后用于flag染色的细胞直接固定、透化和封闭；

5)封闭完以后的细胞用flag抗体(cellsignalingtechnology)室温孵育1h；

6)pbs洗涤细胞三遍后用alexa594红色荧光二抗室温孵育1h，之后pbs洗涤细胞三遍并用含有dapi的封片剂封片并用于激光共聚焦显微镜镜检；

(b)mce2e和jnk1在细胞中的共定位

1)构建含有jnk1基因的重组质粒p3xflag-cmv14-jnk1；

2)通过lipofectamine2000(invitrogen,carlsbad,ca)转染法将重组质粒p3xflag-cmv14-jnk1和pegfp-n1-mce2e共转染到铺在盖玻片的hela细胞中；

3)转染6h后，更换新鲜去血清的dmem培养基继续培养；

4)24h后用于jnk1染色的细胞直接固定、透化和封闭；

5)封闭完以后的细胞用flag抗体(cellsignalingtechnology)抗体室温孵育1h；

6)pbs洗涤细胞三遍后用alexa594红色荧光二抗室温孵育1h，之后pbs洗涤细胞三遍并用含有dapi的封片剂封片并用于激光共聚焦显微镜镜检；

(c)实验结果分析：如图4，在非活化的hela细胞中，mce2e和erk2有明显的共定位现象(见图4a)，mce2e和jnk1也有显著的共定位现象(见图4b)。未转染mce2e时，erk2和jnk1蛋白处于弥散状态，过表达mce2e后，mce2e将erk和jnk蛋白共定位在内质网中。以上结果说明mce2e通过空间调控阻止erk和jnk蛋白入核发挥作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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